miR24‑1在抑制肿瘤细胞转移中的应用的制作方法

本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，涉及miR24-1在抑制肝癌细胞转移中的应用。

背景技术：

癌症是危害人类健康的头号杀手，世界卫生组织2014年发布的癌症白皮书中指出，肝癌在我国无论男性还是女性的发病率均为前五位。转移是导致肿瘤复发及致死的重要原因，也是决定肿瘤临床治疗和评估预后的重要指标。有关其分子机制的研究表明,它是一个多阶段复杂的过程,其中包括肿瘤细胞的脱落、迁移、粘附、生长等,每一阶段都受着不同因素的影响及相关基因的调控。因此，探讨与肿瘤转移的分子机制,寻找预防和治疗的有效途径,是目前肿瘤生物学研究的一项重要课题。

据报道，细胞内的O连接的N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰在几乎所有重要生理过程中都发挥重要作用。这种糖基化修饰在细胞内普遍存在于细胞核和细胞质中，并对细胞内多种信号通路产生调节作用。目前研究表明,多种与重大疾病密切相关的蛋白质均可以发生O-GlcNAc修饰，并且这种糖基化修饰对于疾病的产生、发展均具有密切的关系。O-GlcNAc转移酶(OGT)在哺乳动物中普遍存在的，其作用是就是将单个存在的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)通过β-构型以O-连接的糖苷键形式连接到目的蛋白的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的羟基上。OGT的表达和活性直接决定了胞内O-GlcNAc修饰水平，进而影响了包括恶性肿瘤在内的多种重大疾病的发生发展。

miRNA是一类普遍存在于细胞当中的，长度大约为22个核苷酸的非编码小分子RNA，通过与靶mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)结合在转录后水平上对基因的表达进行调节。越来越多的研究表明miRNA与细胞癌变、转移、侵袭等病理过程密切相关。越来越多的研究指出，miRNA通过靶向细胞内的糖基转移酶，调控胞内糖基化水平和糖链结构。然而，目前关于miRNA调控OGT表达分子机制的研究还未见报道。miR24-1是广泛存在于哺乳动物细胞中的一种具有生长抑制功能的miRNA。研究表明，miR24-1在细胞生长、凋亡、分化以及肿瘤发生等过程中起着重要的调控作用。但miR24-1在调控肿瘤细胞侵袭和转移中的作用机制还知之甚少。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明提供了miR24-1在抑制肿瘤细胞转移中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的数据基础建立在小鼠肝癌细胞中microRNA差异表达芯片之上，根据芯片结果，筛选出在低转移能力的小鼠肝癌细胞(Hca-P)和高转移能力的小鼠肝癌细胞(Hca-F)中存在显著表达差异的miRNAs作为候选miRNA，利用RT-qPCR验证芯片结果，找到在两种细胞中存在显著差异的miR24-1作为研究的基础。接下来，利用western blotting实验方法发现OGT在两种细胞中的表达量同样存在显著差异，并与miR24-1在两种细胞中的表达差异吻合。为了验证OGT是miR24-1的靶基因之一，设计实验构建了双荧光素酶报告基因，并将miR24-1的模拟物：miR24-1mimic与报告基因共转染至293-T中，通过检测，证实了OGT为miR24-1的靶基因。最后，将miR24-1的模拟物和抑制物：miR24-1 mimic、miR24-1 inhibitor分别转染到上述两种细胞中，发现miR24-1的mimic可以抑制OGT在两种细胞中的表达量。同时，miR24-1在细胞中的过表达可以抑制其增殖、迁移、侵袭和黏附能力。因此,miR24-1具有抑制小鼠肿瘤细胞的转移能力，可以应用于抑制肿瘤转移药物的开发领域。

具体地，本发明提供一种miR24-1在抑制肿瘤细胞转移中的应用，所述miR24-1的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供miR24-1的模拟物在抑制肿瘤细胞转移中的应用，所述miR24-1模拟物的的正义链序列如SEQ ID NO.2所示，反义链序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供miR24-1的靶基因，该靶基因为OGT。

所述的miR24-1的靶基因为OGT，miR24-1或miR24-1模拟物通过抑制OGT的表达，实现抑制肿瘤细胞的转移。

在优选的技术方案中，所述miR24-1或miR24-1模拟物用于制备抑制肝癌转移药物。

在本发明所述miR24-1可以用于制备抑制肝癌等转移性肿瘤转移的药物。具体应用时，可以将miR24-1的模拟物用于药物设计，也可以构建miR24-1的真核表达载体，用于基因治疗。

附图说明

图1表示miR24-1在Hca-P，Hca-F两种小鼠肝癌细胞中的相对表达量的real-time PCR结果。

图2表示OGT蛋白在Hca-P，Hca-F两种小鼠肝癌细胞中的表达量的real-time PCR结果和Western Blotting实验结果。

图3表示双荧光素酶报告基因检测系统分析miR24-1的mimic OGT-3’UTR/pGL-3荧光强度的影响。

图4表示转染miR24-1的mimic、inhibitor后OGT蛋白在Hca-P，Hca-F两种小鼠肝癌细胞中的表达量。

图5表示Hca-P、Hca-F两种细胞分别转染miR24-1的mimic、inhibitor后细胞增殖能力的变化。

图6表示Hca-F小鼠肝癌分别转染miR24-1的mimic、inhibitor后的显微镜图。

图7表示Hca-F小鼠肝癌分别转染miR24-1的mimic、inhibitor后细胞粘附能力的变化。

图8表示Hca-P，Hca-F两种小鼠肝癌分别转染miR24-1的inhibitor、mimic后的显微镜图。

图9表示Hca-P，Hca-F两种小鼠肝癌分别转染miR24-1的inhibitor、mimic后细胞侵袭能力的变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。下面实施例中未注明具体实验条件的方法，通常按照常规条件或分子克隆中所述条件，或按照产品说明书上所提供的条件。下面实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的数据基础建立在小鼠肝癌细胞中microRNA差异表达芯片之上，根据芯片结果，筛选出在低转移能力的小鼠肝癌细胞(Hca-P)和高转移能力的小鼠肝癌细胞(Hca-F)中存在显著表达差异的miRNAs作为候选miRNA，根据芯片结果的分析，确定候选的miRNA为miR24-1，其序列为UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG。

本发明使用的细胞、试剂盒以及试剂：

所述肝癌细胞Hca-P为低转移能力的小鼠肝癌细胞、所述肝癌细胞Hca-F为高转移能力的小鼠肝癌细胞，根据文献(Y.Guo et al.The International Journal of Biochemistry&Cell Biology,2014,53,1-8)获得。pGL3载体购自Promega(USA)，pMD-19T载体购自TaKaRa(Japan)。

miR24-1的模拟物、抑制物名称和序列如表1。

表1.miR24-1、miR24-1的模拟物、抑制物序列

实施例1

miR24-1在不同小鼠肝癌细胞中的表达：将对数期的小鼠肝癌细胞Hca-P、Hca-F分别悬浮培养在含有90％RPMI1640和10％血清的全培培养基中，在37℃、5％CO₂的培养条件下培养24h，得到状态良好的小鼠肝癌细胞。收集细胞，通过Trisol法提取细胞中的总RNA。将提取的总RNA反转录得到cDNA，RNA模板的含量为2μg总RNA。将反转得到的cDNA根据进行real-time PCR检测miR24-1在三种细胞中的表达量，根据试剂盒(Bulge-Loop^TMmiRNA qRT-PCR，RIBOBIO)的说明进行，通过PCR反应扩增miR24-1。图1为miR24-1在两种细胞中的相对表达量，可见miR24-1在Hca-P中的表达量显著高于Hca-F，说明miR24-1的表达量与小鼠肝癌细胞的恶性程度负相关。

实验结果与芯片结果一致，即miR24-1在低转移能力的小鼠肝癌细胞中的表达量显著高于高转移能力的小鼠肝癌细胞。

实施例2

为了寻找miR24-1的靶基因，通过TargetScan、MiRDB等生物信息预测软件找到了感兴趣的靶基因之一：OGT，将此作为研究对象。OGT是真核细胞生物中高度保守的一个糖基转移酶，其表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关。

具体为：将对数期的小鼠肝癌细胞Hca-P、Hca-F分别悬浮培养在含有90％RPMI1640和10％血清的全培培养基中，在37℃、5％CO₂的培养条件下培养24h，收集细胞，分别提取RNA和总蛋白质，通过RT-qPCR和Western blotting实验(OGT的qPCR引物为F:5’-TTCGGGAATCACCCTACTTCA-3’,R:5’-TACCATCATCCGGGCTCAA-3’)，证实了两种细胞中OGT的表达，结果如图2所示。结果表明OGT在Hca-F的表达量显著高于Hca-P，OGT在两种细胞中的相对表达量与miR24-1在两种细胞中的相对表达量存在正确的逻辑关系，说明OGT的表达与miR24-1具有相关性。

为了直接证明OGT是miR24-1的靶基因，构建了双荧光素酶报告基因，设计引物将OGT 3’UTR区域中与miR24-1结合位点的片段扩增出来，其结合位点如下所示：

并将此段序列连接到pGL-3载体中，然后将其与miR24-1的mimic共转染到293-T中。

扩增片段引物设计：

设计引物扩增OGT基因(NM_181672)的3’UTR非翻译区片段，并根据pGL-3载体上的酶切位点选择适合的酶切位点，在引物的5’端和3’端分别加入XbaI酶切位点，引物分别命名为OGT/3’UTR-F(上游引物)OGT/3’UTR-R(下游引物)，引物序列如下：

OGT/3’UTR-F：5’-AATTCTAGAATGCAGCTGGCAACAAAC-3’

OGT/3’UTR-R：5’-ACTCTAGACCCTATCATGCAGGAAGTAAGT-3’

上述OGT基因(NM_181672)的mRNA序列如SEQ ID No.4，总长度为5497bp。

按照前述方法提取Hca-P细胞中的总RNA，反转录得到cDNA，使用PCR扩增试剂盒(TaKaRa PCR Amplification Kit,Japan)扩增目的片段。PCR体系如下所示：

PCR反应体系(30μl)：

PCR条件为：95℃，预变性4min；94℃变性40s，60℃复性40s，70℃延伸60s，40个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

反应结束后，PCR反应产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的条带进行切胶回收步骤，收集目的片段(即OGT的3’UTR片段)，测序，序列如SEQ ID No.5，长度229bp。将目的片段与克隆载体pMD-19T在16℃下过夜连接，目的片段和pMD-19T分别用XbaI进行酶切后，进行连接，连接体系如下：

将连接产物转化至制备好的感受态细胞E.coli JM109中，具体方法如下：

(1)取200μl感受态细胞溶液，加入10μl连接产物，混匀，于冰上30min；

(2)42℃水浴90秒钟热激，放置于冰水中2min；

(3)加入37℃预热培养基(无抗性)振荡培养50min；

(4)取出50μl转化物涂于含Amp的LB琼脂平板培养基上，将平板放置于孵箱中，37℃培养过夜。

筛选阳性克隆：

(1)随机挑取平板上独立的圆滑的菌落，37℃下摇菌培养约12h，收集菌液后，使用试剂盒(OMEGA质粒小量提取试剂盒，D6942-01E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I)提取质粒。将质粒测序，选取测序正确的质粒与pGL3-Control Vector连接。将质粒和pGL3-Control Vector用XbaI进行双酶切，得目的片段和线性载体，在16℃下过夜连接，连接体系如下：

将连接产物转化至感受态细胞中，进行重组质粒的转化实验和质粒提取实验，方法同上述实验过程。将大量提取好的重组质粒与miR24-1的mimic共转染至293-T细胞中，接下来进行双荧光素酶报告基因检测(Reporter Assay System,Promega,USA)

具体为：将重组质粒与miR24-1的模拟物共转染至293-T细胞培养12小时后，收集细胞，用裂解液进行裂解，裂解液按照试剂说明配置萤火虫荧光素酶检测试剂工作液和Renilla荧光素酶检测工作液，用荧光测定仪进行检测，检测结果进行统计学分析，结果如图3所示。图3中，control为没有转染的293-T细胞，pGL3-OGT-3’-UTR+mimic为转染了miR24-1的模拟物的293-T细胞，pGL3-OGT-3’-UTR为转染了pGL3-OGT-3’-UTR的阳性对照293-T细胞，pGL3为只转染pGL3空载体的阳性对照293-T细胞。可见，miR24-1的模拟物可以显著抑制pGL3的荧光强度，故OGT为miR24-1的靶基因之一。

实施例3

为了进一步寻找miR24-1与小鼠肝癌细胞转移能力的关系，将miR24-1的模拟物(mimic)、miR24-1的抑制物(inhibitor)和随机miRNA(ScrambledmiRNA)分别转染至Hca-P、Hca-F细胞中。培养36-48小时后，收集细胞，提取总蛋白，通过Western Blotting检测OGT的表达水平，结果如图4所示，图中给出蛋白条带光密度相对定量。试验结果可见，转染miR24-1的mimic可以下调OGT在细胞中的表达水平，相应的，转染miR24-1的inhibitor上调了OGT的表达水平。

实施例4

为了进一步研究上调、下调miR24-1在三种细胞中的表达量对细胞功能的影响，进行细胞增殖、侵袭、迁移和黏附的实验。

1.对小鼠肝癌细胞增殖的影响

细胞增殖-CCK8实验：采用CCK8试剂盒(Dojindo,Japan)进行检测，具体方法如下：

收集成功转染miR24-1的mimic、inhibitor以及随机miRNA 24h的Hca-P，Hca-F细胞，用血球计数板计数大约2×10⁴个细胞，并将记数后的细胞铺在96孔板的每孔中，总体积为100μl，每组设3个复孔。将96孔板放置于37℃，CO₂培养箱中分别培养12h、24h、48h、72h。每孔细胞悬液中加10μl CCK-8溶液，置于37℃，CO₂培养箱中孵育2h。测定450nm处各组细胞的吸光度，记录数据，采用重复测量资料的方差分析方法来分析各组数据，结果如图5所示。图5可见，转染了miR24-1模拟物(miR24-1mimic)的小鼠肝癌细胞Hca-P、Hca-F的增殖速率显著低于转染了miR24-1抑制物(miR24-1inhibitor)的小鼠肝癌细胞，表明miR24-1可以抑制小鼠肝癌细胞Hca-P、Hca-F的增殖速率。

2.对小鼠肝癌细胞的粘附能力的影响

使用Melting ECMatrix gel(BD，USA)包被96孔板，使用含0.1％BSA的无血清培养基悬浮Hca-F细胞，并种植于包被好的96-well板中，37℃孵育2h。冷PBS洗掉未结合的细胞，使用40％甲醇配制的0.3％结晶紫标记结合细胞，染色持续30min，ddH₂O清洗后使用显微镜观察并计数。每个处理需要三个复孔。结果如图6、7所示：mimic可以增加Hca-F细胞的黏附能力。

3.对细胞侵袭能力的影响

Transwell小室法检测miR24-1对Hca-P、Hca-F细胞侵袭能力的影响：将Melting ECMatrix gel(BD，USA)胶置于4℃过夜融化，待胶融化后，将胶分别与无血清的DME、RPMI1640培养基按1:10的比例混匀，加入混合液100μl于各个小室中。将小室置于在37℃、5％CO₂培养箱中孵育30min。吸出胶融化后小室中残余的空培养基。收集成功转染miR24-1的mimic、inhibitor以及随机miRNA24h的Hca-P，Hca-F细胞，使用PBS洗涤细胞3次(1000rpm离心5min)，调整细胞密度至5×10⁴个/ml，吸取约100μl不含血清的培养基将各组细胞悬液按每孔100μl的量加入Transwell小室中，每组细胞设3个复孔。在24孔板的下室内分别加入600μl全培养基，37℃，5％CO₂培养箱中培养细胞24h。PBS冲洗各小室3次，用棉签擦拭上室的上层细胞(未穿过小室的细胞)。另取24孔板，在每孔中加入约200μl 4％的多聚甲醛，将小室置于其中，使膜浸没在多聚甲醛中，固定15min后，取出Transwell小室，用PBS冲洗三次，冲洗小室下部未固定的细胞。接下来，待膜风干后将小室浸在含0.1％结晶紫溶液的24孔板中，染色15min。PBS小心洗膜3次，至小室上多余的结晶紫染色洗去。正置显微镜观察Transwell小室下底面发生转移的细胞，并对转移的细胞进行计数，各组细胞间的差异采用单因素方差分析，SPSS13.0统计学软件进行分析，结果如图8、9所示。图9中可见，转染miR24-1的inhibitor后穿过小室的Hca-P细胞数量显著高于转染了随机miRNA的细胞数量。在Hca-F细胞中，转染miR24-1的mimic则会减少穿过小室的细胞数，这说明miR24-1可以抑制小鼠肝癌的侵袭能力，相反的，miR24-1的inhibitor可以提高小鼠肝癌细胞的侵袭能力。

本发明公开了miR24-1在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miR24-1的序列如SEQ ID NO.1所示。通过研究发现，miR24-1在高转移能力的小鼠肝癌细胞中的表达量显著低于不具有转移能力的小鼠肝癌细胞，同时本发明还发现上调miR24-1后小鼠肝癌细胞的增殖、侵袭、转移和黏附能力均减弱。因此认为，miR24-1可以抑制小鼠肝癌细胞的转移，降低小鼠肝癌细胞的恶性程度。针对具有转移能力的小鼠肝癌细胞，将miR24-1或其类似物miR24-1的mimic制备成抑制肿瘤转移的药物，或也可以构建miR24-1的真核表达载体，用于基因治疗。

序列表

<110> miR24-1在制备抑制肿瘤转移药物中的应用

<120> 大连理工大学

<130> 2011

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 1

cuccggugccuacugagcugauaucaguucucauuucacacacuggcucaguucagcaggaacaggag

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 2

uggcucaguucagcaggaacag 23

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 3

cuguuccugcugaacugagcca 23

<210> 4

<211> 5497

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

1 agttccggcc catgttgttt cggccgagga gccgtcgccg ccatttcaag accgtactag

61 gtagatggtc aattagagtt cccagggttt gaagcctgta actgctgccg ccgctcaagc

121 cctccagagc attgctacgg ctgctgccct tgtactacta cctccaaata cgttcttgct

181 ggtagtggcg gcagcaggac caattacctc ttttttgctc tccctcgaga agctccagat

241 ggcgtcttcc gtgggcaacg tggccgacag cacagaacca acgaaacgta tgctttcctt

301 ccaagggtta gctgagttgg cacatcgaga atatcaggca ggagattttg aggcagctga

361 gagacactgc atgcagctct ggagacaaga gccagacaat actggtgtgc ttttattact

421 ttcatctata cacttccagt gtcgaaggct ggacagatct gctcacttta gcactctggc

481 aattaaacag aacccccttc tggcagaagc ttattcgaat ttggggaatg tgtacaagga

541 aagagggcag ttgcaggagg caattgagca ttatcgacat gcattgcgtc tcaaacctga

601 tttcatcgat ggttatatta acctggcagc cgccttggta gcagcgggtg acatggaagg

661 ggcagtacaa gcttacgtct ctgctcttca gtacaatcct gatttgtact gtgttcgcag

721 tgacctgggg aacctgctca aagccctggg tcgcttggaa gaagccaagg catgttattt

781 gaaagcaatt gagacgcaac cgaactttgc agtagcttgg agtaatcttg gctgtgtttt

841 caatgcacaa ggggaaattt ggcttgcaat tcatcacttt gaaaaggctg tcacccttga

901 cccaaacttt ctggatgctt atatcaattt aggaaatgtc ttgaaagagg cacgcatttt

961 tgacagagct gtggcagctt atcttcgtgc cctaagtttg agtccaaatc acgcagtggt

1021 gcacggcaac ctggcttgtg tatactatga gcaaggcctg atagatctgg caatagacac

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1261 aaacattgaa gaggcagttc gcttgtatcg taaagcatta gaagtcttcc cagagtttgc

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1441 gggaaacact ctaaaggaga tgcaggatgt tcagggagcc ttgcagtgtt atacgcgtgc

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1561 ttcagggaat attccagaag ccatagcttc ttaccgcacg gctctgaaac ttaagcctga

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1681 ctatgatgag cgaatgaaga agttggtcag tattgtggct gaccagttag agaagaatag

1741 gttgccttct gtgcatcctc atcatagtat gctatatcct ctttctcatg gcttcaggaa

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3601 gcggcgacca gatggtgcat aggtctggaa ggtctgatct cccttggtct tccatgggat

3661 ggttagtgtg gaggggagat atagattgtc cggccgcttt gtgattccat ggattgattc

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4081 taactcaact aacaaaatca agcctgattc aaaacatcct agggtgtttt aaacacacca

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4441 acagttatct ccagtgcatt aaataacctt catcaagaaa taggttatag gtaaaatctc

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4621 ggagtacaaa ttagacttat agtcctcctg gaacttgagt tattaaaatc ataggaataa

4681 aattatggga tctcaacaaa gggtcgaggg tttgaggctt aaacaagcca acatatgaat

4741 atatgttttg tctcgctata ctgcacttac gctatccagt tgcaggtaat tttttgtctg

4801 ctagtagtgt tctagattat gtctttccaa agcgctgagg ctgtgcacct attctgtagt

4861 tgcagctgat gcctgaatgt atcctagctg acaaattatt gattaataag aacttgaatt

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4981 ccagaattac atgttaatga acagtgtacc ttttaacagt gtaaatcacg gaatatccgt

5041 gaagggattt cttaatttat tttttaccgg ttgattgaaa tatcagttaa aggttgccag

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5161 atatacttcc aatgccctca aggctgtgac cttacagcca ttttacatag cacatcattc

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5281 ttattgtaac aggcttttat ttccaggtaa tatgtcttgg aagacttaat tctgattaga

5341 gatatagata ttactggaaa ctaattgttt tttttctatt gtactctgct ttatcaaaga

5401 agtaaaacat ttaaatcgta ctacagaaat taagatgttg tcttgcgatc cttaataaat

5461 gaatgatttc cctttaatac ggaaaaaaaa aaaaaaa

<210> 5

<211> 229

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ATGCAGCTGGCAACAAACCTGACCACATGATTAAGCCTGTTGAAGTCACCGAGTCAGCCTGAATAAAGACTGCGCACAGGAGAATTGCCCTATACCTGAGCCTCAACCTTCTGGGGGAAGGGAACTAGATAACATGCTTTGTGTGTATCTGTGTAGTTCTGTGTTGCAGACGGATGATATATAATGATAATAGAATAGCACATTCAGACTTACTTCCTGCATGATAGGG