专利名称：自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系及其建立方法
技术领域：
本发明属于动物细胞系领域。具体涉及一种小鼠肺癌自发高转移倾向细胞系的建 立及其建立方法。背景资料肿瘤的侵袭和转移是恶性肿瘤的基本生物学特性之一，也是肿瘤患者死亡的重要 原因。然而，有关转移的确切机制目前尚不十分清楚。因此，肿瘤转移一直是肿瘤学研究的 一个热点。目前有关肿瘤转移的研究还主要局限于手术切除的肿瘤标本和某些有限转移特 性肿瘤细胞系的转移相关指标的观察，而它们均不能精确地反映肿瘤生长转移的整个临床 过程，直接影响着肿瘤转移机制及其干预治疗的深入研究。为此，有必要建立理想的肿瘤转 移动物模型对肿瘤转移进行深入的研究。肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，而转移是导致肺癌患者死亡 的最主要原因。因此，对肺癌转移的研究已成为当前的热点之一，建立肺癌转移的动物模型 正是研究肿瘤转移生物学和抗转移实验治疗的重要工具。国内外学者在这方面做了大量的 研究和探索，本研究通过首代切除皮下肿瘤获得肺转移灶，结合体内反复筛选的方法，筛选 出一个小鼠肺癌皮下植瘤自发高转移模型，并建立了相应高转移细胞系，为研究肺癌转移 机制和抗转移实验治疗提供了较为理想的动物模型及细胞系。本发明的技术方案是利用C57BL/6J小鼠肺癌转移灶作为建系瘤源，作为一种新 的筛选自发高转移性肿瘤细胞的方法，采用体外原代培养方式，建立了一株具有自发高转 移倾向的小鼠肺癌细胞系，命名为LLC-F3。本发明的有益结果是1. C57BL/6J小鼠动物模型可以用来筛选自发高转移倾向肿瘤细胞株；2.获得的自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系可以用于筛选抗肿瘤转移的药物；3.通过与亲本细胞的比较，可应用自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系用于筛选肿瘤 转移相关蛋白；4.可用于研究肿瘤转移的发病机理；5.可用于研究制备肿瘤转移的疫苗；6.通过接种动物来检测抗肿瘤转移的疫苗的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系及其建系方法，为 肺癌的遗传学改变规律，肺癌的病因学，肿瘤转移机制的研究，以及抗转移的药物筛选提供 理想的实验对象。本发明采用小鼠Lewis肺癌(LLC-F0)细胞株作为建系的源细胞，通过C57BL/6J 小鼠体内连续筛选和体外扩增相结合的方法，建立了一种自发高转移倾向小鼠肺癌细胞 系，命名为LLC-F3。本发明通过下述方法和步骤建立自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系LLC-F3。1.按常规方法建立小鼠肺癌原位移植瘤模型
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将小鼠Lewis肺癌细胞株(LLC-FO)细胞体外培养，取5 X IO5个状态良好的生长 期细胞，接种于C57BL/6J小鼠背侧皮下，建立小鼠LLC-FO原位移植瘤模型。2.自发高转移倾向细胞的体外培养在接种后第18天，切除原位瘤，继续饲养小鼠；过3个星期后断颈法处死小鼠，用 75%的酒精消毒。于无菌环境中打开胸腔，取出肺，肉眼可见许多转移灶；用RPMI 1640培 养液冲洗，尽量洗去血块，后用镊子小心取出转移瘤体于另一预加IOmL RPMI 1640培养液 的培养皿中，剥去包膜并尽量撕碎，过筛除去细胞团和间质成分。IOOOrpm离心5min，培养 于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中，静置培养；原代培养每3天换液一次，去除已 经漂浮的细胞和残留的血细胞。3.瘤细胞的体内外交替生长瘤细胞体外培养一段时间后，将培养所得的细胞按步骤1接种于C57BL/6J小鼠背 侧皮下，每只小鼠接种量为5X 105(0.1mL)。待原位瘤长至IOOOmm3大小则做手术切除。按 步骤2，3进行筛选扩增，同法重复3 4轮筛选。4.建立细胞系将筛选所得的肺转移细胞体外培养，培养条件同上。隔天更换培养液。每4天传 代1次，常规冻存后，复苏，建立具有高自发性肺转移的小鼠肺癌细胞系LLC-F3。经常规系列实验检测，本发明的细胞系具有以下特点1.能在体外长期生长和稳定传代。2.经实验观察，体外生长的LLC-F3具有典型的肿瘤细胞特征，接触性生长抑制丧 失，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。3.成瘤性检测表明，IXlO6细胞(0. ImL)接种于C57BL/6J小鼠背侧皮下的成瘤 率是100%，成瘤潜伏期小于7天。肿瘤生长迅速，至接种42天后，肿瘤平均体积可以达到 1000mm3。接种4周时，其肺转移率可达100 %。4. LLC-FO与LLC-F3的蛋白表达差异分析表明，自发高转移细胞系LLC-F3与亲本 LLC-FO相比，具有特异性表达的蛋白。以上结果表明，本发明细胞系具有成瘤率高、转移时间早、转移率稳定的特点，是 一种理想的肺癌转移研究模型，其在揭示肺癌转移机制和抗转移药物筛选的应用中将有着 广阔的前景。
图1筛选LLC-F3实验流程图。图2体外培养的LLC-FO和LLC-F3细胞(X 10)。显微镜下显示，相比于LLC-FO细 胞，LLC-F3细胞均呈簇样生长，形状不规则，细胞排列紧密，界限清楚，接触性抑制丧失。图3LLC-F0与LLC-F3培养上清中细胞因子含量比较图。图4LLC-F0 (A)与LLC-F3⑶的蛋白双向电泳银染图比较。图5LLC-F0与LLC-F3尾静脉注射后小鼠生存曲线。图6LLC-F0与LLC-F3尾静脉注射后小鼠平均存活时间比较。图7LLC-F3尾静脉注射后小鼠肺部转移随时间变化情况。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例本发明的材料1. C57BL/6J小鼠由南京大学分子医学研究所提供。2. RPMI 1640细胞培养液和新生牛血清购自Gibico公司。3. pH 3-10 Pharmacia IPG 胶条购自 Bio-Rad 公司。4. VEGF和PlGF测量试剂盒购自R&D Systems公司。一、自发高转移性的小鼠肺癌细胞系LLC-F3的建立LLC-FO细胞体外培养，取5X IO5个状态良好的生长期细胞，接种于C57BL/6J小 鼠的背侧皮下，正常饲养荷瘤小鼠；在接种后第18天，切除原位瘤，继续饲养小鼠；过3个 星期后断颈法处死小鼠，用75%的酒精消毒。于无菌环境中打开胸腔，取出肺，肉眼可见许 多转移灶；用RPMI 1640培养液冲洗，尽量洗去血块，后用镊子小心取出转移瘤体于另一预 加IOmLRPMI 1640培养液的培养皿中，剥去包膜并尽量撕碎，过筛除去细胞团和间质成分。 IOOOrpm离心5min，培养于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中。体外传代3次后再 次接种C57BL/6J小鼠。18天切除，3个星期后处死分离肺转移灶，并体外培养。这样的循 环3次，最后一次得到的细胞即为LLC-F3，大量扩增后备用。二、LLC-FO与LLC-F3的细胞形态观察将LLC-FO细胞与LLC-F3细胞体外培养至50%融合后，在显微镜下观察。三、培养上清中VEGF和PlGF表达量比较在24孔细胞培养板中接种密度为IX 105/mL的LLC-FO和LLC-F3细胞，用含有 10%新生牛血清的培养液培养24h，观察细胞生长良好，换用无血清培养液继续培养24h。 收获上清，4°C 13200rpm离心15min，取上清用于细胞因子的测量。采用购自R&D Systems的ELISA试剂盒进行测量，测量时严格按照试剂盒说明书 所述进行。四、LLC-FO与LLC-F3蛋白组学比较(1)蛋白样品准备LLC-FO与LLC-F3细胞等密度接种于55cm2的培养瓶中，置于37°C孵箱培养24h， 无血清培养12h后，收获细胞。用预冷的PBS洗涤细胞3次。最后，将细胞团加入裂解液 (8M 尿素，4% CHAPS, 65mM DTT,40mM Tris-HCl，35 μ g/mL 蛋白酶抑制剂混合液)，在 4°C裂 解lh，13200rpm离心30min，取上清，用BCA方法测量好蛋白浓度，保存于_80°C。(2)双向电泳将准备好的样品等蛋白浓度上样，上样量为300yg。用长度为13cm的pH 3-10PharmaciaIPG 胶条，在电泳仪(Amersham Pharmacia Biotech)聚焦，聚焦完成后， 将胶条放于平衡液(50mM Tris-HCl，6M尿素，2% SDS，30%甘油和DTT，pH 8.8)平衡 3X 15min，将平衡好的胶条放在12. 5% SDS-PAGE电泳上方，用1 %琼脂封好，30mA恒流电泳 至溴酚蓝到底部，大约5h。(3)银染取下胶，银染后观察两种细胞系的蛋白组学上的差别。具体方法如下取下胶，用去离子水洗3次，每次5min;用固定液(40%甲醇，10%冰醋酸)固定Ih ；用去离子水洗3次，每次5min ；用5%戊二醛溶液固定增明Ih ；用去离子水洗3次，每次 5min ；放入银染溶液(0. 02N NaOH, 0. 5%氨水，0. 4gAgN03)中，染色30min ；用去离子水洗3 次，每次5min ；放于显影液(0.005%柠檬酸溶液，2%甲醛溶液)中，显影IOmin ；用5% HAc 终止反应；用去离子水洗3次，每次5min ；用扫描仪完成扫描工作。五、LLC-FO与LLC-F3转移能力的比较1. 5 X IO6细胞量的LLC-FO与等细胞量的LLC-F3尾静脉注射C57BL/6J小鼠，记录 小鼠的存活时间，死亡当天，解剖尸体查看肺转移情况。实验结果( 一 ) LLC-FO与LLC-F3的细胞形态观察LLC_F0和LLC-F3在相同的培养调节下， LLC-FO较为分散，细胞之间较不易成团。两种细胞均贴壁不紧密，容易消化(图2)。( 二)培养上清中VEGF和PlGF表达量比较LLC_F0和LLC-F3在无血清条件下培 养24h，LLC-F3分泌到培养上清中的VEGF与PlGF的含量显著比LLC-FO显著高(图3)。(三)LLC-FO与LLC-F3蛋白组学比较从LLC-FO和LLC-F3的双向电泳图谱可以 看出，大量的蛋白点是一致的，有某些蛋白点的表达量有显著差异(图4圆圈)，可以说明， LLC-FO与LLC-F3是同一来源的，在蛋白水平上大部分是一致的，但是它们又有明显的区 别，可能就是这些区别造成了两者行为上的差别。(四)LLC-FO与LLC-F3转移能力的比较1)相同细胞量尾静脉注射后，LLC-FO的生存曲线显著比LLC-F3后延缓(图5)， LLC-F3组小鼠平均存活时间为两周，而LLC-FO组小鼠平均存活时间为三周，延长了一个星 期(图6)。2)取不同的时间解剖小鼠，可以观察到小鼠肺部被肿瘤细胞侵袭，形成转移灶，转 移灶发展成肿瘤的情况(图7)。死亡后解剖尸体发现小鼠有严重的肺转移和胸腔积血，说 明小鼠死于肺转移。LLC-F3组小鼠存活时间短于LLC-FO组说明了 LLC-F3比LLC-FO转移 性更高。因而我们获得了比LLC-FO有更高转移性的LLC-F3细胞系。
权利要求
一种自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系LLC F3，具有生物学特征，还具备特殊的转移表型。
2.根据权利要求1所述的自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系LLC-F3，其生物学特征是1)能在体外长期生长和稳定传代2)接触性生长抑制丧失3)可无限继代培养。
3.根据权利要求1所述的自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系LLC-F3，其特殊转移表型病 理学特征是C57BL/6J小鼠接种成瘤率和皮下接种转移率为100%。
4.一种自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系的建立方法，其特征在于用LLC-FO接种 C57BL/6J小鼠；确认转移部位；筛选自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系；细胞体内成瘤。
5.根据权利要求4所述的一种自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系的建立方法，其特征在 于取肺癌亲本LLC-FO细胞悬液，用浓度为5X 105/0. ImL接种于C57BL/6J小鼠背侧皮下， C57BL/6J小鼠由南京大学分子医学研究所提供。
6.根据权利要求4所述的一种自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系的建立方法，其特征在 于将C57BL/6J小鼠断颈处死，对各个组织进行肉眼观察，确立其转移灶的部位为肺脏、肝 脏。
7.根据权利要求4所述的一种自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系的建立方法，获得自发 高转移倾向小鼠肺癌细胞系，其特征在于取5 X IO5个体外培养的状态良好的生长期LLC-FO 细胞，接种于C57BL/6J小鼠的背侧皮下，正常饲养荷瘤小鼠；在接种后第18天，切除原位 瘤，继续饲养小鼠；过3个星期后断颈法处死小鼠，用75%的酒精消毒。于无菌环境中打开 胸腔，取出肺，肉眼可见许多转移灶；用无血清的RPMI 1640培养液冲洗，尽量洗去血块，后 用镊子小心取出转移瘤体于另一预加IOmL RPMI 1640培养液的培养皿中，剥去包膜并尽量 撕碎，过筛除去细胞团和间质成分。IOOOrpm离心5min，培养于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中，静置培养；原代培养每3天换液一次，去除已经漂浮的细胞和残留的血细 胞；体外传代3次后再次接种C57BL/6J小鼠。18天切除，3个星期后处死分离肺转移灶，并 体外培养。这样的循环3次，最后一次得到的细胞即为LLC-F3，大量扩增后备用。
8.根据权利要求4所述的一种自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系的建立方法，LLC-F3细 胞体内成瘤实验，其特征在于当LLC-F3细胞体外培养稳定后，将细胞再回注到C57BL/6J 小鼠皮下，方法同前，成瘤率达到100%，并且在C57BL/6J小鼠的肺脏和肝脏出现转移灶。
9.一种自发高转移倾向小鼠肺癌细胞系的用途，其特征在于，用于筛选抗肿瘤转移药 物；或用于体外肿瘤转移的研究。
全文摘要
本发明属于动物细胞系领域。本发明采用小鼠肺癌LLC-F0细胞株作为源细胞，通过C57BL/6J体内筛选和体外培养相结合的方法，建立了具有自发性肺转移表形的小鼠肺癌高转移细胞系LLC-F3。所述的鼠肺癌自发高转移倾向细胞亚系具有肺癌转移率高且恶性程度高的特点，是一种理想的研究肿瘤转移的模型，在揭示肺癌的转移机制和抗转移药物的筛选的应用中将有着广阔的前景。
文档编号C12Q1/02GK101906400SQ200910032910
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月8日 优先权日2009年6月8日
发明者刘建宁, 张菁, 苏艺晶 申请人:南京大学