在包含浓缩糖和乙酸盐的培养基中具有改进的乙醇产量的发酵单胞菌属的制作方法

专利名称：在包含浓缩糖和乙酸盐的培养基中具有改进的乙醇产量的发酵单胞菌属的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物学和基因工程领域。更具体地讲，发现了编码整合宿主因子 (IHF) α亚基的himA基因涉及发酵单胞菌属的乙酸盐抗性。开发了利用木糖的发酵单胞菌 属(Zymomonas)菌株，该菌株对himA基因进行了基因修饰，它在存在乙酸盐的情况下表现 出改进的乙醇产量。
背景技术：
通过微生物来生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因此成为当 前研究的重要领域。运动发酵单胞菌属(Zymomonasmobilis)是一种产生乙醇的细菌，它可 利用葡萄糖、果糖、和蔗糖生长，经由Entner-Douderoff途径将这些糖代谢成CO2和乙醇。期望使用水解的木质纤维质生物质通过发酵来生产乙醇，所述木质纤维质生物质 能够提供丰富的可利用低成本碳底物。木糖是水解的木质纤维质材料中的主要戊糖。虽 然运动发酵单胞菌属的野生型不能利用木糖作为碳源，但能在该糖上生长的重组菌株已经 被工程化了(US5514583，US 5712133, WO 95/28476，Feldmann 等人(1992) ApplMicrobiol Biotechnol 38:354-361，Zhang 等人(1995) Science267 :240_243)。这些菌株经修饰用 于表达木糖代谢所需的四种酶1)木糖异构酶，该酶催化木糖转化成木酮糖；2)木酮糖激 酶，它将木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)转酮醇酶；和4)转醛醇酶(US5514583，US 6566107 ；Zhang等人(1995) Science 267 240-243)。具有这四种酶并且在细胞的正常代谢 机制下，三分子木糖被转化成两分子6-磷酸葡萄糖和一分子3-磷酸甘油醛，它们随后通过 葡萄糖支路途径被转化成乙醇和CO2 (

图1)。虽然已经成功地工程化了运动发酵单胞菌属菌株用于木糖代谢，该菌株在木糖 上的生长以及乙醇生产不像它在葡萄糖上一样好。甚至在理想环境下，木糖代谢比葡萄 糖代谢慢 3 至 4 倍(Lawford 等人(2000)Applied Biochemistry and Biotechnology 84-86 :277-293)，在不利条件下差距更大。因为碳通量缓慢，木糖上稳态水平的ATP也增 力口较慢(Kim 等人(2000) Applied and Environmental Microbiology 66 (1) 186—193)， 因此运动发酵单胞菌属该糖上生长时更易于受到胁迫和抑制剂的影响(Joachimsthal等 人(2000)Applied Biochemistry and Biotechnology84_86 :343_356 ;Kim 等人(2000)Applied Biochemistry and Biotechnology84_6 :357_370)。使用水解木质纤维质生物 质进行发酵时会遇到的特别胁迫是乙酸盐(Kim等人(2000) Applied Biochemistry and Bi otechnology84-86 :357_370)，它来自预处理和糖化加工期间半纤维素中的乙酰化木糖残基。运动发酵单胞菌属应对乙酸和其它有机酸相关的胁迫的机制仍未被阐明，并且文 献中无关于该过程中起作用的基因的报道。因此使用合理设计来基因工程化具有高乙酸盐 抗性的菌株不是当前的选择。另一方面，已经描述了具有高乙酸盐抗性的运动发酵单胞菌 属突变体(Joachimsthal 等人(1998) Biotechnol. Lett. 20(2) 137-142 Jeon 等人(2002) Biotechnol. Lett. 24 :819_824 ；美国专利申请20030162271)。在用亚硝基胍(NTG)进行随 机化学诱变后，进行选择以生成这些突变体，但是在这些实例的任何一个中未鉴定负责抗 乙酸盐表型的修饰基因。也未测定是否需要一种突变或多种突变以在存在乙酸盐的情况下 进行更好的发酵。因此当前从上文所引用的研究中不知道如何使用定向基因工程将乙酸盐 抗性赋予运动发酵单胞菌属的其它菌株。需要鉴定涉及乙酸盐抗性的基因，可修饰该基因以产生发酵单胞菌属抗乙酸盐菌 株，该菌株用于发酵从预处理并糖化的木质纤维质生物质中制备的水解产物，从而产生乙醇。

发明内容
本发明涉及利用木糖的发酵单胞菌属菌株，所述菌株在存在乙酸盐的条件下具有 改善的性能。申请人已经发现乙酸盐抗性受编码整合宿主因子(IHF) α亚基的himA基因 的影响。利用木糖的发酵单胞菌属具有进行了附加基因修饰的himA基因，当它在存在乙酸 盐的葡萄糖和木糖浓缩混合物中培养时，其乙酸盐抗性提高。himA修饰使内源himA基因的 表达减少。在这些条件下，himA经修饰的菌株的木糖利用率和乙醇产量显著高于具有正常 himA基因表达的可比较菌株。因此本发明提供发酵单胞菌属的重组微生物，该微生物能够在混合糖培养基中通 过发酵利用木糖来生产乙醇，所述微生物包含至少一种基因修饰，所述基因修饰减少himA 基因编码的内源编码整合宿主因子α亚基蛋白的表达。此外，本发明提供生成上述微生物的方法，所述方法包括a)提供能够在合适条件下利用木糖生产乙醇的重组发酵单胞菌属菌株，其中所述 菌株的基因组表达内源整合宿主α亚基蛋白(HimA)；以及b)修饰所述菌株的基因组，其中所述修饰减少内源整合宿主因子α亚基(HimA) 蛋白的表达。附图简述和序列描述通过下面的发明详述、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本发明，这些详 细描述、附图和序列描述形成了本专利申请的一部分。图1示出四种酶(加框表示)的图表，它们已经用于工程化运动发酵单胞菌属使 其能利用木糖，以及用于利用木糖生产乙醇的生物化学途径。图2示出pMODgap/aada的质粒图谱，该质粒用于生成ZW801-4中的转座子插入文库。
图3是W801-4在存在两种不同量乙酸盐的葡萄糖和木糖浓缩混合物中的生长示 意图。图4是富集的转座子插入突变体文库培养物与对照菌株ZW801-4的葡萄糖利用 率、木糖利用率、和乙醇产量的比较示意图，它们在具有100g/L葡萄糖，90g/L木糖、和6g/ L乙酸盐的培养基(A)或具有105g/L葡萄糖，100g/L木糖，和9g/L乙酸盐培养基(B)中生
长。 图5是在包含葡萄糖的培养基中的ZW801_4(A)和转座子插入突变体AcR#3 (B)在 不同量乙酸钾情况下的生长示意图。图6是在包含葡萄糖的培养基中生长43小时后的ZW801_4(A)和转座子插入突变 体AcR#3 (B)的终点值示意图，所述培养基具有不同的乙酸盐。图7是AcR#3和ZW801-4在具有105g/L葡萄糖，100g/L木糖，和9g/L乙酸盐的培 养基中的葡萄糖利用率、木糖利用率、和乙醇产量示意图。图8是ZW801_4(A)和AcR#3(B)在100%模拟水解产物培养基中的葡萄糖利用率、 木糖利用率、和乙醇产量示意图，所述培养基包含 9. 5g/L的乙酸盐和190mM的铵离子，以 及110g/L的葡萄糖和90g/L的木糖。图 9 是在构建 himA 基因敲除菌株载体 pLDHTcl39#7 (A)、pLDHTcl39#7-9ffff (B)、禾口 pLDHSp-9ffff(C)期间制备的质粒的图谱。图10A示出用于制备插入himA自杀载体pHimA的himA侧接DNA的引物的基因组 位置，图10B是pHimA质粒的环形图谱。图11是ZW801_4(A)和ZW801-4: AhimA(B)在100%模拟水解产物培养基中的葡 萄糖利用率、木糖利用率、和乙醇产量示意图，所述培养基包含 9. 5g/L的乙酸盐和190mM 的铵离子，以及110g/L的葡萄糖和90g/L的木糖。图 12 是 ZW801-4(A)、AcR#3 (B)、和 ZW801-4: AhimA(C)在包含葡萄糖的培养基 中的生长示意图，培养基中以钾盐形式加入0或8g/L的乙酸盐。根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描 述和所附的序列描述形成了本申请的一部分。下面的序列遵照37C. F. R. § 1. 821-1. 825 ( “对包含核苷酸序列和/或氨基酸序 列公开内容的专利申请的要求-序列规则”("Requirements forPatent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization) (WIPO) ST. 25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5. 2和 49. 5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的 208 节和附录 C)。用于核 苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中示出的规则。随同在光盘上提供了序列表。包含序列表的光盘的内容遵照37CFR1. 52(e)，其 以引用方式并入本文。提交两张彼此相同的光盘。所述光盘标记有“Copy I-Sequence Listing” 和 “Copy 2 Sequence listing”。它们包含以下文件CL4039 seq list. ST25.SEQ ID N0:1是运动发酵单胞菌属himA编码区的核苷酸序列。SEQ ID NO 2和3是序列转座子插入位点的引物核苷酸序列。SEQ ID NO 4和5是包含Idh基因和一些围绕DNA的DNA片段的PCR扩增引物的核苷酸序列。 SEQ ID NO 6和7是包含来自pACY184的抗四环素盒的DNA片段的PCR扩增引物 的核苷酸序列。SEQ ID NO :8和9是用于制备IoxP位点的寡核苷酸序列，所述IoxP位点用于插 入质粒 pLDHTcl39#7。SEQ ID NO 10和11是用于制备IoxP位点的寡核苷酸序列，所述IoxP位点用于 插入质粒 pLDHTcl39#7-9W。SEQ ID NO 12和13是包含来自质粒pHP15578的抗奇放线菌素盒的DNA片段的 PCR扩增引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 14和15是用于PCR扩增3，himA的侧接DNA片段引物核苷酸序列。SEQ ID NO 16和17是用于PCR扩增5，himA的侧接DNA片段引物核苷酸序列。SEQ ID NO :18和19是PCR引物的核苷酸序列，该引物用于确认在pHimA中的 5’ himA侧接DNA和其染色体副本之间发生的单交换事件。SEQ ID NO :20和21是PCR引物的核苷酸序列，该引物用于确认在pHimA中的 3’ himA侧接DNA和其染色体副本之间发生的单交换事件。SEQ ID NO 22和23是PCR引物的核苷酸序列，该引物用于确认在pHimA中的5， 和3’ himA侧接DNA序列和染色体中的himA基因之间发生的双交换事件。SEQ ID NO 24是运动发酵单胞菌属的GFOR编码区的完整核苷酸序列。SEQ ID NO 25是ZW801-4中遭中断的GFOR编码区的完整核苷酸序列(从初始起 始密码子至初始终止密码子)。SEQ ID NO 26是运动发酵单胞菌属HimA蛋白的氨基酸序列。发明详述本发明描述了利用木糖的重组发酵单胞菌属菌株，该菌株通过修饰内源himA基 因进行进一步工程化，以及生成修饰himA的发酵单胞菌属菌株的方法。所述修饰减少himA 基因的表达，并且导致修饰himA的菌株当在包含混合糖(包括木糖和乙酸盐)的培养基中 培养时具有改善的性能。可在生产乙醇的方法中使用这些菌株，其中修饰菌株在包括木糖 的培养基中培养。由发酵单胞菌属菌株生产的乙醇可用作化石燃料的替代能源。以下缩写和定义将用于说明书和权利要求的判读。将“整合宿主因子”缩写为IHF。“基因”指能够表达特定蛋白质的核酸片段，其可包括编码序列前的调控序列(5' 非编码序列)和编码序列后的调控序列(3'非编码序列)。“天然基因”或“野生型基因” 指具有其自身调控序列的天然存在的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含 在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源 的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序 列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来基 因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可 以包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。术语“基因构建体”指编码表达一种或多种特定蛋白的核酸片段。在基因构建体 中基因可以是天然的、嵌合的、或外来的。通常基因构建体将包含“编码序列”。“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“启动子”或“启动控制区”指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。一 般来讲，编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于不同 的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人 员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者 响应不同的环境条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引 起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。如本文所用，术语“表达”指转录和衍生自基因的有义(mRNA)或反义RNA的稳定积 聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA 转录物。“超表达”指在转基因生物中产生的基因产物超出在正常生物或未转化生物中产生 的基因产物的水平。“共抑制”指产生能够抑制相同的或基本上类似的外源或内源性基因表 达的正义RNA转录物。(美国专利5，231，020)。如本文所用，术语“信使RNA (mRNA) ”指无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的 RNA。如本文所用，术语“无功能基因”指野生型菌株中通常不表达编码蛋白的基因，其 中所述基因是内源的。可以在任何水平上中断无功能基因的表达，例如转录、RNA加工、或 翻译。无功能基因通常很少表达或不表达其编码的蛋白。然而它也可编码酶活性低于野生 型蛋白的修饰蛋白。如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致在基因上稳定 遗传。转化的核酸可以是宿主细胞中保留的质粒形式，或者一些转化的核酸可以被整合进 宿主细胞基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生 物体。如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分 的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是源自任何 来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线 性或环状)，其中多种核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中，该独特构建体能够 将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3'末端非翻译序列一起引入细胞中。术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一种核酸序 列的功能受到另一种核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编 码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列 可以以有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。术语“选择性标记”指一种鉴定因子，通常是抗生素或化学药品抗性基因，该因子 能基于标记基因的效应，即，对抗生素的抗性进行选择，其中所述效应用于追踪遗传的受关 注核酸和/或用于鉴定遗传了受关注核酸的细胞或生物。术语“高浓度混合糖”指培养基中的总糖浓度导致利用木糖的运动发酵单胞菌属 的生长受到抑制。这通常在当总糖浓度高于约100g/L时发生，并且糖浓度越高，该效应越 严重。然而，生长抑制开始发生时的精确糖浓度高度依赖于培养基中的其它组分。术语“可发酵糖”指在发酵过程中能被微生物用作碳源的低聚糖和单糖。术语“木质纤维质”指包含木质素和纤维素的组合物。木质纤维质材料也可包含半纤维素。术语“纤维质”指包含纤维素和包括半纤维素在内的附加组分的组合物。术语“糖化”指从多糖中生产可发酵糖。术语“预处理的生物质”意指在糖化之前已经经过预处理的生物质。“生物质”指任何纤维质或木质纤维质材料，并包括包含纤维素的材料，以及任选 地还包含半纤维素、木质素、淀粉多糖、低聚糖和/或单糖的材料。生物质也可包括附加组 分如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来 源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物或纤维，或草和叶片的混合 物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸 业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于玉米粒、玉米芯、作物 残余如玉米壳、玉米秸秆、玉米纤维、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝 稷、废纸、蔗渣、高粱、大豆、获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水 果、花和动物粪肥的研磨物的组分。“生物质水解产物”指来源于生物质糖化的产物。也可在糖化前预处理生物质。本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文 献中有所描述Sambrook, J. , Fritsch, E. F.禾P Maniatis, Τ. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版；Cold Spring HarborLaboratory : Co Id Spring Harbor, New 丫0浊，1989(下文称为“]\&111丨3衍8，，)；以及 Silhavy，Τ. J.，Bennan，Μ· L.和 Enquist，L. W.， Experiments withGene Fusions ；Cold Spring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor, NewYork, 1984 ； VXR Ausubel, F. Μ.等人，Current Protocols in MolecularBiology,由 Greene Publishing 禾口 Wiley-Interscience 公布于 1987 年。本发明涉及工程化利用木糖的发酵单胞菌属菌株，所述菌株在存在乙酸盐的条件 下具有改善的性能。乙酸盐是发酵单胞菌属的抑制剂，如果在发酵期间乙酸盐存在的话，它 会减少生长和乙醇产量。乙酸盐是运动发酵单胞菌属的代谢副产品，并且它也是经预处理 和糖化的生物质的组分。因此使用来源于生物质的糖用于发酵的一个挑战是克服乙酸盐对 生物催化剂的抑制效应以提高乙醇产量。申请者已经发现当发酵培养基包含乙酸盐时，工 程化中断利用木糖的运动发酵单胞菌属中的内源himA基因改善了发酵性能，包括木糖利 用率和乙醇产量。此外，本发明涉及生产乙醇的方法，其中本发明的发酵单胞菌属菌株在包 含木糖的培养基中培养。禾U用木酵单朐,Ir属宿tir株可使用能利用木糖作碳源的任何发酵单胞菌属菌株作为制备本发明所用的菌株 的宿主。尤其有用的是已经进行了工程化的运动发酵单胞菌属菌株，它能将木糖发酵成 乙醇。内源基因可提供部分代谢途径，或者可以通过任何已知的基因操纵技术进行改变 以提供具有酶活性的蛋白用于木糖代谢。例如，内源转酮醇酶可在建立木糖代谢途径时 补充其它导入的酶活性。如以引用方式并入本文的US 5514583所述，通常已将四种基因 导入运动发酵单胞菌属中表达四种涉及木糖代谢(图1)的酶。这些基因包括编码木糖 异构酶的基因，该酶催化木糖转化成木酮糖，以及木酮糖激酶，该酶磷酸化木酮糖以形成 5-磷酸木酮糖。此外，转酮醇酶和转醛醇酶是戊糖磷酸化途径中的两种酶，它们将5-磷 酸木酮糖转化成连接戊糖代谢与糖酵解Entner-Douderoff途径的中间体(6-磷酸果糖
8和3-磷酸甘油醛)，该途径使木糖代谢成乙醇。编码这些酶的DNA序列可从能够代谢木 糖的多种微生物中的任何一种获得，例如肠细菌和一些酵母以及真菌。编码区的来源包括 黄单胞菌属(Xanthomonas)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、埃希氏菌属(Escherichia)、 红细菌属(Rhodobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆 菌属(Gluconobacter)、牛艮瘤菌属(Rhizobium)、农杆菌属(Agrobacterium)、沙门氏菌属 (Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonads)、和发酵单胞菌属(Zymomonas)。尤其有用的是 大肠杆菌的编码区。将编码DNA序列可操作地连接至运动发酵单胞菌属细胞中表达的启动子如运 动发酵单胞菌属甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GAP启动子)和发酵单胞菌属烯醇酶启 动子(ENO启动子)。编码区可从启动子开始单个表达，或者两个或更多个编码区可接合 到一个操纵子中，从相同启动子开始一起表达。可将所得嵌合基因导入发酵单胞菌属并 保持在质粒中，或者使用例如同源重组、定点整合、或随机整合的方法整合进基因组中。 特别有用的是利用木糖的菌株，它们包括CP4 (pZB5) (US5514583)、ATCC31821/ρΖΒ5 (US 6566107)、8b (US 20030162271 ；Mohagheghi 等人，(2004) Biotechnol. Lett. 25 ；321-325), 和 ZW658(ATTCC#PTA-7858)。附加地将运动发酵单胞菌属菌株工程化以利用除木糖之外的其它糖，该菌株正常 情况下不能利用这些糖，本方法也可使用这种菌株。将利用木糖的运动发酵单胞菌属菌株 进一步工程化以利于阿拉伯糖的一个实例描述于US 5843760，该专利以引用方式并入本文。也可使用进行附加工程化以减少非期望的木糖醇副产物的运动发酵单胞菌属菌 株。这些菌株描述于共有的和共同未决的美国专利申请#11/862566以及未决的US专利 公布#US20080187973 Al，这些专利以引用方式并入本文。描述的菌株ZW800、ZW801-4、和 ZW801-6具有编码葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)的中断基因。GFOR基因的表达中断可 使用下文所述的用于中断himA基因的相同方法完成，该方法使用GFOR编码区(SEQ ID NO 24)的已知序列。围绕GFOR编码序列的DNA序列也可用于一些修饰方法，并且可用于运动 发酵单胞菌属全基因组序列(GenBank保藏号#AE008692)。发现减少GFOR的表达会降低木 糖醇产量并提高乙醇产量。发现himA涉及乙酸盐抗性虽然对乙酸盐对运动发酵单胞菌属生长和产量的抑制效应的基础机制已经相当 了解(Lawford 等人(1993)Applied Biochemistry andBiotechnology 39-40:687-699; Kim 等人(2000)Applied Biochemistry andBiotechnology 84-86 :357_370)，但是仍未鉴 定出该微生物在乙酸盐抗性中起作用的基因。申请人已经令人惊讶地发现对himA基因的 基因操纵使得发酵单胞菌属在存在抑制浓度乙酸盐的情况下性能良好。具体地讲，申请人 已经发现中断发酵单胞菌属himA基因能改善包含乙酸盐的培养基的生长和乙醇产量。用 于发现本文实施例1和2中所述的himA的抗乙酸盐作用的突变文库富集方法是一种完全 无偏方法，并且不基于任何预测结果。未预料到中断运动发酵单胞菌属himA基因能改善该菌株在存在乙酸盐情况下的 性能，因为文献中没有任何该基因在发酵单胞菌属或任何其它微生物中对乙酸盐抗性起作 用的指示或建议。himA基因编码的蛋白本文也称为HimA蛋白，它是整合宿主因子(IHF)的
9α亚基(SEQ IDNO :26)，整合宿主因子是一种也包括由himD基因编码的β亚基的蛋白。因 此，IHF是一种由两种密切相关的亚基构成的异源二聚体蛋白。已经在大肠杆菌中对IHF进 行了研究，研究显示一种DNA结合和DNA弯曲蛋白涉及DNA重组、DNA复制、和基因表达调控 (Friedman(1988)Cell 55 :545_554 ；Arfin 等人(2000) J. Biol. Chem. 275 :29672_29684)。 大肠杆菌中的基因表达谱实验已经证明himA基因失活显著地改变至少120种基因的表达 水平，并且该操纵活化比它抑制的基因更多的基因(Arfin等人(2000) J. Biol. Chem. 275 29672-29684)。也已知大肠杆菌himA基因转录最活跃的时期是当细胞从指数期过渡到稳 定期时，并且认为himA基因产物在此过程中起到作用。因此himA影响广泛的DNA过程，并 且是大肠杆菌中基因表达的调节子，但是这些被认为起到调节作用的许多基因中没有基因 明显地与乙酸盐抗性相关。此外，已经使用微阵列对暴露于抑制浓度乙酸盐后的大肠杆菌 中基因表达的整体分析进行了检查，himA基因不在受该处理影响的86种基因中(Arnold 等人(2001)J. Bacteriol. 183 :2178-2186)。最后，发酵单胞菌属中的himA基因的作用是 未知的。我们也未发现文献中有任何显示himA基因失活导致任何类型的有益效应的报道。 实际上考虑到大量基因和蛋白可能受这一操纵的影响，这将是一个令人惊讶的实例。因此 这一推断是合理的本领域的技术人员不能预测到himA基因的失活将赋予运动发酵单胞 菌属或任何其它微生物较高的乙酸盐抗性。运动发酵单胞菌属HimA蛋白与大肠杆菌同源物(GenBank保藏号NP_416227) 有46%相同。最密切相关的已知蛋白是鞘氨醇单胞菌的HimA同源物(GenBank保藏号 YP_001264041)，使用运动发酵单胞菌属himA编码区(SEQ ID NO :1)作查询序列，通过 tBLASTx搜索NCBI数据库测定它们有67%相同。改变himA基因表达对本发明的利用木糖的运动发酵单胞菌属菌株进行了基因修饰，使得整合宿主因 子α亚基蛋白(HimA)的表达减少或消失。通常通过减少himA基因表达的修饰使得HimA 蛋白表达减少。减少HimA蛋白表达可包括例如减少编码mRNA翻译的修饰，或者降低HimA 蛋白稳定性的修饰。HimA蛋白的表达减少导致在存在乙酸盐的情况下具有改善的性能。可 使用本领域技术人员已知的任何用于减少蛋白表达的基因修饰方法改变HimA的表达。方 法包括但不限于去除整个或部分himA基因、将DNA片段插入himA基因(插入启动子或编 码区)使得编码蛋白不表达、将添加终止密码子或移码的突变导入himA编码区使得功能性 蛋白不表达、以及将一种或多种突变导入himA编码区以改变氨基酸使得表达的活性蛋白 无功能或功能减弱。此外，可通过表达反义RNA或干涉RNA阻止himA的表达，并且可导入 导致共抑制的构建体。本领域的技术人员利用已知的himA编码序列(SEQ ID NO=D以及 围绕himA编码序列的运动发酵单胞菌属DNA序列能轻易地实施所有这些方法，所述序列在 运动发酵单胞菌属全基因组序列中是可用的(GenBank保藏号#AE008692)。如本文实施例5和6所例示的那样，制备基因修饰的himA菌株的尤其适用的方法 是使用himA侧接DNA序列介导的同源重组，该序列与奇放线菌素抗性基因或其它标记基因 结合，导致标记基因插入himA编码区，使得功能性蛋白不表达。此外，标记基因可通过位 点特异性重组结合到位点上，以便对应的位点特异性重组酶的随后表达，所述抗性基因从 himA基因中切除。位点特异性重组留下了中断himA基因表达的重组位点。也可以构建同 源重组载体以在切除标记后在himA基因中留下去除，这是本领域技术人员熟知的方法。
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优选完全消除himA的表达，然而在很大程度上减少himA的表达也是本发明的一 个实施方案。在该实例中，无功能的himA基因指在正常情况下不行使功能，使得存在的编 码蛋白低于正常水平。一些基因失活方法可导致一些持续的低水平表达，例如共抑制。本 文中修饰himA菌株指具有减弱的HimA酶活性或无HimA酶活性的基因修饰菌株。himA修饰菌株的件能本发明的himA修饰的利用木糖运动发酵单胞菌属菌株当在包含木糖也包含乙酸 盐的培养基中培养时具有改善的性能。培养基中希望使用从糖化生物质中制备的糖用于利 用木糖的运动发酵单胞菌属。通常生物质进行过预处理，例如如专利公布W02004/081185 以及共有的和共同未决的US专利公布US20070031918A1所述进行预处理，然后用糖化酶进 行处理，参见 Lynd, L. R.，等人(Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2002) 66 506-577)。包含木糖 和其它糖的预处理和糖化生物质的水解产物通常也包含乙酸盐。生物质中的半纤维素包含 乙酰化木糖残基，并且所述乙酸盐在非常温和的条件下释放。虽然从处理过的生物质中除 去乙酸盐是一个解决问题的方法，加入该步骤将大幅度增加制备纤维质乙醇的费用。因此， 能够工程化运动发酵单胞菌属菌株以提供较高的乙酸盐抗性是一项大幅度的改善。如本文所分析，在存在乙酸盐的情况下改善的性能包括生长速度、木糖利用率、以 及乙醇产量。修饰himA的利用木糖运动发酵单胞菌属菌株相对于具有相同基因特征的菌 株(同基因菌株)具有改善的性能，但是缺少对himA基因的修饰。用于himA基因修饰的 亲本菌株通常用于该比较中。在任何乙酸盐水平上都能看到改善，其中未修饰himA的菌株 不能充分发挥其生长和乙醇生产的潜力。取决于培养基的组成和PH控制，改善通常在乙酸 盐浓度为约5g/L或更高的情况下发生。“乙酸盐抑制”程度也取决于pH，因为抑制物质实 际上是乙酸，而乙酸和乙酸盐的平衡取决于pH。不控制pH的话，运动发酵单胞菌属像其它 革兰氏阴性菌一样迅速酸化培养基。如果PH从5. 8降至4. 8，由于乙酸的 4. 8pKA，乙酸 浓度增加5倍。因此乙酸(抑制剂)的实际浓度取决于培养基的pH以及培养基中存在的 质子化的和非质子化的物质总量。在存在乙酸盐的葡萄糖和木糖浓缩混合物中，未修饰和修饰了 himA的菌株在控 制PH的条件下同样地利用葡萄糖，其中葡萄糖在木糖消耗之前已经消耗了很多。然而，在 发酵晚期，在所有葡萄糖已经消耗完之后，修饰himA的菌株与具有正常himA基因表达的同 基因亲本菌株相比，能够将更多的木糖转化成乙醇。himA基因修饰赋予的较高乙醇生产水平取决于在pH控制条件下的培养基组分， 包括糖含量和不同类型糖的比率，以及存在的其它抑制剂。例如，在存在126g/L葡萄糖、 107g/L木糖和10%乙酸盐的情况下，修饰himA的菌株与未修饰himA的同基因菌株相比， 其乙醇滴定度具有4%的提高。当培养基也包含其它抑制剂时，乙醇产量的提高程度可能甚 至更大。例如，在包括110g/L葡萄糖、90g/L木糖、 9. 5g/L乙酸盐和190mM铵离子(另 一种运动发酵单胞菌属生长抑制剂(Agrawal (1989) Biotechnology and Bioengineering 34 :278-281)，它可以以这一浓度存在于生物质水解产物中)的模拟水解产物培养基中，乙 醇产量具有约11 %的提高，并且木糖利用更完全。因此，在较苛刻的条件下，在修饰himA的 菌株和同基因的未修饰himA的菌株之间的乙醇产量差值可能甚至大于所引用的实例的差 值。例如，在较高糖浓度下，或者当除铵离子和乙酸盐之外还存在来源于水解产物的其它抑 制剂时。因此取决于培养条件，乙醇产量的改善可以是至少约4%或更高。
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发酵牛产乙醇在本发明的方法中，在包含任何糖混合物(也包括木糖)的培养基中培养本发明 的修饰himA的、利用木糖的菌株。具体地讲，本发明的菌株可在生物质水解产物或生物质 水解产物的稀释液中培养。在生物质水解产物中糖化生物质制备糖，所述糖通常可包括木 糖与葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、和/或阿拉伯糖的混合物。优选地是包括木糖和 葡萄糖的混合糖组合物，其中可存在附加的糖。混合物中不同糖的比率可以不同，木糖通常 占糖总量的至少约10%。木糖优选地介于约40%和约60%之间。果糖存在于通过糖化一 些生物质(例如蔗渣)制备的糖中，并且可置换一部分木糖或果糖，使得木糖保持占糖混合 物的至少约10%。此外，阿拉伯糖来源于半纤维素，因此是来源于包含半纤维素的生物质糖 化的混合糖的典型组分。在本发明的菌株发酵期间，木糖是其中一种用作乙醇生产碳源的 糖。为了获得最大的乙醇产量和发酵效率，希望在包含包括木糖在内的浓缩混合物的培养 基内培养本发明的修饰himA的、利用木糖的菌株。这允许直接使用生物质糖化糖，或者使 用其低倍稀释液，从而减少发酵体积，这是商业规模的乙醇生产所期望的。使用较高的糖浓 度以便可制备较高浓度的乙醇。发酵培养基中的混合糖的浓度通常为至少约120g/L，最多 约300g/L。混合糖尤其可用的高浓度介于约150g/L和约235g/L之间。在生产乙醇所需的高浓度混合糖条件下，可在发酵培养基中包括山梨醇用于培养 修饰himA的、利用木糖的运动发酵单胞菌属，该方法如共有的和共同未决的US专利公布 #US20080081358 Al所述，该专利以引用方式并入本文。山梨醇(D-山梨醇和/或L-山梨 醇)可存在于培养基中，其浓度介于约2mM和200mM之间。培养基中较合适的终浓度介于 约2mM和IOOmM之间，优选地介于5mM和20mM之间。甘露糖醇可替代山梨醇用于培养基中， 或者与山梨醇组合用于培养基中。此外，发现可使用半乳糖醇和/或核糖醇替代山梨醇或 甘露糖醇，或者与山梨醇或甘露糖醇组合使用。山梨醇、甘露糖醇、半乳糖醇、核糖醇或它们 的组合都使用与所述山梨醇浓度相同的浓度。运动发酵单胞菌属在其中进行发酵并且产生乙醇的培养基中培养。发酵在不补充 空气、氧气、或其它气体(这可包括各种条件如厌氧、微氧、或微需氧发酵)的情况下运行至 少约24小时，并且可以运行48小时或更长时间。达到最大乙醇产量的时间是不确定的，取 决于发酵条件。如果抑制剂存在于培养基中，通常需要更长的发酵时间。尤其合适的温度介 于约25°C和约40°C的范围内，发酵pH可在约4. 5至约7. 5。尤其合适的温度介于约30°C 和约37°C之间。尤其合适的pH也包括使pH保持在高于乙酸pKA至少约IpH单位的水平， 使得PH介于约5. 8禾Π 7. 5之间，以降低乙酸对乙酸盐的比率。可以在实验室规模的发酵罐中和按比例增加的发酵中(其中生产了商业规模量 的乙醇)，在包含包括木糖在内的混合糖的培养基中培养修饰himA的、利用木糖的运动发 酵单胞菌属。此外，如上所述该培养基可包含乙酸盐。当需要商业生产乙醇时，可使用多种 培养方法。例如，从修饰himA的、利用木糖的运动发酵单胞菌属中的大规模生产可以通过 分批培养方法和连续培养方法进行。经典的分批培养方法是封闭系统，其中培养基的组成 在培养开始时设定并且在培养过程期间不进行人工改变。因此，在培养过程开始时，用所需 的生物接种培养基，并且不向系统中添加任何物质可以发生生长或代谢活性。然而，通常来 说，“分批”培养是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如PH和氧浓度之类的因素。 在分批系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在分批培养物内，细胞通常缓慢通过静态延滞期到达生长期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不 加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。在某些系统中对数期中的细胞通常负责最终产物 或中间产物的批量生成。在其他系统中可以获得稳定或指数后期生成。标准分批式系统的一种变型是补料分批系统。分批补料培养方法也适用于修饰 himA的、利用木糖的运动发酵单胞菌属的培养，并且该方法包括典型的分批系统，除了一 点不同底物随着培养进行以递增方式添加。在代谢产物往往抑制细胞的代谢作用以及其 中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批式系统是有用的。补料分批式系统中的实 际底物浓度难于测量并因而可根据一些可测量因素(例如PH以及废气例如CO2的分压) 进行评估。分批和补料-分批培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于 Biotechnology :A Textbook ofIndustrial Microbiology,Crueger, Crueger,禾口Brock,第 二版(1989) Sinauer Associates, Inc. , Sunderland, MA,或 Deshpande, Mukund V. , App 1. Biochem. Biotechnol.，36，227，(1992)，该文献以引用方式并入本文。乙醇的商业生产也可通过连续培养进行。连续培养是一种开放式系统，其中将设 定好的培养基连续加入生物反应器里，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一 般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用 固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，并且连续从细胞团块中取出有价值的产物、 副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由本领域技术 人员已知的天然材料和/或合成材料组成。连续或半连续培养允许调节影响细胞生长、代谢、或最终产物浓度的一种因素或 任何数目的因素。例如，一种方法将以固定的速率维持限制性营养物质例如碳源或氮水平 并且允许所有其他参数适度。在其他系统中，影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培 养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力维持稳态生长条件，且因此由于培养基 取出的细胞丧失必须针对培养基中的细胞生长速度进行平衡。对于连续培养过程调节营养 素和生长因子的方法以及用于使产物形成速度达到最大的技术是工业微生物学领域众所 周知的，并且各种方法由Brock，同上所述。尤其适用于乙醇生产的发酵方法如下所述。所需修饰himA的、利用木糖的运动 发酵单胞菌属菌株在包含半复合培养基的摇瓶中生长，培养温度为30°C至约37°C，在回旋 振荡器中以约150rpm的转速振荡培养，然后将其转移到包含相似培养基的10L种子发酵 罐中。种子培养物在种子发酵罐中厌氧生长至OD6tltl介于3和6之间，然后将其转移到生 产发酵罐中，其中的发酵参数经最优化用于乙醇生产。从种子罐转移到生产罐的典型种菌 体积在约2%至约20% ν/ν的范围内。典型的发酵培养基包含基本培养基组分如磷酸钾 (1. 0-10. 0g/L)、硫酸铵(0-2. 0g/L)、硫酸镁(0-5. 0g/L)、复合氮源如酵母提取物或大豆产 物(0-10g/L)。培养基中存在终浓度约5mM的山梨醇或甘露糖醇。包括木糖和至少一种附 加糖如葡萄糖(或蔗糖)的混合糖提供碳源，当初始批次碳源(50-200g/L)耗尽时将混合 糖持续加入发酵罐中以最大化乙醇比率和滴定量。碳源进料速率进行动态调节以确保培养 物不过度积聚葡萄糖，过多的葡萄糖会导致积聚毒性副产物如乙酸盐。为了最大化从利用 的底物中生产的乙醇产量，通过磷酸盐的量来限制生物量增长，磷酸盐是初始时成批加入 的或在发酵期间加入的。通过自动加入氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化钠、或其它强碱，控制/ 保持发酵肉汤的PH。将发酵罐温度控制在所需范围内。为了最小化泡沫，按需加入消泡剂
13(任何种类一硅氧烷基的、有机物基的等)到罐中。可任选地使用抗生素(菌株中有该抗 生素的抗性标记)如卡那霉素以最小化污染。任何上述调整条件和这些条件中的附加变化是本领域的技术人员熟知的，它们是 通过本发明利用木糖的、修饰himA的重组发酵单胞菌属菌株生产乙醇的适用条件。
实施例本发明将在下面的实施例中进一步限定。应当理解，尽管这些实施例说明了本发 明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技 术人员可确定本发明的实质性特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可对本 发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。一般方法本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文 献中有所描述Sambrook, J. , Fritsch, E. F.禾P Maniatis, T.的 Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring HarborLaboratory Co Id Spring Harbor, NY(1989)(下文称为 “Maniatis”)；以及 Silhavy，Τ. J.，Bennan, Μ. L.禾Π Enquist，L. W.， Experiments withGene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory : Co Id Spring Harbor, NY(1984) ；and by Ausube 1,F. M.等人，Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Assoc.禾口 Wiley-Interscience 出版，Hoboken, NJ(1987)。缩写的含义如下“kb”指千碱基，“bp”指碱基对，“nt”指核苷酸，“hr”指小时， “min”指分钟，“sec”指秒，“d”指天，“L”指升，“ml”指毫升，“ μ L”指微升，“ μ g”指微克， “ng”指纳克，“g”指克，“福”指毫摩尔，“ μ Μ”指微摩尔，“nm”指纳米，“ μ mol，，指微摩尔， “pmol ”指皮摩尔，“Cm”指氯霉素，“Cmr”指氯霉素抗性，"Specr"指奇放线菌素抗性，“cfu” 指每单位菌落数，“0D_”指在600纳米波长下测得的光密度，“SE”指标准误差，“rpm”指每 分钟转数，“ ”指大约。实施例1生成ZW801-4基于转座子的敲除/超表达文库在利用木糖的运动发酵单胞菌属重组菌株中构建基于转座子的基因组敲除/超 表达文库以筛选抗乙酸盐突变体。使用转座子生成文库有两个首要原则。第一，它是完 全无偏的方法，不需要作任何对在乙酸盐抗性中起作用的该基因的事先了解。第二，易于 鉴定负责所需表型的中断基因，因为它用选择性标记“标记”过。用于生成文库的菌株是 ZW801-4。如以引用方式并入本文的美国专利申请#60/847813所详述，ZW801-4通过中间体 菌株ZW800衍生自ZW658 (ATCC#PTA_7858)。ZW800通过从侧接有野生型IoxP位点的抗奇 放线菌素盒(Sped-盒)的自杀质粒双交换插入编码葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)的基 因进行构建。所得GFOR敲除突变体显示具有降低的木糖醇产量，这是一种木糖代谢的有害 副产物，并且在用葡萄糖和木糖进行的混合糖发酵期间具有更高的乙醇产量。然后通过Cre 介导的Speclr-盒切除将ZW800转化成ZW801-4。消除选择性标记在GFOR开放阅读框的中 间留下一个单独的野生型IoxP位点，它导致产生了过早截去翻译蛋白的框内终止密码子。 此夕卜，作为设计自杀构建体的结果，ZW801-4中的GFOR编码序列在围绕IoxP位点的区域丢 失了 72bp的初始野生型GFOR核苷酸序列。ZW801-4中的突变GFOR编码区的序列是SEQID N0:25。像它的中间前体(ZW800) —样，ZW801-4不生成任何可检测的木糖醇，因为它不 产生功能性GFOR酶。用于生成ZW801 -4基因组敲除/超表达文库的方法基于Epicentre (Madison， WI)转座技术，该技术使用pM0D -2<MCS>转座子构造载体(Transposon Construction Vector, Cat. No. M0D0602)o该质粒包括一种氨苄青霉素抗性基因(ampR)、一个大肠杆菌复 制起点(ori)、和一个多克隆位点，所述多克隆位点位于Tn5转座酶相互作用的两个嵌合末 端(Mosaic Ends, ME)之间。就本发明的专利申请而言，如图2所示将pM0D -2<MCS>转化 成pMODgap/aadA，这是通过将运动发酵单胞菌属的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Pgap)的 Sped-盒(它具有自身启动子)和强组成型启动子插入位于两种ME之间的多克隆位点； Pgap启动子和Sped-盒的取向相反。因此，在转座期间使用该构建体随机插入运动发酵单 胞菌属染色体中的DNA片段包含Spec1-盒和Pgap启动子。将Pgap启动子加到转座子上 以提高文库的遗传多样性，因为它能潜在地改变邻近转座子插入位点的运动发酵单胞菌属 染色体基因的表达。ZW801-4基因组敲除/超表达文库由 17，500种独立突变体组成，并且甘油原液 的滴定量是 7. 1 X IO8Specr菌落形成单位数(cfu)每毫升。这翻译成 1个转座子插入 事件/115种核苷酸，它基于转座子随机插入序列和 2000种平均大小为 Ikb的基因是 约8x的全基因组覆盖度。因为运动发酵单胞菌属的低转化频率，期望无突变体或非常少的 突变体将具有一种以上的转座子插入序列。实施例2 帝诛ZW801-4基于转座子的高祁余/超表达友库以获得H有旁衬虽乙Il盐抗件的突变 体筛选ZW801-4基因组敲除/超表达文库以获得如下所述的抗乙酸盐突变体。然而 在进行该筛选之前，重要的是建立用于突变体富集方法的合适选择条件。目标是为了通过 两个因素中的至少一个找到减缓生长速率的乙酸盐浓度，但仍旧允许将细胞分成几代以便 生长较快的突变体能积聚起来。在葡萄糖和木糖的浓缩混合物中、在与方法有关的条件下 进行筛选也是重要的，因为以前的实验已经表明渗透压和乙酸盐以协同方式抑制生长。最 后，控制ρΗ也是至关重要的，因为真正的抑制化合物是乙酸盐，并且如果不控制ρΗ，则质子 化物质对非质子化物质的比率将显著提高，这是因为细菌细胞酸化生长培养基。例如，如果 PH从5. 8降至4. 8，则乙酸浓度将提高5倍，因为该弱有机酸的ρΚΑ是 4. 8。图3限制两种不同浓度的乙酸盐对ZW801-4的生长速率和生物质终产量的抑制效 应，使用该菌株生成所述文库。这些实验使用乙酸钾，并且下文给定的终浓度是基于以克每 升加入的盐的乙酸盐组分。控制PH的生物反应器包含mRM3S培养基(10g/L酵母提取物， 2g/L KH2PO4, lg/L MgSO4, 5mM 山梨醇)加上 100g/L 的葡萄糖，90g/L 的木糖和 5g/L 或 6g/ L的乙酸盐；pH5.8，温度30°C，以150rpm进行搅拌。基于图3和其它实验显示的结果，选择 5g/L的乙酸盐进行文库筛选，因为该抑制剂浓度满足上述的两个原则。为了富集抗乙酸盐突变体，使用以下规程。将文库甘油原液(0D_ = 4. 3; 7. IXlO8Specr cfu/ml)的等分试样(2mL)加入20mL的SM培养基(10g/L酵母提取物，2g/ L KH2PO4, lg/L MgS04，75g/L葡萄糖，25g/L木糖，初始pH5.8)中，并且将该培养物在30°C培 养1.5小时。在恢复期后，离心收获细胞并重悬于2. OmL的相同生长培养基中。然后将细
15胞悬浮液( 7 X IO6Speclr cfu)的等分试样(IOmL)接种到15mL的mRM3S培养基中，该培 养基包含100g/L葡萄糖，90g/L木糖，和有助于最小化pH变化的4g/L碳酸氢钾；在加入细 胞前用浓磷酸将初始PH调节到5. 8，初始OD6tltl是 0. 0025。这是用于突变体富集方法的 种子培养物。它在30°C下生长至0D_为 0. 5，然后将7. 5mL培养物接种到控制pH的生 物反应器中。150mL的最终培养物包含mRM3S培养基加上100g/L的葡萄糖，90g/L的木糖， 5g/L的乙酸盐，并且通过自动加入KOH将pH保持在5. 8。在30°C下生长 24小时后，将 培养物的等分试样(0D_ 0. 5)转移到其中包含具有相同组合物的新生长培养基的新生 物反应器中，初始0D_为 0.02。基本如上所述另外重复这一步骤六次。通常每隔24-36 小时转移细胞一次，反应器中的初始OD是 0. 02至 0. 03。因此，在两次转移期间有至少 五代。在第七轮突变体富集程序后，制备培养物的甘油原液用于进一步的表征。图4A示出具有高糖和乙酸盐的控制pH的生物反应器实验的结果，该实验在第七 次转移后用富集的突变体培养物进行。该实验的对照物是亲本菌株ZW801-4。种子培养物 在30°C下在SM培养基中生长至0D_为 4. 5，并且用10%的种菌开启生物反应器。最终的 150mL培养物包含mRM3S培养基加上100g/L葡萄糖，90g/L木糖和6g/L乙酸盐。在150rpm 下搅拌，分别将PH保持在5. 8，将温度保持在30°C。在不同时间将1. OmL的培养物等分试样 取出，使用配备折射指数检测器(Hewlett-Packard，Palo Alto, CA)的HP 1100进行HPLC 分析，以测定发酵肉汤中存在的葡萄糖、木糖、和乙醇的浓度。在HPLC分析之前，离心移除 细胞并通过0.22 μ m的乙酸纤维素Spin-X离心管过滤器(Costar，catalog number 8160) 过滤上清液以除去小颗粒。在AminexHPX-87H柱(Bio-Rad)上分离化合物，该柱子在55°C 下，在等度条件下使用0. 6mL/min的流速并使用0. OlN H2SO4作流动相。使用已知浓度的可 靠标准品定量受关注的峰值，结果用g/L表示。图4A提供的结果显示富集的突变体文库培养物在发酵晚期具有较快的木糖利用 速度和较快的乙醇生产速度。注意这发生在消耗完所有葡萄糖后，并且乙醇浓度接近毒性 水平。然而，到两个实验的末期培养物已经消耗了所有糖并制备了相同量的乙醇。当使用 浓度略高的糖(105g/L葡萄糖和100g/L木糖)和较多乙酸盐(9g/L)重复该实验时，能观 察到相似的现象(图4B)，因此证实该结果是可复制的。实施例3突变株的基因表征为了了解在选择过程中富集了何种类型的突变体，在第二次生物反应器实验(图 4B)期间从文库培养物中分离单菌落。在24小时的时间点取出培养物的等分试样，细 胞在包含MMG培养基(50g/L的葡萄糖，10g/L的酵母提取物，5g/L的蛋白胨，2. 5g/L的 (NH4) 2S04,0. 2g/L的K2HPO4,和ImM的MgSO4)的琼脂板上生长。在厌氧条件下，在30°C培养 48小时后，随机选择十七种所得菌落进行DNA序列分析以测定转座子插入的位点。使用以 下方法进行该分析。将所述菌落在50 μ L水中稀释，并且使用GenomiPHI扩增试剂盒(GE Healthcare Life SciencesCat. No. 25-6600-1)扩增基因组 DNA。简而言之，将 ImL 细胞 悬浮液加入到9mL Lysis试剂中，并且将混合物加热至95°C，保持3分钟，然后立即冷却至 4°C。接下来将9μ L酶缓冲液和IyL Phi 29 DNA聚合酶加入溶解样本中。在30°C扩增 18小时后，在65°C下加热灭活聚合酶10分钟，然后将样本立即冷却至4°C。然后向扩增样本(SyL)的等分试样中加入16yL的BigDye
16v3. ISequencing Reagent(PN#4337457 Applied Biosystems, Foster City, CA)、 1 μ L 的 Thermofidelase (Fidelity Systems， Gaithersburg， MD)、12 μ L 的分子 生物级水(Mediatech，Inc.，Hemdon, VA)、和 3 μ L 的 10 μ M 引物SpecT-FOR (SEQ ID No 2 :GTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTC)或 SpecT-Rev (SEQ ID No 3 CTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGG)。注意这些引物均与用于生成ZW801-4基因组敲除文 库的转座子部分的Sped-盒杂交，但是它们的取向相反。然后如下进行热循环测序反应 96 0C 3分钟，随后进行200个循环(95°C 30秒+55°C 20秒+60°C 2分钟)，4°C贮存。在 测序之前，使用Edge Biosystem(Gaithersburg, MD)纯化板移除未掺入的ddNTP。将全部 40- μ L测序反应混合物吸移到预离心的96孔纯化板的一个孔中，所述板在SorvallRT-7冷 冻离心机中，在5000x重力条件下离心5分钟。然后将纯化后的反应物直接置于Applied Biosystems 3730DNA测序仪上，并用自动碱基判定测序。引人注目的是，进行测序的所有17种菌落都具有插入himA开放阅读框(运动发 酵单胞菌属基因组(GenBank保藏号AE008692)从核苷酸#1138224至#1138565的反向互 补序列)的转座子，并且鉴定了三个不同的插入事件。十一种菌落(包括AcR#3，参见下 文)在nt#l 138413具有转座子插入序列，四种菌落在nt#l 138267具有插入序列，两种菌落 在nt#l 138508具有插入序列。T因此，所有三个插入事件发生在DNA的250bp片段中。在 第七轮突变体富集程序后65%的himA敲除突变体在nt#l 138413具有转座子插入序列，这 一事实表明该事件可赋予比其它两个插入事件更快的生长速度或更高的存活能力。序列分 析也观察到另一个令人感兴趣的结果。虽然理论上Tn5转座子能够将其自身以两个方向插 入DNA，它从选择方法中回收的所有三个插入事件中具有相同的取向，S卩，Pgap启动子指向 与himA开放阅读框相反的方向。上述测序结果清楚地表明图4示出的实验具有混合种群的细胞，而不是纯化菌 株。因此，选择AcR#3进行进一步表征himA表型，因为该菌株在nt#l 138413具有转座子插 入序列，这是最频繁的分离事件。实施例4himA基因失活在方法相关的条件下对乙酸盐抗性和发酵性能的效应AcR#3比 ZW801-4对乙酸盐的抗性更强用于突变体选择方法的生长培养基除了抑制水平的乙酸盐之外还包含高浓度的 葡萄糖和木糖。因此在第七轮富集后观察到的发酵性能改善(图4)可能与渗透压或在木糖 上较好的生长有关，因为木糖不像葡萄糖一样容易利用。也可能已经富集了的抗乙醇的突 变体，因为推测它们在使用的实验条件下也将生长较快或者存活时间较长。为了排除这些 其它的可能性并且了解himA基因失活是否真地赋予较高的乙酸盐抗性，在以下条件下比 较菌株AcR#3和亲本菌株ZW801-4。实验在33°C下，在摇瓶(在50mL管中有20mL培养物) 中进行，并且生长培养基包含10g/L酵母提取物，2g/L KH2P04, lg/L MgSO4, IOmM KHCO3 (有 助于保持PH)，50g/L葡萄糖和0、8、或12g/L乙酸盐，该乙酸盐以钾盐的形式加入；乙酸盐 的浓度基于钾盐的乙酸盐组分决定。在加入细胞之前用磷酸将初始PH调节至5. 8，并且在 往复振荡器上轻轻搅拌培养物(150rpm)。种子培养物在无乙酸盐的相同培养基中生长至指 数期后期(0D_ 1. 4)，实验培养物的初始0D_是0. 03。必须注意到这些条件是在缺少乙 酸盐情况下的运动发酵单胞菌属生长的理想条件，因为无渗透压并以优选的葡萄糖底物作为碳源。此外，该实验中能生成的乙醇的最高浓度是< 25g/L，它对运动发酵单胞菌属生长 仅有较小效应或无效应。在缺少乙酸盐的情况下，AcR#3和ZW801-4的生长动力学相似，并且根据如图5示 出的最终的OD6tltl值，它们生产相同量的生物质。T然而AcR#3菌株(图5B)具有比亲本菌 株(图5A)更高的乙酸盐抗性。例如，ZW801-4生长在8g/L乙酸盐条件下几乎完全停滞， 然而该抑制剂浓度仅对AcR#3具有可忽略不计的效应。实际上，himA敲除突变体对12g/L 乙酸盐的抗性高于ZW801-4对8g/L乙酸盐的抗性。重复该实验能够获得相同的结果。重 要的是要记得，当生长培养基的PH不受控制时乙酸盐的抑制能力较强，如图4所示的在生 物反应器中的实验那样。在无PH控制的摇瓶实验中，细胞酸化培养基并且乙酸/乙酸盐的 比率显著提高，如上所述该质子化的物质抑制细菌生长。因为钾离子可能至少部分地导致上述实验中观察到的对两种菌株的生长抑制，其 它来源的乙酸盐进行测试是重要的。用于这组实验的条件与上述的那些条件相同，但是该 分析也包括乙酸钠和乙酸铵。在所有情况下乙酸根阴离子的浓度是8g/L(如上文定义)。 图6示出了在43小时时间点不同培养物的最终0D_值。ZW801-4(图6A)被8g/L的乙酸盐 强烈抑制，无论使用的是哪种乙酸盐。这一观察结果清楚地指示在这些实验中的主要抑制 剂是乙酸，而乙酸盐中的一价阳离子在所使用的浓度下对生长仅有较小效应或无效应。虽 然所有三种乙酸盐也对AcR#3(图6B)的生长具有负面影响，当乙酸盐浓度仅为8g/L时，对 该菌株的抑制不显著。图5和图6示出的实验合在一起，提供了 AcR#3比亲本菌株ZW801-4 乙酸盐抗性更强的明确证据。AcR#3比ZW801-4在高糖加乙酸盐混合物中表现更好当在与用于“混合种群”突变体相同的实验条件下测试AcR#3时(图4B)，它的表 现胜过ZW801-4，并且在两种培养物之间的差异比较早实验中的差异更大(图7)。与以前 的结果一致，所述改善仅仅在发酵后期，在消耗了所有葡萄糖并仅有木糖作剩余碳源后是 明显的。实际上，图7示出的时间段接近的检查揭示AcR#3的葡萄糖利用和乙醇生产的初 始速率些微较慢。然而，在发酵后期，在消耗了所有葡萄糖后，根据木糖利用曲线的斜率，明 显地看出AcR#3能够以比ZW801-4更快的速率将木糖转化成乙醇。在上述实验中不能评估AcR#3的全部潜力，因为使用的条件下，甚至对照菌株也 能够在实验末期利用所有糖。为了消除这一限制，使用较严苛的条件再次测试AcR#3和 ZW801-4。温度从30°C升温至33°C，并且使用更高浓度的葡萄糖和木糖。种子培养物在30°C 下在SM培养基中生长至OD6tltl为 4. 4，并且用10%的种菌开启生物反应器。最终的150mL 培养物包含mRM3S培养基加上126g/L葡萄糖，107g/L木糖和10g/L乙酸盐。在150rpm下 搅拌，分别将PH保持在5. 8，将温度保持在33°C。ZW801-4进行三次平行实验，AcR#3进行两 次平行实验，表1给出了葡萄糖、木糖、乙酸盐、和乙醇的终点值(67小时)(平均值士SE)。 如实施例2所述进行发酵肉汤的HPLC分析，表中所有化合物的浓度以g/L表示。在这些较 严苛条件下AcR#3比亲本菌株ZW801-4消耗多 10%的木糖并生产多 4%的乙醇。表1 在控制pH的发酵罐中的木糖、乙醇、和木糖醇的终点倌，其中ZW801-4和 AcR#3菌株在高糖和乙酸盐中生长。
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权利要求
发酵单胞菌属的重组微生物，所述发酵单胞菌属的重组微生物能够在混合糖培养基中通过发酵利用木糖来生产乙醇，所述微生物包含至少一种基因修饰，所述基因修饰减少himA基因编码的内源整合宿主因子α亚基(HimA)蛋白的表达。
2.权利要求1的重组微生物，其中所述基因修饰是所述himA基因的修饰，所述修饰选 自插入、去除、突变、共抑制、和反义RNA表达。
3.权利要求2的基因修饰，其中使所述himA基因不具备功能。
4.权利要求3的基因修饰，其中通过同源重组将插入导入所述himA基因中。
5.权利要求1的微生物，所述微生物包含编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转 酮醇酶的异源基因。
6.根据权利要求5的微生物，其中所述编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶 和转酮醇酶的异源基因来自细菌，所述细菌选自黄单胞菌属(Xanthomonas)、克雷白氏 杆菌属(Klebsiella)、埃希氏菌属(Escherichia)、红细菌属(Rhodobacter)、黄杆菌 属(Flavobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、根瘤菌 属(Rhizobium)、农杆菌属(Agrobacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)和假单胞菌属 (Pseudomonads)。
7.根据权利要求6的微生物，其中所述异源基因来自大肠杆菌。
8.根据权利要求7的微生物，所述微生物被鉴定为菌株ZW801-4::AhimA或菌株 AcR#30
9.权利要求1的微生物，其中所述微生物在存在乙酸盐的情况下与无基因修饰的微生 物相比具有改善的发酵性能，所述基因修饰减少所述内源整合宿主因子α亚基(HimA)蛋 白的表达。
10.权利要求9的微生物，其中所述微生物在存在乙酸盐的情况下比同基因菌株生产 多至少约的乙醇，所述同基因菌株不减少所述内源整合宿主因子α亚基(HimA)蛋白的表达。
11.用于生成权利要求1的微生物的方法，所述方法包括a)提供能够在合适条件下利用木糖生产乙醇的重组发酵单胞菌属菌株，其中所述菌株 的基因组表达内源整合宿主α亚基蛋白(HimA)；以及b)修饰所述菌株的基因组，其中所述修饰减少所述内源整合宿主因子α亚基(HimA) 蛋白的表达。
12.根据权利要求11的方法，其中所述(a)的重组发酵单胞菌属菌株选自ATCC31821/ pZB5、运动发酵单胞菌8b、ZW658、ZM4 (pZB5)、ZW800、ZW801-4、ZW801-6和运动发酵单胞菌 CP4:pZB5。
13.根据权利要求11的方法，其中所述基因修饰是所述himA基因的修饰，所述修饰选 自插入、去除、突变、共抑制、和反义RNA表达。
全文摘要
通过筛选发酵单胞菌属突变体文库，发现himA基因涉及乙酸盐对发酵单胞菌属性能的抑制效应。将利用木糖的发酵单胞菌属进一步工程化以减少himA基因的活性，发现其当在包含木糖和乙酸盐的培养基中培养时，与亲本菌株相比乙醇产量提高。
文档编号C12P7/06GK101970671SQ200880114111
公开日2011年2月9日 申请日期2008年10月30日 优先权日2007年10月30日
发明者K·克诺克, L·陶, M·A·弗兰登, M·张, P·G·凯米, P·V·维塔宁, Y·张, Y-C·仇 申请人:纳幕尔杜邦公司;可持续能源联盟有限责任公司