用于校正传感器元件的方法和装置的制作方法

专利名称：用于校正传感器元件的方法和装置的制作方法
用于校正传感器元件的方法和装置 本发明涉及用于校正传感器元件的方法和装置，尤其是用于校正在微阵列装置上 的传感器元件的方法和装置。在核酸分析技术中，基于微阵列的方法的发展在过去几年里取得了快速的进步。 微阵列装置是探针分子矩阵的装置，探针分子安置在传感器上的单个且可寻址的位置中， 从而阵列装置中的每个位置形成能探测目标分子的传感器元件。在核酸分析技术中，通常 使用寡核苷酸探针作为探针分子，该探针分子例如在芯片形式的装置中固定(“点(spot)”) 在载体上的栅格状矩阵里。通过与互补的目标核酸杂交在寡核苷酸探针上形成结合。然后 能用很多可选择的方法检测这种结合，从而能够基于结合事件的获知目标核酸(Z)的存在 和如有必要的话也定量确定目标核酸(Z)的存在。光学方法、电化学方法、重量分析方法、 磁学方法和其他的合适的方法可以用作探测原理。在光学方法中，通过标记物标记目标核酸及由寡核苷酸探针和目标核酸形成的杂 交物，标记物导致产生了光可检测的信号。标记物可以是染料、荧光团、生色团、嵌入染料、 荧光染料或者类似物。结合事件发生时，在每个寡核苷酸探针的可寻址位置上光可检测的 信号可以通过例如CCD照相机检测到，该CCD照相机能够描绘整个阵列。在电化学探测方法中，寡核苷酸探针固定在电化学传感器上。通过标记物标记目 标核酸及由寡核苷酸探针和目标核酸形成的杂交物，其中，每个寡核苷酸探针位置上的标 记物局部地改变传感器元件的电化学特性，从而能够测量电信号，例如电压、电流、电容变 化等等。相关方法可以从DE 101 26 341中获知。这里用生物素标记目标核酸，在目标核 酸与寡核苷酸探针杂交之后，用抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶标记已经结合的目标核酸， 并向碱性磷酸酶提供酶底物，磷酸酶使酶底物在转化时产生局部改变导电性的产物，从而 在其上固定了寡核苷酸探针的电极上可测量到局部的电流增加。在重量分析法中，检测因目标核酸和寡核苷酸探针杂交时的质量改变而产生的信 号。已知的是，例如，所谓的FBAR方法和Kantilever方法。在磁学检测中，寡核苷酸探针固定在磁传感器元件上，例如，GMR传感器。目标核 酸及由寡核苷酸探针和目标核酸形成的杂交物可以用顺磁性粒子(例如氧化铁纳米粒子) 标记，从而在结合目标核酸时在寡核苷酸探针位置上可检测到局部的磁性改变。在所有的检测原理里出现的问题是如下的事实各个传感器元件间会出现质量差 另IJ，这正好在高灵敏和量化或者半量化的测量方法时会导致强度不同的信号。也会因为其 他的外部影响(例如温度波动或温度梯度)，因为传感器的表面流体学导致的流动波动或 者流动梯度和其他的因素，导致不是所有的在微阵列装置中的传感器元件都具有相同的灵 敏度或者在相同浓度的目标核酸(Z)时产生相同信号强度的信号。例如已知的是，位于微 阵列装置边缘的传感器元件和位于微阵列装置中间的传感器元件具有不一样的表现行为。可靠的和无误的基于微阵列的阵列运作需要同样是可靠的和无误的质量控制 (QualitStskontrolle)。首先其必须包含必要的阳性对照元件和阴性对照元件。为此，在理想 的情况下应该通过两点校正法来校正每个传感器元件，这就是说，每个传感器除了装有待 测试样之外还装有两个已知的试样(试样浓度)，并记录下每个测量信号。
这样的方式尤其对于有高比例的传感器元件或可寻址位置的微阵列系统是非常 难以实现的，因为两点校正系统通常要求复杂的和高费用的措施。在本领域内已知的是，这 个问题可以通过在微阵列装置中设置不同的传感器元件位置作为对照传感器元件(对照 点(Kontroll-Spot))来解决或者避免。然而这有如下的缺陷，此时必须假设不同传感器的 表现行为绝对一致，并且设置的对照点代表所有的传感器元件。
本发明的任务是实现简单的和成本低廉的两点校正法，该方法可以在同样的传感 器元件上实施，这种传感器元件也用作目标核酸的传感器。根据本发明，这个目标通过权利 要求1所述的方法和权利要求14所述的装置得以实现。在从属权利要求中描述了本发明 的有利的改进方案。本发明涉及校正传感器元件的方法，传感器元件具有固定的寡核苷酸探针，传感 器通过所述寡核苷酸探针检测(erfassen)目标核酸(Z)的结合，该方法包括a)使传感器元件接触对照核酸(K)，对照核酸的解链温度Tm(K)低于目标核酸的 解链温度Tm (Z)；b))在温度T[p] < Tm⑷时使对照核酸⑷杂交至核苷酸探针上，获得阳性对照 信号；和，任选地c)改变严紧条件使得T [n] > Tm(K)，并获得阴性对照信号。本发明进一步涉及根据权利要求1的校正传感器元件的方法，包括a)使传感器元件接触包含对照核酸(K)和目标核酸(Z)的混合物，其中，对照核酸 的解链温度Tm⑷低于目标核酸的解链温度Tm(Z)；bl)在温度T[p] < Tm⑷时使混合物杂交至寡核苷酸探针上，获得阳性对照信 号；b2)在测量温度T = T [测量]时改变严紧条件，使得Tm(K) < T [测量]< Tm(Z)，获得测量信号(Messsignal)；和，任选地c)改变严紧条件使得T [n] > Tm⑷，并获得阴性对照信号。Tm(K)是在提供的溶液条件下对照核酸的解链温度。Tm(Z)是在提供的溶液条件下目标核酸的解链温度。T[η]是实施阴性对照信号测量的温度。T[ρ]是实施阳性对照信号测量的温度。T [测量]是实施测量信号测量的温度。优选通过提高温度实现改变严紧条件。或者，可以通过改变溶剂条件或者通过改 变溶剂条件和温度的组合实现改变严紧条件。按照本发明的另一个方面，在不同的温度T[测量1-η]时测量多个测量信号1至 η，其中 Tm(K) < T[测量 1-n] < Tm(Z)。按照本发明的另一个方面，该方法可以针对设置在阵列装置中的大部分传感器元 件而实施。按照本发明的另一个方面，目标核酸和对照核酸可以用可检测的标记物进行标记。目标核酸和对照核酸可以直接标记(例如，用染料、酶或者类似物)，也可以间接 标记(例如，通过生物素、带有标记物的二级结合配偶体(sekundarerBindimgspartner)的识别序列或者类似物)。根据本发明的另一个方面，可检测标记物可以是酶标记物，其可以使底物转化成 传感器元件可检测的产物。根据本发明的另一个方面，可以在步骤(a)之前使传感器元件接触可检测产物， 以便获得第一校正信号。根据本发明的另一个方面，可以在另一传感器元件上，分别在温度T[p]、T[测 量]、T[测量1-η]和Τ[η]时附加获得温度补偿信号，可检测标记物直接固定在该另一传感 器元件上。根据本发明的另一个方面，传感器元件是电化学传感器元件，目标核酸和对照核 酸用可检测标记物进行标记，该标记物是酶标记物，其使底物转化成传感器元件可检测的 产物。酶标记物尤其可以是磷酸酶。根据本发明的另一个方面，优选地，对照核酸(K)的解链温度Tm(K)比目标核酸 (Z)的解链温度Tm(Z)至少低5°C，更优选地，对照核酸(K)的解链温度Tm(K)比目标核酸 (Z)的解链温度Tm(Z)至少低10°C。根据本发明的另一个方面，优选地使用具有随机化的十聚核苷酸序列 (Decaoligonukleotidsequenz)的核酸组合物作为对照核酸。也可以使用随机化的6、7、8、 9、11、12、13、14或者15聚物。特别优选的是生物素化的寡聚物。带有特异性识别序列的对 照核酸同样是可能的，这种特异性识别序列结合至传感器元件的寡核苷酸探针的特异性互 补序列上，其中，寡核苷酸探针上的互补序列不结合至目标核酸上。此外，本发明涉及一种装置，该装置包括-至少一个传感器元件，该传感器元件具有固定在上面的核苷酸探针，所述传感器 元件通过该核苷酸探针检测目标核酸的结合，其中寡核苷酸探针和目标核酸的结合复合物 具有解链温度Tm(Z)；_用于改变传感器元件温度的加热和/或冷却手段；-至少一种对照核酸，其能和核苷酸探针形成结合复合物，所述结合复合物具有低 于Tm (Z)的解链温度Tm(K)。根据本发明的另一个方面，该装置还包括大部分的设置在阵列装置中的传感器元 件。传感器元件可以作为微阵列(例如，生物芯片)提供。阵列装置可以作为微流体设备 (mikrofluidische Vorrichtung)的一部分得以实现。微流体设备是这样一种设备在该 设备中，能够在微升体积范围内操作流体，特别是液体。根据本发明的另一个方面，装置中的对照核酸以干试剂的方式储存。对照核酸通 过引入相应的溶剂(例如，缓冲溶液)溶解，然后能与寡核苷酸探针结合。根据本发明的另一个方面，该装置以试剂盒(Kit)的形式提供，该试剂盒包含设 备和组合物，所述设备包含加热和/或冷却手段以及至少一个传感器元件，所述组合物包 含对照核酸。根据本发明的另一个方面，对照核酸用可检测标记物进行标记。根据本发明的另一个方面，可检测标记物是酶标记物，其可以使底物转化成传感 器元件可检测的产物。
根据本发明的另一个方面，可检测标记物直接固定在另一传感器元件上。根据本发明的另一个方面，该装置的传感器元件是电化学传感器元件，对照核酸用可检测标记物进行标记，所述标记物是酶标记物，其使底物转化成传感器元件可检测的产物。根据本发明的另一个方面，该装置包括作为对照核酸的核酸组合物，其包含随机 化的十聚核苷酸序列。根据本发明的另一个方面，该包含随机化的十聚核苷酸序列的核酸是生物素化 的。就本发明而言，传感器元件是在目标核酸(Z)结合到与传感器元件联合的寡核苷 酸探针上时能获得测量技术可用信号的元件。这种信号可以是定性或者定量的信号。这种 信号优选为定量的，这就是说，信号强度与结合的目标核酸的量相关联。寡核苷酸探针是一种作为探针结合目标核酸用的寡核苷酸。作为寡核苷酸探针优 选地是单链核酸。核苷酸探针可以由DNA、RNA或者合成的或修饰的核酸类似物构成。寡核 苷酸探针优选地具有确定的序列。优选地，寡核苷酸探针具有大于10个核苷酸的长度，更 优选地具有大于20个核苷酸的长度。“固定的”寡核苷酸探针表示的是这样一种核苷酸这 种核苷酸在空间上被固定在传感器元件上或者在空间上离传感器元件足够近地被固定，以 至于在传感器元件探针上进行测量的条件下，保持其在传感器元件上的位置或者离传感器 元件足够近的位置。这种寡核苷酸探针能直接设置在传感器元件上，例如，在电化学传感器 元件的电极上或者离传感器元件在空间上相当的近，也可以是间接的，例如，通过间隔分子 固定或者通过隔室固定，也就是说，通过定界(Abgrenzung)或者包囊(Umschlie β ung)固 定。对照核酸就本发明而言是同样能杂交至寡核苷酸探针的核酸，其中，寡核苷酸探针和对 照核酸(K)的杂交物总是具有比寡核苷酸探针和目标核酸(Z)的杂交物更低的解链温度。 这通常通过如下得以实现，对照核酸与寡核苷酸探针杂交的互补链的长度短于目标核酸与 寡核苷酸探针杂交的链长。接下来更详细地解释这方面。术语“杂交”包括在可以通过互 补链形成杂交物的条件(温度、PH值、缓冲液组成、盐浓度)下使两个核酸(例如，寡核苷 酸探针和对照核酸)接触。术语“获得信号”包括所有必要的步骤和前提，以便能在传感器元件上导出显示核 酸结合至与寡核苷酸探针的信号。在直接标记时，用染料标记目标核酸，信号可以例如直接 通过CCD照相机获得。在间接标记时，例如，通过目标核酸或者对照核酸的生物素化时，就 本发明而言，术语“获得信号”包括所有其他必需的步骤(用抗生蛋白链菌素_酶复合物的 温育过程、清洗步骤、用酶底物温育的过程和测量信号的测量)。就本发明而言，阳性对照信号是在具体提供的条件下(温度等等)相应于最大信 号强度的信号，且该信号强度能在传感器元件上输出。这例如是这样的情况所有的单个寡 核苷酸探针分子均已结合了结合配偶体的情况。在本发明上下文中术语“阴性对照信号”是对于各传感器元件在具体测试条件下 相应于最小信号或者背景噪音的信号。这例如是这样的情况没有一个寡核苷酸探针分子 在获得信号时已结合了结合配偶体。阵列装置表示若干传感器元件的装置，传感器元件设置在若干可寻址位置子上。可检测标记物在本发明的上下文中表示如下的标记物，通过这种标记物能够直接或者间接地获得可测量信号。该标记物可以是直接标记物，例如，染料、荧光染料、放射性标 记等等。同样地，术语可检测标记物也包括间接标记，在间接标记时为了获得可测量信号需 要其他的步骤，例如，生物素标记、抗体标记、酶标记等等。寡核苷酸探针碱对的序列和其长度取决于很多的考虑。寡核苷酸探针序列的长度 不能超过确定的长度。寡核苷酸探针和目标核酸的双链体的解链温度随着寡核苷酸探针长 度的增加而升高。解链温度(Tm)是当寡核苷酸探针从目标核酸中熔解(解链)的温度，换 一种说法，在低于其解链温度时，寡核苷酸探针与目标核酸杂交。核酸双链的解链温度在稳 定的外部条件(溶剂条件)总是不仅取决于其长度也取决于其核苷酸组成。G-C碱基对通 过三个氢桥得以稳定，T-A碱基对仅通过两个氢桥得以稳定。因此G-C碱基对“更稳定”。 解链温度随着G核苷酸和C核苷酸的数目的增加更大程度地升高。有很多方法计算解链温 度，结果均以。C表示GC方法是简单的但是不准确的方法
Tm(°C ) = (64+41*(% GC-16. 4)) °C其中％ GC是G碱基和C碱基在碱基总数中的比率。“盐调节的(salt adjusted) ”方法较准确，其涉及反应物中的Na+离子浓度Tm(°C ) = (100. 5+41*% GC-(820L)*16. 61og[Na+]) °C其中L是碱基的总数，[Na+]表示Na+离子浓度。另一个方法是“碱基堆积”方法，在该方法中杂交时形成螺旋的焓项和熵项均考虑 在内。溶剂的其他组成部分对解链温度也有影响。尤其是当使用甲酰胺调控杂化条件 时。使用以下公式考虑这些参数来估算温度Tm = 81. 5+0. 41*(% GC)+16. 61og[Na+]-(820:L)-0. 61*(% 甲酰胺)_1· 错 配)其中％错配=错配碱基的比例。杂化温度最佳地应该低于DNA/DNA杂交物的解链 温度约5-10°C，在DNA/RNA杂交物的情况下5°C就足够了。当序列更短时使用其他近似公式。为了估算杂化温度，在实践中，(4+2)规则得 到了证实每个胞嘧啶和每个鸟嘌呤计4°C，每个腺嘌呤和每个胸腺嘧啶核苷计2°C。这个 总和减去5-10°C得出大约的杂化温度。各种近似计算解链温度的公式表明，除了探针长度 (互补区域的长度)之外，GC含量、盐浓度和溶剂性质也决定解链温度。参数的组合构成了 严紧条件，其决定了两个互补的或者至少部分互补的核酸链是否可以杂交。相应地可以通 过温度、盐浓度、溶剂参数的变化改变严紧条件，并调控杂交(也称为“复性”)和双链的解 链或者熔解。同时也存在很多可以用来计算序列的解链温度的软件。现在参照实施例和


性且示例性地描述本发明。各附图表示图1 使用本发明方法的示例性传感器元件的示意2 本发明的第一实施方式的示意图；图3 本发明的另一实施方式的示意图；图4 本发明的另一实施方式的示意图；图5 本发明的另一实施方式的示意图6 本发明的另一实施方式的示意图。在图1中是示例的具有测量装置(带有两个电极2和3)的传感器元件，其中存在 附加的金平面(GoWfMche) 5，寡核苷酸探针100固定在金平面5上。或者，相应的寡核苷 酸探针也能直接地固定在电极2、3上。例如，在DE10126 341 Al中详细地描述了相应的传 感器元件。
图1示意了具有平坦表面的基底1，其例如由硅芯片的晶体表面得以构成。在基 底1上，在给定的阵列位置上实现电化学探测器2、3的阵列，通过电化学探测器2、3得以用 酶偶联反应进行生物分析研究。具体地，在生物分析研究中，寡核苷酸探针标为100，分析 物分子标为200，所谓的酶标记物标为300。寡核苷酸探针100特异性地与互补分析物分子 200 (该分子可以是目标核酸或者对照核酸)反应，并且酶标记物300以阵列位置特异性的 方式固定。接着通过酶标记物的催化作用使酶底物400转化成产物500。在传感器元件上借助电极2、3可测量到底物/产物的减少/增加。作为可检测产 物500的实例可以提到对氨基苯酚/醌亚胺氧化还原对 对氨基苯酚醌亚胺2个电子以及2个H+离子参与了相应的氧化还原过程。这个系统可以应用于例如酶偶联的检测反应中。这里，酶“碱性磷酸酶”作为标记 物和强化物质被应用。碱性磷酸酶能够使对氨基苯基磷酸酯分解成对氨基苯酚和磷酸盐。 对氨基苯基磷酸酯相应的对氨基苯酚在电极系统里被氧化，氨基苯酚/醌亚胺氧化还原形成循环。 然后，信号可以作为在反应时间⑴内的电流强度⑴的增加在电极上输出，其中，信号强 度 S = dl/dt。在图2中示出了本发明的第一实施方式的示意图。在T[p] <Tm⑷的温度时，传 感器元件上加载有对照核酸(K)，其中Tm(K)是在给定的溶剂条件下寡核苷酸探针和对照 核酸的双链体的解链温度。对照核酸的浓度足够的高，以至于所有的游离的寡核苷酸探针能被饱和。在温度T[p]时，对照核酸分子杂交至所有的游离的寡核苷酸探针。对照核酸是 经生物素(B)标记的。然后添加抗生蛋白链菌素结合的酶(E)，该酶结合生物素(B)及可以 转化底物(未显示)，从而可以在传感器元件上输出信号(+)。在温度Τ[ρ]时，所有的寡核苷酸探针被对照核酸饱和从而得到最强信号作为阳 性对照信号。接着提高温度至T [n] > Tm(K)。寡核苷酸探针和对照核酸的双链体解链，以至于 对照核酸被释放并能(和酶一起)漂洗除去。在温度Τ[η]时，所有的寡核苷酸探针再次不 饱和的，以至于没有测量到信号(_)或者只测量到噪音信号，并得到最弱的信号作为阴性 对照信号。阳性对照信号和阴性对照信号的数值可以存储在，例如，控制设备中，所述数值能 进一步用作将来的参考数值。可以用这种方式对微阵列的各个位置进行具体的校正，每个 阵列位置(每个“点”)通过图2中描述的方法校正。这也可以用于微阵列的质量控制。在图3中显示了另一实施方式的示意图。传感器元件上加载有试样，假定该试样 含有适合相应寡核苷酸探针的目标核酸(Z)。此外添加对照核酸(K)。温度是T [P] < Tm(K)， 其中Tm(K)是在给定的溶剂条件下寡核苷酸探针和对照核酸的双链体的解链温度(附加 地，Tm(K) <Τ[Ζ])。由目标核酸和对照核酸形成的混合物的浓度足够的高，以至于所有自 由的寡核苷酸探针能被目标核酸或者对照核酸饱和。在温度Τ[ρ]时，目标核酸和对照核酸 杂交至所有的游离的寡核苷酸探针。用生物素(B)标记对照核酸。然后添加抗生蛋白链菌 素结合的酶(E)，该酶结合生物素(B)并可以转化底物(未显示)，从而在传感器元件上输 出信号(+)。在温度Τ[ρ]时所有的寡核苷酸探针被目标核酸或者对照核酸饱和，从而得到最 强的信号作为阳性对照信号。接着将温度T [测量]提高至Tm⑷<Τ[测量]< Tm(Z)，其中Tm⑵是在给定的 溶剂条件下寡核苷酸探针和目标核酸的双链体的解链温度。寡核苷酸探针和对照核酸的双 链体解链，以至于对照核酸被释放并能(和在其上结合的酶一起)漂洗除去。在温度T[测 量]时只有目标核酸占有的寡核苷酸探针输出信号(+)，这是目标核酸的测量信号。接着将温度提高至T [n] > Tm (Z)。寡核苷酸探针和目标核酸的双链体或者说杂交 物现在也解链，以至于目标核酸被释放并能(和酶一起)漂洗除去。在温度Τ[η]时，所有 的寡核苷酸探针再次为不饱和的，以至于测量不到信号(_)或者只测量到噪音信号，得到 最弱的信号作为阴性对照信号。目标核酸的信号强度数值S(Z)例如然后能通过与阳性对照信号和阴性对照信号 的关系来表达，例如，根据如下公式S [Ζ] = (S [测量]-S [η]) / (S [ρ] -S [η])
用这个方法可以在每次测量时同时进行传感器元件的校正，这实现了特别高的准确度。比如如下选择对照核酸的序列通过比目标核酸更短的互补序列使对照核酸结合 至寡核苷酸探针。或者，对照核酸也可以具有比目标核酸更少的GC含量，或者具有更少的 GC含量和更短的互补链接序列的组合。这在图2至图6中仅示意性描述。仅基于清楚的原 因示意的是具有5对结合碱基对的目标核酸和有2对结合碱基对的对照核酸。优选地，目标核酸通过具有15个或者更多个结合碱基对的区间进行结合，更优选地，目标核酸通过具 有30个或者更多个结合碱基对的区间进行结合。当目标核酸通过具 有大约20到25个碱基的互补区间结合至寡核苷酸探针上时， 对照核酸可以选择例如具有6至12碱基的长度的互补区间。可以选择这样的目标核酸该 目标核酸在互补区间上部分地具有与目标核酸一致的序列，从而该序列通过寡核苷酸探针 上的与目标核酸部分相同的核苷酸进行结合。使用具有随机化的序列的短链寡聚物作为对 照核酸也是值得考虑的，例如，随机化的六聚物(Hexamer)、随机化的十聚物(Decamer)或 者类似的。根据备选的实施方式，寡核苷酸探针具有不能杂交至目标核酸而是只能杂交至对 照核酸的序列的区间。根据另一实施方式，这种区间可以通过间隔序列从结合目标核酸的 序列隔离开来，以至于甚至可以使目标核酸和对照核酸同时结合至寡核苷酸探针。这例如 在图4中所描述，这里在寡核苷酸探针上，不仅较短的对照核酸而且较长的目标核酸都能 结合至寡核苷酸探针的不同区间上。除此之外，图4的方法根据图3的方法实施。在图5中显示了本发明另一实施方式的示意图，这里测定目标核酸(Z)的熔点曲 线。传感器元件上加载有试样，假定该试样含有适合相应寡核苷酸探针的目标核酸(Z)。此 外如根据图3的方法添加对照核酸⑷。温度是T[p] < Tm(K)，其中Tm⑷是在给定的溶剂 条件下寡核苷酸探针和对照核酸的双链体的解链温度。由目标核酸和对照核酸形成的混合 物的浓度足够的高，以至于所有自由的寡核苷酸探针能被目标核酸或者对照核酸饱和。在 温度Τ[ρ]时，目标核酸分子和对照核酸分子杂交至所有的游离的寡核苷酸探针。用生物素 (B)标记对照核酸。然后添加抗生蛋白链菌素结合的酶(E)，该酶结合生物素(B)并可以转 化底物(未显示)，从而在传感器元件上输出信号(+)。在温度Τ[ρ]时，所有的寡核苷酸探针通过目标核酸或者对照核酸被饱和，以至于 得到最强的信号作为阳性对照信号。接着经过T[测量1]、Τ[测量2]等等将温度逐步提高至T[p] < T[测量1-η] < Tm(Z)，其中Tm(Z)是在给定的溶剂条件下寡核苷酸探针和目标核酸的双链体的解链温 度。寡核苷酸探针和对照核酸的双链体第一个解链(如在图5中T[测量1]时描述的)，以 至于对照核酸被释放并能(和结合在其上的酶一起)漂洗除去。在温度T[测量1]时只有 被目标核酸占据的寡核苷酸探针输出为目标核酸测量信号的信号。在逐步提高温度时，寡 核苷酸探针和目标核酸的双链体也慢慢开始解链(如图5中在T[测量2]时描述的)，以至 于可以形成解链曲线。最后将温度提高至T [n] > Tm (Z)。寡核苷酸探针和目标核酸的双链体现在完全解 链，以至于所有的目标核酸被释放并能(和酶一起)漂洗除去。在温度Τ[η]时，所有的寡 核苷酸探针现在再次为不饱和的，以至于没有测量到信号(_)或者只测量到噪音信号，得 到最弱的信号作为阴性对照信号。此外可以通过对氨基苯酚(pAP)，即电化学反应的主要底物，进行初始的校正测 量，以便确定是否所有的电极对这种氧化还原反应物质的存在有应答。从而能够证实所有 的电极对这种氧化还原反应产物有应答。现在漂洗除去游离的对氨基苯酚，并开始温度相 关的测量次序。在图6中显示本发明的另一实施方式的示意图。上面一列是正常的测量次序，和图5描述的一样，概括为与目标核酸(Z)及对照核酸⑷杂交，在T[p] < Tm⑷时测量阳性对照，对照核 酸解链，在Τ[ρ] <Τ[测量1-n] < Tm(Z)时生成目标核酸的解链曲线，在Τ[η] > Tm(Z)时 获得阴性对照信号。向传感器的其他传感器元件上施用带生物素的寡核苷酸探针(在图6 的下面的列中所描述)，这些传感器元件作为分开设置的点用于温度控制。这里，酶在整个 测量温度区间 T [p] < Tm(K)、T[p] < T [测量 1-n] < Tm(Z)、T[n] > Tm(Z)上独立于 DNA 杂交物的解链温度通过生物素_抗生蛋白链菌素复合物结合至寡核苷酸探针，并提供探测 系统(酶活性和电化学氧化还原反应)与温度的关系。根据最强信号的温度曲线，测试点 上的信号强度可以得到校正，其中在这些测试点上测量目标核酸。此外还可以设置附加的以具有随机化序列的寡核苷酸探针所覆盖的阴性对照点， 这种具有随机化序列的寡核苷酸探针不能特异性地结合核酸。从而能够补偿非特异的结 合影响和流动导致的温度影响。最后根据 酶转化(底物转化)校正每个传感器对，单位是 Mol/(升X秒)。这里也再一次可能的是，从测量点(带有寡核苷酸探针，对于目标核酸是 特异性的)的信号强度和阴性对照点出发计算补偿后的信号，例如，通过计算差数和商数。要注意的是，实施例只是解释性和示例性的，在权利要求的保护范围内，改变和修 改是可能的。尤其是，本发明的方法可以与其他传感器元件和标记物或者标签结合使用，例 如用于光学的、磁性的或者重量分析的传感器元件。
权利要求
校正传感器元件的方法，所述传感器元件具有固定的寡核苷酸探针，所述传感器通过所述寡核苷酸探针检测目标核酸(Z)的结合，所述方法包括a)使所述传感器元件接触对照核酸(K)，该对照核酸的解链温度Tm(K)低于目标核酸的解链温度Tm(Z)；b)在温度T[p]＜Tm(K)时使对照核酸(K)杂交至寡聚核苷酸探针上，获得阳性对照信号。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括附加的步骤c)改变严紧条件使得T[n]>Tm(K)，并获得阴性对照信号。
3.根据权利要求1所述的校正传感器元件的方法，包括a)使传感器元件接触包含对照核酸(K)和目标核酸(Z)的混合物，其中，对照核酸的解 链温度Tm⑷低于目标核酸的解链温度Tm(Z)；bl)在温度T[p] <Tm(K)时使混合物杂交至寡核苷酸探针上，获得阳性对照信号； b2)在测量温度T = T [测量]时改变严紧条件，使得 Tm⑷<T [测量]<Tm(Z)，获得测量信号。
4.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括附加的步骤 c)改变严紧条件使得T[n] >Tm(Z)，并获得阴性对照信号。
5.根据前面权利要求中任一项所述的方法，其中，通过提高温度实现所述改变严紧条件。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，在不同的温度T[测量1-n]时测量多个测量信号 1 至 n，其中 Tm(K) <T[测量 l_n] <Tm(Z)。
7.根据前面权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法针对设置在阵列装置中的 大部分传感器元件而实施。
8.根据前面权利要求中任一项所述的方法，其中，目标核酸和对照核酸用可检测标记 物进行标记。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，可检测标记物是酶标记物，其可以使底物转化成 传感器元件可检测的产物。
10.根据前面权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)之前使传感器元件接触 可检测的产物，以便获得第一校正信号。
11.根据前面权利要求中任一项所述的方法，其中，在另一传感器元件上，分别在温度 T[p]、T[测量]、T[测量1-n]和T[n]时附加获得温度补偿信号，其中可检测标记物直接固 定在所述另一传感器元件上。
12.根据前面权利要求中任一项所述的方法，其中，所述传感器元件是电化学传感器元 件，目标核酸和对照核酸用可检测标记物进行标记，所述标记物是酶标记物，其使底物转化 成传感器元件可检测的产物。
13.根据前面权利要求中任一项所述的方法，其中，对照核酸(K)的解链温度Tm(K)比 目标核酸(Z)的解链温度Tm(Z)至少低5°C。
14.一种装置，其包括-至少一个传感器元件，所述传感器元件具有固定在上面的核苷酸探针，所述传感器元 件通过所述的核苷酸探针检测目标核酸的结合，其中寡核苷酸探针和目标核酸的结合复合物具有解链温度Tm(Z)；-用于改变传感器元件温度的加热和/或冷却手段；-至少一种对照核酸，其能和核苷酸探针形成结合复合物，该结合复合物具有低于 Tm(Z)的解链温度Tm(K)。
15.根据权利要求14所述的装置，还具有大部分设置在阵列装置中的传感器元件。
16.根据权利要求14或15中任一项所述的装置，其中，所述装置中的对照核酸以干试 剂的方式储存。
17.根据权利要求14或15任一项所述的装置，其中，所述装置以试剂盒的形式提供， 所述试剂盒包含设备和组合物，所述设备包含加热和/或冷却手段以及至少一个传感器元 件，所述组合物包含对照核酸。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的装置，其中，所述对照核酸用可检测标记物 进行标记
19.根据权利要求18所述的方法，其中可检测标记物是酶标记物，其可以使底物转化 成传感器元件可检测的产物。
20.根据权利要求14至19中任一项所述的装置，其中，可检测标记物直接固定在另一 传感器元件上。
21.根据权利要求14至20中任一项所述的装置，其中，所述传感器元件是电化学传感 器元件，其中所述对照核酸用可检测标记物进行标记，所述标记物是酶标记物，其使底物转 化成传感器元件可检测的产物。
22.根据权利要求14至21中任一项所述的装置，其中，对照核酸(K)的解链温度Tm(K) 比目标核酸(Z)的解链温度Tm(Z)至少低5°C。
23.根据权利要求14至22中任一项所述的装置，包括作为对照核酸的核酸组合物，所 述组合物包含随机化的十聚核苷酸序列。
24.根据权利要求23所述的装置，其中，所述包含随机化十聚核苷酸序列的核酸是生 物素化的。
25.根据权利要求14至24中任一项所述的装置，其中，所述传感器元件是电化学传感 器元件。
全文摘要
本发明涉及校正传感器元件的方法，该传感器元件具有固定的寡核苷酸探针，该传感器通过所述寡核苷酸探针检测目标核酸的结合，该方法包括a)使传感器元件接触对照核酸(K)，该对照核酸的解链温度Tm(K)低于目标核酸的解链温度Tm(Z)；b)在T[p]＜Tm(K)的温度对照核酸(K)杂交至核苷酸探针，获得阳性对照信号；和任选地，c)改变严紧条件使得T[n]＞Tm(K)，并获得阴性对照信号。根据本发明的改进方案，在测试温度T[测量]时，其中Tm(K)＜T[测量]＜Tm(Z)，测量目标核酸(Z)的测量信号。所述方法特别适用于微阵列的校正和质量控制。
文档编号C12Q1/68GK101868554SQ200880116967
公开日2010年10月20日 申请日期2008年10月29日 优先权日2007年11月20日
发明者凯特贾·弗雷德里克, 勒妮·韦伯, 彼得·波利卡, 曼弗雷德·斯坦泽尔, 沃尔特·冈布雷克特 申请人:西门子公司