酸性饮料的保存的制作方法

专利名称：：酸性饮料的保存的制作方法酸性饮料的保存本发明涉及保存酸性饮料抗微生物如酵母、真菌和抗细菌生长和存在的方法。酸性饮料是pH值为1-约4.8的饮料。它们可为天然酸或可为通过加酸化剂酸化的饮料。酸性饮料的实例子包括热包装型饮品(例如含各种类型的果汁和/或蔬菜汁的饮品)和冷罐装(cold-fill)包装型饮品(例如碳酸软饮品)。基于果汁和/或蔬菜汁的饮品尤其容易产生真菌、酵母和细菌的微生物生长。然而，酸性饮料由于使用防腐试剂的可能性有限而难以保存。只有如下可抗酸性环境的试剂适合1.它们不失去抗微生物活性，和/或2.它们及应用它们的饮品保持化学稳定(例如，无蛋白变性或沉淀物形成)，3.它们不降解，从而不产生对产品口味、颜色、气味和/或外观带来负面影响的副产物。这使得例如多种蛋白、氨基酸和酶不适于用作酸性饮料中的防腐试剂。结果，就在大多数情况下，将食品级酸和/或其盐用作所述酸性饮料中的防腐试剂。—例是使用苯甲酸和/或其苯甲酸盐。苯甲酸钠被优选用作食品和饮料的主要抗微生物防腐剂。但对苯甲酸和/或其盐的使用有限制，一般不超过0.1%(对于钠盐)，因为这些成分具有毒性。如果与抗坏血酸、苯甲酸钠和苯甲酸钾组合，可在特定条件下甚至产生可检测水平的苯。山梨酸和/或山梨酸盐也被广泛应用作为酸性食品或饮品的防腐试剂。但这些成分在使用上也有限制当用它们保存食品抗例如青霉属物种生长的霉菌时，山梨酸被所述青霉属物种降解而产生具有煤油臭味的1，3_戊二烯。山梨酸钾的被接受的使用水平可为约200-约3000ppm。一般而言，饮料中所含山梨酸钾水平远高于有效最低量，以保证抗微生物活性。但高于此被接受的使用范围的上限时，山梨酸钾可使果汁饮料产生异味。山梨酸盐和苯甲酸盐是一般用于经历冷罐装包装方法的防腐试剂。它们还常与磷酸盐组合使用。酸性防腐试剂的第三例是丙酸和/或丙酸盐，最初知道它们具有抗由真菌形成的霉，但不抗酵母的抗微生物作用。而且，丙酸及大多数丙酸盐的缺点是由于其非常独特且令人厌恶的气味和口味而在其应用上受到限制。本发明提供保存低PH型饮品的改良方法。本发明具有广泛的抗微生物活性，且可降低或甚至防止真菌和酵母出现，且还具有抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抗细菌活性。本发明还提供保存酸性饮品且保持人消费的安全性和感官特性(包括口味、颜色和/或气味)方面可接受质量的方法。本发明还提供饮品用溶液，其中如前所述的常规防腐试剂造成例如由于沉淀或浑浊出现的问题。其次，通过应用本发明，可将所用正常应用的防腐试剂降至可受其益避其短地使用所述防腐试剂的水平。而且，本发明使得用于灭活食物腐败微生物(如酵母、真菌和特定细菌)的热处理的使用成为多余并因此是可选的。由此可使用简单且更便宜的冷灌装法或冷包装法。对于仍需要热处理的饮料，本发明的应用会防止微生物孢子的生长。含常用防腐试剂(例如苯甲酸盐和山梨酸盐)的经热处理的饮料仍面临此问题，因为虽然可防止一些微生物的孢子形成，但无法防止已存在于饮品中的孢子的生长。至此，本发明涉及保存pH值为1-4.8的酸性饮料抗真菌、酵母和细菌的方法，其中所述保存方法包括应用含多聚赖氨酸和/或其盐及至少一种下列成分的组合物-羟基羧酸和/或其盐的脂肪酸酯，或-甘油的脂肪酸酯。本发明的保存方法包括杀灭、防止和/或抑制微生物的生长和/或存在，所述微生物已存在于饮品中，或者在例如制备、操作和/或储藏饮品的过程中由其他成分或环境来源引入饮品中。已知多聚赖氨酸具有抗真菌、酵母和细菌的抗微生物作用。多数现有技术(如各种文章中所述)提及多聚赖氨酸且尤其是多聚赖氨酸在PH值5-9具有抗微生物活性(Hiraki,J.Antibact.AntifungalAgents,vol.23no.6349-354(1995)禾口Hiraki，Finechemicals,2918-25，2000)。而且，多数现有技术(例如Yamada等人的US2001/033884和Masahiro等人的FR2634627)提及固体食品，而非饮品。如本领域技术人员熟知，饮品对于例如外观、口味、气味和风味具有非常不同的标准和要求。通常应用于食品的许多防腐试剂不能应用于饮品，因为它们会造成例如饮品中出现浑浊或沉淀的问题。饮品类型中还有众多类别，包括例如乳品、基于果汁的饮料、PH中性饮品、酸性和弱酸性饮料、碳酸或非碳酸饮品等。所有这些饮品均有其自身标准和要求。Zheng等人的EP1832182描述了在含酸性果汁的饮料中ε-多聚赖氨酸和热处理组合的应用。生产可稳定存放的含果汁饮料总是需要此热处理，更常为超高温处理(UHT)，以灭活孢子形成细菌的孢子。ΕΡ1832182公开了可在此类饮料中应用ε-多聚赖氨酸，但其抗微生物活性远不足以提供可接受的存放寿命。ε“多聚赖氨酸的应用不足以灭活细菌孢子，更难说首先防止全部这些孢子的存在，因此在生产这些酸性含果汁的饮料中仍需要例如UHT或巴氏消毒法形式的附加处理。已发现，可意想不到地非常好地将多聚赖氨酸和/或其盐与第二防腐试剂组合用于PH值为1-4.8，优选为2-4.6的酸性饮料中，所述第二防腐试剂选自羟基羧酸(或其盐)的脂肪酸酯或甘油的脂肪酸酯或者它们的组合。多聚赖氨酸与羟基羧酸或甘油的脂肪酸酯的组合意想不到地产生了足以降低、抑制或防止酵母、真菌和细菌存在和/或活性的抗微生物活性。以此组合得到了非常有效的抗微生物组合物并非常适合应用于酸性饮料，因其不容易在酸性饮料中沉淀或影响该饮料的外观和感官特性。所得抗微生物活性并非多聚赖氨酸和脂肪酸酯在抗微生物活性中贡献的简单加合，而是显著大于所述加合，因为发现脂肪酸酯与多聚赖氨酸协同作用。这在意料之外，因为只知道所述羟基羧酸的脂肪酸酯(如乳酸酯(盐)(Iactylate))及甘油酯具有乳化作用，不知道它们还具有抗微生物活性，因为它们本身也缺乏足够的抗微生物活性。协同作用的结果，可减少两种防腐试剂达到抑制和/或防止酵母、真菌和细菌的存在和/或活性的满意抗微生物活性的最低需要量。而且，例如热处理的附加处理成为多余或可选的，且即便应用，也可以以显著更低的温度应用。此外，本发明的方法中使用的多聚赖氨酸-脂肪酸混合物的协同性提供了产生保存性混合物或混合剂的可能性，其中，作为附加的防腐试剂，可以以各种理由使用非常适合应用于酸性至弱酸性饮料的化合物，但由于上述原因，它们如本文的应用通常受限。例如，现可以以显著更低的量使用酸性防腐试剂例如山梨酸盐和苯甲酸盐，由此，它们不会形成沉淀或副产物，也不会对酸性饮料的口味和气味产生负面影响。可使用α-多聚赖氨酸形式和ε-多聚赖氨酸形式或者它们的混合物形式的多聚赖氨酸。优选ε-多聚赖氨酸，因其具有更高的抗微生物活性，从而在应用中可使用更少量。ε-多聚赖氨酸是含25-35个L-赖氨酸残基的同聚物。ε-多聚赖氨酸的系统名是聚(亚氨基(2-氨基-1-氧-1，6-乙二醛))。典型ε-多聚赖氨酸同聚物的经验式是C180H362N60031，其分子量约为4700(对应于约30个L-赖氨酸残基)。可用于本发明中的多聚赖氨酸可为多聚赖氨酸的一种或多种盐形式。本文中的实例是无机酸(例如盐酸、硫酸、磷酸等)的盐或有机酸(例如乳酸、乙酸、丙酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸等)的盐。尽管抗细菌作用无本质不同，但有时优选使用游离形式的多聚赖氨酸，因为盐形式的多聚赖氨酸的溶解度有限。根据本发明的方法，待与多聚赖氨酸或其盐组合使用的脂肪酸酯包括-羟基羧酸和/或这些羟基羧酸的盐的脂肪酸酯、或-甘油的脂肪酸酯(也称为甘油酯)所述羟基羧酸可包括羟基羧酸的一个单体或通过聚合键彼此连接的羟基羧酸的多个单体；前者的实例是乳酸的脂肪酸酯。含多个聚合单体的后者的实例是熟知的乳酸酯(盐)类型。熟知这些乳酸酯(盐)具有乳化特性，且用作生产各种食品和饮品的乳化剂。这些乳酸酯(盐)中包括单_乳酸和二_乳酸酯(盐)，所述羟基羧酸含多个乳酸的单体。所述羟基羧酸的单体可一般含1-6个碳原子，例如上述乳酸单体，但所述单体也可含苹果酸、柠檬酸、葡萄糖酸或酒石酸。所述羟基羧酸还可以是盐或酯的形式。所述羟基羧酸的这些盐和/或酯还非常适合用于根据本发明的方法。非常有效的乳酸盐衍生物的实例是辛酸(称为C8)或癸酸(ClO)或十二酸(C12)或十四酸(C14)或棕榈酸(C16)或油酸(C18:l)的单_乳酸和/或二_乳酸酯的钠盐、钾盐和钙盐。多聚赖氨酸还可与甘油的脂肪酸酯(也称为甘油酯)组合用于本发明的方法。甘油酯可包括甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯或者它们的混合物。这些酯产生的方法常产生熟知的各种可能的单酯、二酯或三酯的混合物。可用本领域技术人员已知的不同技术从这些混合物中分离出所述酯。因此，当说到单酯时，这些甘油单酯包括纯成分，及主要包括单酯，但也包括作为所述混合物的附加成分的二酯和三酯的混合物。通过多聚赖氨酸与甘油单酯和甘油二酯的组合应用得到了非常好的结果。通过组合多聚赖氨酸与甘油的脂肪酸和脂肪酸(包括饱和脂肪酸，例如但不限于丙酸(C3)、己酸(C6)、辛酸(C8)、癸酸(ClO)、十二酸(C12)、十四酸(C14)、十六酸(C16)、十八酸(C18)及他们的混合物)的脂肪酸酯观察到高协同性及由此的高抗细菌活性。当说到应用例如C8-甘油或ClO-甘油时，指的是甘油的脂肪酸酯，且分别为辛酸和癸酸。第三或附加防腐试剂优选为选自下列的一种或多种的试剂苯甲酸和苯甲酸盐、山梨酸和山梨酸盐、乳酸和乳酸盐、葡萄糖酸和葡萄糖酸盐、柠檬酸和柠檬酸盐、乙酸和乙酸盐、苹果酸和苹果酸盐、富马酸及其盐、酒石酸及其盐、抗坏血酸和抗坏血酸盐、EDTA、磷酸和基于磷酸的盐、植酸和植酸盐，丙酸和/或丙酸盐、己酸和/或己酸盐、丙酸和/或己酸与甘油、乳酸、精氨酸的酯，辛酸和/或辛酸盐、及/或辛酸与甘油、乳酸、精氨酸的酯，及癸酸和癸酸盐、及/或癸酸与甘油、乳酸或精氨酸的酯，桂皮酸和/或其盐。可非常好地将上述成分与多聚赖氨酸和羟基羧酸和/或甘油的脂肪酸酯的组合应用于酸性至弱酸性饮料中，并表现出显著高的抗微生物活性。此外，当把尤其是山梨酸、桂皮酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸或它们的任意组合(包括这些酸的盐)加入包括多聚赖氨酸和甘油酯的组合物或包括多聚赖氨酸和乳酸酯(盐)(任选与甘油酯组合)的组合物时，在保存作用和应用上述的饮品的期望感官特性的保持方面得到了明显好的结果。上述特定酸给饮料赋予了在特定口味和气味方面非常特殊的感官特性。可将多聚赖氨酸直接加入饮品，也可将其与其他成分以混合剂的形式加入饮品。适于生产饮品的组合物包括例如-0.OOOlwt%-多至50wt%、更优选0.Iwt%_45wt%、且最优选Iwt%多聚赖氨酸和/或其盐，及作为第二防腐试剂的-0.OOOlwt%-多至45wt%、且更优选多至40wt%，且最优选多至35wt%的甘油酯，或-0.0001wt%-多至45wt%、且更优选5wt%_35衬％的乳酸酯(盐)，及-0_45wt%、且更优选0_30wt%的有机酸，或者所述有机酸的混合物的盐或酯。如果使用桂皮酸和/或山梨酸，则可将这些成分和/或它们的盐应用于包括0-45wt%、且更优选0-30wt%的这些成分的组合物。组合物可为固体或液体形式。如果组合物是液体形式，则其一般为含水组合物形式，其可为溶液或分散剂，且可包括载体。在各种熟知的载体中，发现聚乙二醇和/或乳酸盐(lactate)是性能极优的载体。载体的浓度可以是约50_98wt%。此外，还可加入本领域技术人员已知的各种乳化剂。优选以基于100%脂肪酸衍生物(例如甘油酯和/或乳酸酯(盐))例如0.1-25%、更优选1-10%及最优选2-4%的浓度应用乳化剂，例如聚山梨酸(例如聚山梨酸60或80)和卵磷脂。如果组合物为固体形式，其一般为包括相关成分颗粒的粉末形式。也可应用载体。发现二氧化硅和/或麦芽糊精是非常适合的载体，且以多至50wt%_98wt%的浓度存在。正常情况下，多聚赖氨酸以占产品重量的多至1%、优选0.0001%-1%或0.0001%-0.1%、更优选0.0001%-0.01%、最优选0.0001%-0.001%的量存在于饮品中。正常情况下，乳酸酯(盐)以占产品重量的多至1%、优选0.0001%-1%或、或甚至0.0001%-0.1%、且最优选0.0001%-0.01%的量存在于所述产品中。正常情况下，甘油酯以占产品重量的多至5%、优选0.0001%-5%、更优选0.0001%_2%、最优选0.0001%-1%的量存在于饮品中。有机酸或其盐，例如乳酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、抗坏血酸、羟乙酸、苯甲酸、乙酸、柠檬酸、丙酸、己酸、辛酸、苹果酸和脂肪酸以占产品重量的多至10%、优选0.0001%-10%、优选0.0001%-5%的量存在于食品或饮品中。终产物中存在的桂皮酸和/或山梨酸也应用相同的浓度范围。本发明的方法在杀灭、抑制和/或防止食品腐败酵母的生长或存在中尤其有效，所述食品腐败酵母优选但不限于例如假丝酵母属(白色假丝酵母(Candidaalbicans)或发酵假丝酵母(Candidafermentati)或近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)或热带假丝酵母(Candidatropicalis))、德巴利酵母属(例如Debaryomyceshansenii)、德克酵母属(例如Dekkerabruxellensis)、有抱汉逊酵母属(例如Hanseniasporauvarum)、伊萨酵母属(例如东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis))、克鲁维酵母属(例如马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus))、Metschnokowia酵母属(例如Metschnokowiapulcherrima)、毕赤酵母属(例如异常毕赤酵母(Pichiaanomala))、红酵母属(例如粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)或胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa))、酸酒酵母属(例如酸酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、裂殖酵母属(例如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))、有抱圆酵母属(Torulospora)(例如德尔布有孢圆酵母(Torulosporadelbruecki))、子囊菌酵母属(Yarrowia)(例如解脂子囊菌酵母(Yarrowialipolytics))、及结合酵母属(例如拜耳结合酵母(Zygosaccharomycesbailii)^Ι氏结母(Zygosaccharomycesrouxii))￥另1|白勺_母。根据本发明使用多聚赖氨酸与甘油或羟基羧酸的脂肪酸酯的组合也可有效降低和/或防止酸性饮料中细菌的存在和/或活性。尤其是细菌例如但不限于环脂酸芽孢杆菌属、醋杆菌属、葡萄糖菌属、葡萄糖酸醋杆菌属、乳杆菌属类别及其他据发现在存在本发明的成分的酸性环境中敏感的相关细菌类别的细菌。还发现根据本发明方法的多聚赖氨酸与甘油和/或羟基羧酸的脂肪酸酯有效抗酸性饮品中的下列真菌的存在和/或生长，例如镰刀菌属(例如尖孢镰刀菌属(Fusariumoxysporum))、毛霄菌属(例如Mucorplumbeus)、丝衣霄属(例如Byssochlamysfulva)>新萨托菌属(Neosartorya)(例如Neosartoryaspinosa)、裸节菌属(例如Talaromycestrachyspermus或Talaromycesmacrosporus)、地丝菌属(例如白地丝霉(Geotrichumcandidum))、拟青霉属(例如多变拟青霉(Paecilomycesvariotii))、青霉属(例如娄地青霉(Penicilliumroqueforti)或产黄青霉(Penicilliumchrysogenum))、曲霉菌属(例如黄曲霉(Aspergillusflavus))、葡萄孢属(例如灰葡萄孢(Botrytiscinerea))、根霉菌属(例如匍茎根霉(Rhizopusstolonifer))、分枝孢子菌属(例如草本分枝孢子(Cladosporiumherbarum))禾口散囊菌属(Eurotium)(例如Eurotiumherbariorum)类另Ij的真菌。发现本发明非常适于在热罐包装或冷罐装包装型饮品中应用。热罐包装和冷罐装包装是熟知的技术。本领域技术人员知道在这些技术中使用何种特殊条件。冷罐装包装最常在低于50°C的温度下应用，且优选在环境温度下应用。如上所述，本发明使得热处理变得多余或可选，且如果需要进行热处理，也可以在甚更适宜的低温下应用。本发明非常适于冷灌型饮料，表示通过应用冷罐装包装法包装的饮料。用本发明的方法可非常好地保存饮品，例如包括水果或蔬菜的果汁。果汁可加碳酸或不加。而且，所述果汁可为浓缩型或可为即饮果汁，且包括天然的和经加工的/经重配的果汁。本发明的方法在保存碳酸软饮料中也表现出非常有效。以下非限制性实施例会进一步说明本发明。鐘实验1在pH3.5的GPY-肉汤(葡萄糖蛋白胨酵母粉)中测试了山梨酸或桂皮酸和ε-多聚赖氨酸与一些脂肪酸衍生物的混合物的抗食品腐败酵母的效力。组合这些两种化合物(如果存在山梨酸或桂皮酸)可大大降低ε-多聚赖氨酸和特定中链脂肪酸衍生物的浓度。培养物和培养条件所研究的培养物列于表1。将培养物在GPY-肉汤中培养，所述GPY-肉汤为每升去矿质水中包括40g葡萄糖、5g蛋白胨和5g酵母提取物，用2N的HCl将培养基的pH调至3.5。将培养物在螺旋盖试管中于25°C下培养至少48小时。在摇瓶中培养膜醭毕赤酵母(Pichiamembranifaciens)MUCL27794、CBS8427和CBS5567，粘红酵母CBS2367、胶红酵母CBS8054和CBS2401和拜耳结合酵母MUCL27812。表1所测试的CBS和MUCL培养物所测试微生物培养物来源温育发酵假丝酵母CBS6319葡萄汁螺旋盖瓶近平滑假丝酵母CBS1954橄榄螺旋盖瓶近平滑假丝酵母CBS2215酸洗螺旋盖瓶近平滑假丝酵母C-S饮料螺旋盖瓶热带假丝酵母MUCL29893螺旋盖瓶热带假丝酵母MUCL28180螺旋盖瓶DebaryomyceshanseniiCBS791牛肉螺旋盖瓶DebaryomyceshanseniiCBS5230米醪螺旋盖瓶DebaryomyceshanseniiMUCL30003乳酪螺旋盖瓶DekkerabruxellensisMUCL27706螺旋盖瓶DekkerabruxellensisMUCL27707螺旋盖瓶HanseniasporauvarumMUCL31705螺旋盖瓶HanseniasporauvarumMUCL30628螺旋盖瓶HanseniasporauvarumMUCL30626螺旋盖瓶东方伊萨酵母CBS2050姜螺旋盖瓶东方伊萨酵母CBS5147果汁螺旋盖瓶马克思克鲁维酵母MUCL30063螺旋盖瓶马克思克鲁维酵母MUCL30092螺旋盖瓶MetschnokowiapulcherrimaMUCL29874螺旋盖瓶MetschnokowiapulcherrimaMUCL31701螺旋盖瓶异常毕赤酵母螺旋盖瓶CBS1683橙汁螺旋盖瓶螺旋盖瓶异常毕赤酵母CBS1979泡菜螺旋盖瓶异常毕赤酵母MUCL27777螺旋盖瓶膜醭毕赤酵母MUCL27794榆树摇瓶膜醭毕赤酵母CBS8427西红柿摇瓶膜醭毕赤酵母CBS5567柠檬水摇瓶膜醭毕赤酵母MUCL30004榆树螺旋盖瓶粘红酵母CBS2367果汁摇瓶胶红酵母CBS8054红胡椒摇瓶胶红酵母CBS2401麦芽糖浆摇瓶酿酒酵母MUCL30115酒厂螺旋盖瓶酿酒酵母CBS6710橙螺旋盖瓶酿酒酵母CBS2190果汁螺旋盖瓶酿酒酵母MUCL30006啤酒螺旋盖瓶酿酒酵母C-S饮料螺旋盖瓶栗酒裂殖酵母C-S饮料螺旋盖瓶德尔布有孢圆酵母CBS7443柠檬水螺旋盖瓶德尔布有孢圆酵母CBS705酸化螺旋盖瓶解脂子囊菌酵母CBS7033土壤螺旋盖瓶解脂子囊菌酵母MUCL29439乳酪螺旋盖瓶解脂子囊菌酵母MUCL29853湿磨螺旋盖瓶拜耳结合酵母CBS6708橙螺旋盖瓶拜耳结合酵母MUCL38486腌食用小黄瓜螺旋盖瓶拜耳结合酵母MUCL28823苹果汁螺旋盖瓶拜耳结合酵母MUCL27812果汁摇瓶拜耳结合酵母MUCL38950螺旋盖瓶鲁氏结合酵母MUCL43236螺旋盖瓶鲁氏结合酵母MUCL30008螺旋盖瓶鲁氏结合酵母C-S饮料螺旋盖瓶抑制测定测定最小抑制浓度(一维筛选)在无菌的96-孔微量滴定板中进行抑制测试。将递增量(经10步(每步IOyL)从O到100μL)的各化合物的无菌浓储液转移到无菌微量滴定板中。接着加入IOOyL经过滤除菌的双倍强度的GPY-肉汤，且将各孔中的体积用无菌去矿质水调至200μL。将板用2μL培养2天的培养物接种，并于25°C温育96小时。通过用微板读取仪测量595nm处的光密度来对生长进行定量。所有实验都重复进行两次。将吸光度增加不超过阈值(定义为空白的平均吸光度值加三次的标准偏差)的最小浓度作为最小抑制浓度(MIC)。两种抑制剂的组合的筛选在无菌的96-孔微量滴定板中进行这些组合测试。用递增量的两种不同抑制剂制备GPY-肉汤。用8个等浓缩步骤(特定抑制剂对特定酵母的MIC值的O至1-2倍，产生64种不同培养基)提供了各抑制剂的浓度。将200ml各培养基转移到一组无菌的96-孔微量滴定板中。将完成的孔板于4°C保存待用。将板用2μL培养2天的培养物接种，并于25°C温育96小时。通过用微板读取仪测量595nm处的光密度来对生长进行定量，并表示为对照(不包括抑制剂)中的生长的百分比。所有实验都重复进行两次。三种成分的组合的筛选还在96-孔微量滴定板中进行这些组合测试。制备包括递增量的抑制剂的无菌GPY-肉汤。首先，在8个等浓缩步骤中提供了第一抑制剂的浓度。第二，选择固定比例的其他两种抑制剂。用8个等浓缩步骤提供了此混合物，产生64种不同培养基。将200ml各培养基转移到一组无菌的96-孔微量滴定板中。将完成的多孔板于4°C保存待用。将板用2μL培养2天的培养物接种，并于25°C温育96小时。通过用微板读取仪测量595nm处的光密度来对生长进行定量，并表示为对照(不包括抑制剂)中的生长的百分比。所有实验都重复进行两次。所测试的防腐剂/抗微牛物试剂单/二-辛酰甘油、单/二-癸酰甘油、MCE8060(即为单/二-辛酰甘油和但/二-癸酰甘油的混合物)、辛酰乳酸钠、癸酰乳酸钠和Pationic122A(辛酰乳酸钠和癸酰乳酸钠的混合物)购自CaravanIngredients，Lenexa，Kansas，USA。山梨酸和桂皮酸购自Sigma-Aldrich，StLouis，USA，且ε-多聚赖氨酸购自ChissoCorp(Japan)。MM表2a列出了pH3.5下ε-多聚赖氨酸对许多酵母的MIC值。表2a:pH3.5下ε-多聚赖氨酸对各种酵母的最小抑制浓度所测试微生物培养物MIC(%)[最小值]O[最大值]0.03白色假丝酵母DSM13860.024白色假丝酵母ATCC2091>0.03发酵假丝酵母CBS6319>0.03近平滑假丝酵母CBS19540.030近平滑假丝酵母CBS2215>0.03近平滑假丝酵母C-S>0.021热带假丝酵母MUCL298930.003热带假丝酵母MUCL281800.003DebaryomyceshanseniiCBS7910.003DebaryomyceshanseniiCBS52300.006DebaryomyceshanseniiMUCL300030.006DekkerabruxellensisMUCL277060.006DekkerabruxellensisMUCL277070.003HanseniasporauvarumMUCL317050.003HanseniasporauvarumMUCL306280.006HanseniasporauvarumMUCL306260.003东方伊萨酵母CBS20500.003东方伊萨酵母CBS51470.003马克思克鲁维酵母MUCL300630.006马克思克鲁维酵母MUCL300920.003MetschnokowiapulcherrimaMUCL298740.015MetschnokowiapulcherrimaMUCL317010.027异常毕赤酵母CBS1683>0.03异常毕赤酵母CBS1979>0.03异常毕赤酵母MUCL27777>0.03膜醭毕赤酵母MUCL27794ND膜醭毕赤酵母CBS8427ND膜醭毕赤酵母CBS5567ND膜醭毕赤酵母MUCL30004ND粘红酵母CBS2367ND胶红酵母CBS8054ND胶红酵母CBS2401ND酿酒酵母MUCL30115ND酿酒酵母CBS67100.003酿酒酵母CBS21900.003酿酒酵母MUCL300060.003酿酒酵母C-S0.002栗酒裂殖酵母C-S0.006德尔布有孢圆酵母CBS74430.003德尔布有孢圆酵母CBS7050.003解脂子囊菌酵母CBS70330.018解脂子囊菌酵母MUCL294390.012解脂子囊菌酵母MUCL298530.006拜耳结合酵母CBS67080.006拜耳结合酵母MUCL384860.006拜耳结合酵母MUCL288230.003拜耳结合酵母MUCL278120.003拜耳结合酵母MUCL389500.003鲁氏结合酵母MUCL432360.003鲁氏结合酵母MUCL300080.003鲁氏结合酵母C-S0.001表2b总结了pH3.5下一些中链脂肪酸衍生物、山梨酸、桂皮酸和ε_多聚赖氨酸对许多酵母(例如表1所示的酵母)的MIC值。数据显示，癸酸衍生物是比辛酸衍生物更强的抑制剂。桂皮酸也比山梨酸更有效。表2b:C8甘油酯(单/二-辛酰甘油)、ClO甘油酯(单/二-癸酰甘油)、MCE8060、C8乳酸酯(盐)(辛酰乳酸钠)、ClO乳酸酯(盐)(癸酰乳酸钠)、Pationic122A、多聚赖氨酸、山梨酸和桂皮酸对酵母集合的平均最小抑制浓度(MIC〒iS)、最大MIC(MIC最大)(在pH3.5下)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>组合2种防腐试剂和3种防腐试剂以下表显示了多聚赖氨酸与各种其他防腐试剂组合对不同酵母的作用。表3在pH3.5下的GPY-肉汤中，在不同浓度的多聚赖氨酸和山梨酸钾下栗酒裂殖酵母的生长晕(outgrowth)。所述生长晕表示为0浓度抑制剂时生长晕(其被设定为100%)的百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>30.04970031410表4在pH3.5下的GPY-肉汤中，在不同浓度的￡-多聚赖氨酸和MCE8060(单/二-辛酰甘油和单/二-癸酰甘油的混合物)下酿酒酵母生长晕。所述生长晕表示为0浓度抑制剂时生长晕(其被设定为100%)的百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表5在pH3.5下的GPY-肉汤中，在不同浓度的多聚赖氨酸和癸酰乳酸钠下德尔布有孢圆酵母的生长晕。所述生长晕表示为0浓度抑制剂时生长晕(其被设定为100%)的百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表6在pH3.5下的GPY-肉汤中，在不同浓度的ε-多聚赖氨酸、MCE8060(单/二-辛酰甘油和单/二-癸酰甘油的混合物)和山梨酸钾下酿酒酵母生长晕。所述生长晕表示为O浓度抑制剂时生长晕(其被设定为100%)的百分比。将山梨酸盐-MCE8060的比例设定为2.33。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表7在ρΗ3.5下的GPY-肉汤中，在不同浓度的ε-多聚赖氨酸、MCE8060(单/二-辛酰甘油和单/二-癸酰甘油的混合物)和桂皮酸下酿酒酵母生长晕。所述生长晕表示为0浓度抑制剂时生长晕(其被设定为100%)的百分比。将MCE8060-ε-多聚赖氨酸的比例设定为18.9。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实验2碳酸果汁本实验中，使用各种抗微生物制剂将本发明的保存方法应用于碳酸果汁中。通过对取自不同时刻的果汁样品的平板计数方法测定了这些制剂的抗微生物活性。所用果汁包括水、约10_15衬％的甜味剂、约的果汁浓缩物、约0.3wt%的香料和一些柠檬酸和柠檬酸盐。初始PH为约3.15。向果汁中充二氧化碳至CO2浓度为约5.2g/l。用4种不同酵母(近平滑假丝酵母、栗酒裂殖酵母、拜耳结合酵母和酿酒酵母)的混合培养物接种果汁样品，其中接种水平为约100个细胞/ml或约100个孢子/ml。将酵母预培养于无菌的GPYpH3.5(pH3.5的葡萄糖蛋白胨酵母粉)上。在25°C下温育所述培养基24小时。接种前，用血细胞计数器(BUrker-TUrk型)对细胞数量进行计数。使用不同的抗微生物制剂。所述制剂包括苯甲酸钠盐(99+%，来自Acros)、山梨酸钾(99%，来自Acros)、桂皮酸钾、六偏磷酸钠(下文简称为“SHMP”)、ε-多聚赖氨酸(25wt%，来自Chisso)和MCE8060(CaravanIngredients)。这些成分也用于实验3，其针对下文所述的非碳酸冰茶。MCE8060是CaravanIngredients的商品，其包括单/二-辛酰甘油和单/二-癸酰甘油的混合物，其中总甘油单酯最少为58%。表8提供用于所述果汁样品的抗微生物制剂的组合物。表8用于碳酸果汁的本发明的保存方法的抗微生物制剂的组合物<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>上表中的结果显示，本发明的保存酸性饮料的方法非常适于保存酸性碳酸果汁。ε-多聚赖氨酸与C8/C10甘油酯的混合物(样品3)能够保存该果汁至少98天(此前未见报导)。其他样品通过7天后的计数证实，再加入其他防腐试剂时，如本发明的方法中使用的多聚赖氨酸/甘油酯组合的抗微生物效果甚至更佳，及可降低所用全部防腐试剂的浓度的同时得到相同的保存结果。当用辛酰乳酸钠或癸酰乳酸钠或者Pationic122Α(可商购的辛酰乳酸钠和癸酰乳酸钠的混合物，CaravanIngredients)替换所述甘油酯时，或当使用甘油酯与上述乳酸酯(盐)之一的混合物时，得到近似结果。实验3非碳酸冰茶本实验中，使用各种抗微生物制剂将本发明的保存方法应用于冰茶。通过对取自不同时刻的冰茶样品的平板计数方法测定了这些制剂的抗微生物活性。制备初始pH为约2.65的冰茶标准制剂。用4种不同酵母(近平滑假丝酵母、栗酒裂殖酵母、拜耳结合酵母和酿酒酵母)的混合培养物或者3种不同变质霉菌(Mucorplumbeus、多变拟青霉和青霉属物种)的接合孢子或分生孢子的混合物接种非碳酸冰茶样品。在全部情况下，接种水平为约100个细胞/ml或约100个孢子/ml。将霉菌预培养于麦芽提取物琼脂上。在25°C下温育所述培养基7天。通过用5-10ml0.05%(w/v)的吐温80充分冲刮自身琼脂板来收集霉菌的分生孢子。后将包括分生孢子的液体转移到包括10-20个无菌的玻璃珠(5mm直径)的无菌的50ml试管中。以涡旋短暂震荡试管的内容物，以松弛孢子。随后将试管内容物转移到底部具有玻璃塞的无菌注射器中。通过过滤除去任何残余的菌丝体。接种前，用血细胞计数器(Btoker-TUrk型)对细胞或分生孢子的数量进行计数。使用不同的抗微生物制剂。所述制剂包括与实验2中所述相同的成分。表10提供用于非碳酸冰茶样品的抗微生物制剂的组合物。表10用于非碳酸冰茶的本发明的方法的保存方法的抗微生物制剂的组合物<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>可商购的ε-多聚赖氨酸是包括25衬％的ε-多聚赖氨酸的溶液。上表中的ε-多聚赖氨酸包括量是IOOwt%。表11和12显示对取自不同时刻的冰茶样品的平板计数结果。表11不同时刻的冰茶样品中霉菌的总平板计数(logCFU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>上表中的结果显示，本发明的保存酸性饮料的方法非常适于保存包括霉菌的酸性非碳酸冰茶饮料。ε“多聚赖氨酸与C8/C10甘油酯的混合物(样品3)对霉菌的生长具有抑制作用，且在加入第三防腐剂(例如桂皮酸钾或山梨酸钾)时显著更有效。表12不同时刻的冰茶样品中酵母的总平板计数(logCFU/ml)LogCFU/ml时间(天数)_<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>上表中的结果显示，本发明的保存酸性饮料的方法非常适于保存酸性非碳酸饮料(如冰茶)。ε_多聚赖氨酸与C8/C10甘油酯的混合物(样品3)能够保存该饮料至少62天(此前未见报导)。其他样品证实，再加入其他防腐剂时，本发明的方法中使用的多聚赖氨酸/甘油酯组合，即便降低所用防腐试剂的浓度，仍保持相同的抗微生物效果。当用辛酰乳酸钠或癸酰乳酸钠或者Pationic122Α(可商购的辛酰乳酸钠和癸酰乳酸钠的混合物，CaravanIngredients)替换所述甘油酯时，或当使用甘油酯与上述乳酸酯(盐)之一的混合物时，得到抗非碳酸冰茶中的霉菌和酵母的抗微生物作用的近似结果。权利要求用于保存pH值为1-4.8的酸性饮料的方法，包括应用包括多聚赖氨酸和/或其盐以及作为第二防腐剂的、羟基羧酸和/或其盐的脂肪酸酯或甘油的脂肪酸酯中至少一种的组合物。2.权利要求1的方法，其中所述饮料的PH值为2-4.6。3.权利要求1或2的方法，其中所述饮料经冷罐装包装方法。4.以上权利要求中任一项的方法，其中所述羟基羧酸的脂肪酸酯包括乳酸酯(盐)。5.以上权利要求中任一项的方法，其中所述组合物包括其他防腐试剂。6.权利要求5的方法，其中所述其他防腐试剂是选自下列的一种或多种的成分山梨酸及其盐、桂皮酸及其盐、乳酸及其盐、乙酸及其盐、柠檬酸及其盐、和丙酸及其盐。7.以上权利要求中任一项的方法，其中多聚赖氨酸是ε-多聚赖氨酸。8.以上权利要求中任一项的方法，其中所述组合物包括0.0001wt%-多至50wt%的多聚赖氨酸和/或其盐，和0.OOOlwt%-多至45wt%的甘油酯或0.OOOlwt%-多至45wt%的乳酸酯(盐)，及另外0-45wt%的有机酸或者其混合物的盐或酯，0-45wt%的桂皮酸或其盐，和0-45wt%的山梨酸或其盐。9.权利要求8的方法，其中所述有机酸包括乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸或它们的任意组合ο10.以上权利要求中任一项的方法，其中所述组合物应用于抗酵母、真菌或细菌。11.以上权利要求中任一项的方法，其中所述真菌包括来自镰刀菌属、毛霉菌属、丝衣霉属、新萨托菌属、裸节菌属、地丝菌属、拟青霉属、青霉属、曲霉菌属、葡萄孢属、根霉菌属、分枝孢子菌属和散囊菌属的类别的真菌。12.权利要求10的方法，其中所述酵母包括来自假丝酵母属、德巴利酵母属、德克酵母属、有孢汉逊酵母属、伊萨酵母属、克鲁维酵母属Jetschnokowia酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酿酒酵母属、裂殖酵母属、有孢圆酵母属、子囊菌酵母属和结合酵母属的类别的酵母。13.pH值为1-4.8的酸性饮品，其包括多聚赖氨酸和第二防腐试剂和第三防腐试剂，所述第二防腐试剂选自乳酸酯(盐)或甘油酯，或者二者；所述第三防腐试剂选自山梨酸、桂皮酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和/或丙酸，这些酸的任意盐，及它们的任意组合。14.甘油的脂肪酸酯在包括多聚赖氨酸和/或其盐的组合物中用作抗微生物剂以保存PH值为1-4.8的酸性饮品的用途。15.脂肪酸和酸_、盐-或酯_形式的羟基羧酸的脂肪酸酯在包括多聚赖氨酸和/或其盐的组合物中用作抗微生物剂以保存PH值为1-4.8的酸性饮品的用途。全文摘要本发明涉及保存的pH4.8以下的酸性饮料抗霉菌、酵母和细菌的方法。所述方法包括应用基于多聚赖氨酸和/或其盐与第二防腐试剂组合的组合物，所述第二防腐试剂选自甘油酯和/或羟基羧酸的酸、盐或酯形式的脂肪酸酯。文档编号A23L2/02GK101801221SQ200880107450公开日2010年8月11日申请日期2008年9月17日优先权日2007年9月17日发明者A·M·拉米雷斯,D·R·克莫尔,E·W·邦滕保尔,R·奥托申请人:普拉克生化公司