专利名称：Tnfsf13作为光敏剂药靶的肿瘤光动力疗法光敏剂的筛选方法
技术领域：
本发明涉及属于生物医药领域，具体涉及TNFSF13作为药靶的肿瘤光动力疗法光敏剂 的筛选方法。
背景技术：
光动力疗法(Photodynamic Therapy,简称PDT)是近年来发展起来的一种通过生物光 敏化作用来损伤肿瘤组织的新型肿瘤疗法。其原理是利用一些荧光量子产额高的光敏剂注 射体内，肿瘤细胞与其亲和性高于正常细胞，因而潴留在肿瘤细胞中。当用强光照射后， 光敏剂吸收光子跃迁至激发态，处于激光态的光敏剂再将能量传至周围的氧分子产生单线 态氧。单线态氧是细胞的强毒性剂，作用途径包括直接损伤，即通过细胞膜、线粒体或溶 酶体等PDT敏感细胞亚结构，破坏此结构导致细胞受损。
光敏剂正是通过上述的机制而杀伤肿瘤细胞，而对正常组织的损伤极小。光动力疗法 与传统的三大肿瘤治疗手段外科手术、化疗和放疗相比，由于光动力疗法具有双重选择 性即光导纤维的定向照射作用与药物在肿瘤组织中的潴留作用，使该疗法在肿瘤治疗中具 有良好的应用前景。
已经研究和使用的大多数光敏剂都属于四吡咯化合物，它是一类具有卟吩核的大环化 合物的总称，四吡咯化合物广泛存在于自然界中，如植物体内的叶绿素。本实验室一直致 力于四吡咯新药的研究和开发。自主开发的多种光敏剂无论在体内和体外都显现了良好的 光动力杀伤作用。但合成什么样结构的光敏更有效？如何筛选出高效的光敏剂？在以往研 究中发现不同的肿瘤细胞对光敏剂的敏感性不同而且趋势不一致，需要有一种方法或细胞 模型能筛选出高效的光敏剂。
TNFSF13是肿瘤坏死因子家族中的成员，肿瘤坏死因子对肿瘤细胞具有强杀伤作用， 我们前期工作发现光敏剂光动力治疗后TNFSF13明显上调，TNFSF13上调后抑癌基因p53 表达水平也上调，提示光动力疗法可能通过介导TNFSF13表达而达到强杀伤肿瘤细胞的作 用。
本发明在前期结果的基础上，通过以TNFSF13为光敏剂分子靶标，通过监测光动力治 疗前后TNFSF13改变情况判断光敏剂的治疗效果，同时通过TNFSF13低表达或不表达稳定 株筛选出对肿瘤具有强杀伤作用的光敏剂。TNFSF13作为基因药靶在肿瘤光动力疗法光敏 剂筛选中的应用为光动力抗肿瘤治疗提供良好的模型和方法。
发明内容
本发明在前期结果的基础上，通过以TNFSF13为光敏剂分子靶标，通过监测光动力治 疗前后TNFSF13表达水平改变情况判断光敏剂的治疗效果，表达水平增加提示光敏剂具有 强杀伤肿瘤作用，以TNFSF13表达水平为指标筛选获得强杀伤作用的光敏剂。
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种TNFSF13作为光敏剂药靶的肿瘤光动力疗 法光敏剂的筛选方法，包括如下步骤
a. Real-time PCR检测耙肿瘤细胞是否表达TNFSF13;
b. 光敏剂与靶肿瘤细胞共培养； C.激光照射耙肿瘤细胞；
d. 收集激光照射后的肿瘤细胞抽提RNA、反转录成cDNA;
e. 检测光敏剂光动力治疗后TNFSF13表达水平改变情况；
f. 以TNFSF13表达水平为指标筛选获得强杀伤作用的光敏剂。 本发明通过TNFSF13RNA干扰慢病毒对肿瘤细胞进行TNFSF13沉默，获得TNFSF13低
表达或不表达稳定细胞株，通过检测稳定细胞株对光动力治疗肿瘤的效果，通过MTT检测 光动力治疗后细胞的存活率，判断与TNFSF13表达水平相关、对光动力疗法敏感的光敏剂，
获得强杀伤作用的光敏剂。
本发明所要解决的技术问题之二是提供TNFSF13作为光敏剂药靶的肿瘤光动力疗法光
敏剂的另一筛选方法，包括如下步骤
(1) 获得TNFSF13RNA干扰慢病毒；
(2) TNFSF13 RNA干扰慢病毒感染靶肿瘤细胞，获得不表达或低表达TNFSF13 的肿瘤稳定细胞株；
(3) 将光敏剂与稳定细胞株共培养；
(4) 激光照射与光敏剂共培养后的稳定细胞株；
(5) MTT法评估细胞的存活率；
(6) 获得治疗效果与TNFSF13表达水平相关的光敏剂，即获得对TNFSF13阳性 肿瘤细胞敏感的光敏剂。
4步骤2中所述的靶肿瘤细胞可为根据real-time PCR法检测TNFSF13在光动力疗法前后 的情况得到TNFSF13表达阳性的细胞株
本发明中TNFSF13作为光敏剂药靶将为光敏剂的筛选提供良好的细胞模型。通过检测 光敏剂光动力治疗前后TNFSF13的改变和细胞对光敏剂疗效改变等指标来筛选具有强杀伤 作用的光敏剂，是良好的筛选模型、方式，为新型高效光敏剂获得提供新的思路和方法。
图1 TNFSF13作为光敏剂药靶的肿瘤光动力疗法光敏剂一种筛选方法的操作流程图2实施例1的光敏剂光动力治疗前后TNFSF13差异表达图，
X轴代表光敏剂光动力治疗中光敏剂浓度，Y轴代表TNFSF13表达水平；
图3实施例2 MTT法检测TNFSF13低表达或不表达肿瘤细胞对光敏剂光动力治疗的 敏感性变化，
X轴中NC为正常表达TNFSF13的细胞，TNFSF13-siRNA为TNFSF13被沉默 的细胞；Y轴为细胞的存活率。
具体实施例方式
实施例1:光敏剂光动力治疗前后TNFSF13差异表达检测 1将处于对数生长期的肺癌细胞株A549细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液， 接种于6cm培养皿中； 2置37°C 5%C02培养箱培养；
3 24h后加光敏剂；
4 48h换成新鲜培养基，然后进行光照(XD-635AB型光动力PDT激光治疗仪)； 5根据Invitrogen公司的Trizol说明书进行总RNA提取，均为RNase-free操作；
6根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行RNA的逆转录获得cDNA; 7 Real-time PCR检测
配置反应体系
试齐u每管加入
SYBR premix ex taq:
上游引物(5hM):
下游引物(5pM):0.5nl
cDNAl単
5(2) 设定程序为两步法Real-timePCR:预变性95。C， 15S;之后每一步变性95t:。 5S; 退火延伸6(TC， 30S;共进行54个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。
(3) 制作熔解曲线
8数据统计并绘图，结果见图2。
实施例2: MTT法检测TNFSF13低表达或不表达肿瘤细胞对 光敏剂光动力治疗的敏感性变化
1. 将TNFSF13RNA干扰慢病毒感染肿瘤细胞肺癌细胞株A549株，获得低表达或不表达 TNFSF13的稳定细胞株；
2. 将处于对数生长期的稳定细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，正常表达 TNFSF13的肺癌细胞株A549株作为对照；
3. 接种于96孔板，每孔100nl;
4. 置37°C 5%C02培养箱培养；
5. 24h后加光敏剂；
6. 48h换成新鲜培养基，然后进行光照(XD-635AB型光动力PDT激光治疗仪)
7. 72h时进行MTT检测
8. 进行MTT前拍照
9. 培养终止前4h加入l(Hil5mg/ml的MTT
10. 吸弃培养液后加100plDMSO终止反应
11. 酶标仪570nm检测OD值
12. 采用软件SPSS12.0对两种细胞的数据进行统计绘图，结果见图3。
权利要求
1.一种TNFSF13作为光敏剂药靶的肿瘤光动力疗法光敏剂的筛选方法，其特征在于包括下列步骤a.Real-time PCR检测靶肿瘤细胞是否表达TNFSF13；b.光敏剂与靶肿瘤细胞共培养；c.激光照射靶肿瘤细胞；d.收集激光照射后的肿瘤细胞抽提RNA、反转录成cDNA；e.检测光敏剂光动力治疗后TNFSF13表达水平改变情况；f.以TNFSF13表达水平为指标筛选获得强杀伤作用的光敏剂。
2. 根据权利要求1所述的TNFSF13作为光敏剂药靶的肿瘤光动力疗法光敏剂的筛选方法， 其特征在于所述肿瘤细胞是肺癌细胞株A549。
3. —种TNFSF13作为光敏剂药靶的肿瘤光动力疗法光敏剂的筛选方法，其特征在于包括 下列步骤(1) 获得TNFSF13RNA干扰慢病毒；(2) TNFSF13 RNA干扰慢病毒感染靶肿瘤细胞，获得不表达或低表达TNFSF13 的肿瘤稳定细胞株；(3) 将光敏剂与稳定细胞株共培养；(4) 激光照射与光敏剂共培养后的稳定细胞株；(5) MTT法评估细胞的存活率；(6) 获得治疗效果与TNFSF13表达水平相关的光敏剂，即获得对TNFSF13阳性 肿瘤细胞敏感的光敏剂。
4. 根据权利要求3所述的TNFSF13作为光敏剂药靶的肿瘤光动力疗法光敏剂的筛选方法， 其特征在于步骤2中所述的靶肿瘤细胞可为根据real-time PCR法检测TNFSF13在光 动力疗法前后的情况得到TNFSF13表达阳性的细胞株。
5. 根据权利要求3或4所述的TNFSF13作为光敏剂药靶的肿瘤光动力疗法光敏剂的筛选 方法，其特征在于所述肿瘤细胞是肺癌细胞株A549。
全文摘要
本发明涉及TNFSF13作为光敏剂药靶的肿瘤光动力疗法光敏剂的筛选方法。其通过将TNFSF13作为光敏剂的药靶，在激光照射下检测光敏剂光动力治疗前后TNFSF13表达水平改变，以TNFSF13表达水平为指标筛选获得强杀伤作用的光敏剂；利用TNFSF13作为光敏剂光动力疗法的药物靶标，通过检测TNFSF13被沉默后的细胞株对光动力治疗的敏感性，获得治疗效果与TNFSF13表达水平相关的光敏剂，即获得对TNFSF13阳性肿瘤细胞敏感的光敏剂。本发明为良好的筛选模型、方式，为新型高效光敏剂获得提供新的思路和方法。
文档编号C12Q1/68GK101665831SQ20091005478
公开日2010年3月10日 申请日期2009年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者丁志楼, 筠 孙, 杨晓霞, 郑梅珍, 陈志龙 申请人:东华大学;陈志龙