专利名称：具有苎麻脱胶活性的枯草芽孢杆菌菌株、其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属枯草芽孢杆菌菌株及其应用领域，特别是涉及具有苎麻脱胶活性的枯草芽孢 杆菌菌株、其制备和应用。
背景技术：
苎麻(Ramie)的学名是万oe/w^/a "/wa (Linn.) Gaudich，属于荨麻科的多年生宿根性 草本植物。干燥后的原麻含有60 70%纤维素和30 35%非纤维素胶质成份。这些高分子 胶质化合物主要是果胶、半纤维素、木质素及少量的脂肪类蜡质和灰分等。作为纺织面 料原料，苎麻纤维既具有良好的吸热、散湿、透气等其它纤维无法比拟的优点，也有弹性 差、抗皱性及耐磨性不理想，有穿着刺痒感等缺陷。为了满足人们回归自然、追求绿色的 广泛需求，苎麻纤维的高档化开发一直是纺织材料研究领域的热点。
目前，国内苎麻脱胶多数沿用的化学法，用水量大，能耗高，周期长，环境污染严重， 不利于节能减排。化学法对苎麻纤维结构也有一定损伤，影响苎麻服用性能。苎麻生物脱 胶主要是利用微生物产生的高度特异性果胶酶，甘露聚糖酶等生物酶类水解苎麻中的果 胶、半纤维素类物质，而不损伤麻纤维结构。作为环境友好的苎麻脱胶方法，利用有效微
生物菌株及其产生的生物酶完成苎麻的脱胶，既避免了化学法对麻类纤维的损伤破坏，也 因不使用强酸、强碱性原料而避免了对环境的污染。
微生物脱胶就是把经过筛选的具脱胶能力的微生物菌种扩大培养后接种到生苎麻上， 在适宜环境条件下，进行"胶养菌，菌产酶，酶脱胶"的生化反应，即微生物菌株先以生苎 麻上的胶质为营养源，在大量生长繁殖过程中分泌出混合酶系分解胶质，实现纤维的有效 分离。
相对于苎麻的酶法脱胶，微生物法脱胶存在一个显著不同，即将培养好的微生物菌种 直接接种于生苎麻上，使苎麻脱胶与细菌的生长繁殖相伴进行。微生物脱胶的关键是具有 脱胶能力的菌株筛选和培养。菌株筛选涉及到菌株分布的广泛性、生长的快速性、营养特 异性及脱胶高效性。近几年内，国内外均有微生物脱胶菌种筛选的报道。中国农业科学院 麻类研究所彭源德等人筛选了一株脱胶菌株T85-260 ，可在pH5.0 9.0范围内生长，最适 生长pH6.5 7.0，生长温度范围是27 °C 42 °C 。Zheng等人筛选了 3株嗜碱性菌株NT-39， NT-53， NT-76用于苎麻脱胶，不仅降低了苎麻的残胶率，而且还提高了苎麻纤维光泽度。 国外Fredi等人筛选出一株嗜碱性细菌Jm3;c0/ato sp.。在苎麻脱胶过程中，该菌株产生的
5果胶裂解酶作用在纤维胶质上的效率远远高于它所产生的木聚糖酶的作用效率。何绍江等人利用亨氏厌氧技术从沤麻塘泥、麻地和菜园土采集的土样中分离得到苎麻厌氧脱胶菌。胡国全等从麻厂污泥和沼气池的污泥中优选出8株厌氧脱胶性能较好的杆菌，测定其代谢特性并对有效菌株进行了组合，4个组合的脱胶率为33.6% 38.98%。国外也有利用黑曲霉等丝状真菌进行麻类脱胶的报道，然而真菌脱胶普遍存在生长速度慢，脱胶周期长，酸性生长条件，真菌会产生纤维素酶，纤维强力容易受到损害，残胶率高，脱胶效果并不是十分理想。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供具有苎麻脱胶活性的枯草芽孢杆菌菌株、其制备和应用，该菌同时高产果胶酶和半纤维素酶，且对苎麻脱胶效果良好。
根据Blast及聚类分析结果(表l)，该菌与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)相似性为96%,结合生理生化试验结果和镜检分析，命名此菌株为Bacillus subtilisDZs。
该菌株具有在适当的培养和发酵条件下，以高产率产生果胶酶和木聚糖酶的能力，从而，以对苎麻中的果胶类物质的有效去除实现苎麻的微生物深层浸没脱胶。
本发明的具有苎麻脱胶活性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)已于2009年6月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址在北京市朝阳区大屯路，中科院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.3091,其16S rRNA序列见表1 。
本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus subtilis)DZs特征如下呈椭圆或杆形，细胞直径〉lym,菌落圆形，凸起，表面光滑湿润，边缘整齐，呈奶白色不透明状；呼吸类型为好氧呼吸，在有氧条件下生长良好；革兰氏染色阳性，侧生鞭毛，内生孢子呈椭圆形(图4)，过氧化氢酶阳性；在葡萄糖、蔗糖、木糖发酵试验中可产酸，但不产气；在柠檬酸盐培养基上产碱；该菌株能水解明胶、淀粉和油脂；还原石蕊牛奶，迅速消化酪素而凝块少；V-P测定阳性；吲哚反应阴性；甲基红测定阳性。
提取菌株的DNA然后进行PCR扩增，扩增结果见图1，之后的测序工作由上海生工生物技术有限公司完成。测定菌株16SrRNA全序列(见附表1)，用Molecular EvolutionaryGenetics Analysis(version 3)进行系统发育聚类分析(菌株的16S rRNA全序列)，得到图2所示的种系进化树。
在构建的培养条件下，该菌株培养条件粗放，耐热性好，生长繁殖快，产果胶酶和木聚糖酶活性高，且酶活稳定，菌、酶均无毒性。该菌株及培养系统能够直接用于苎麻脱胶。本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株的(B^^M^^rifo)DZ5培养方法，包括-
(1) 在富集培养基和分离培养基中，培养获得自野生型脱胶优势菌株；
(2) 将步骤(1)中得到的菌株依次培养在含果胶的营养培养基和含半纤维素的营养 培养基中进行定向驯化；
(3) 通过透明圈法从上述培养基中选择出具有产果胶酶和半纤维素酶能力的菌株。 所述步骤(1)分离培养基含有苎麻粉、氮源以及无机盐，使用NaOH将pH调节到
7.2-7.4;碳源来自果胶和半纤维素，氮源来自硫酸铵，无机盐选自氯化钾、磷酸氢二钾、 硫酸镁和硫酸亚铁。
所述步骤(2)营养培养基分别以果胶作为唯一碳源的果胶透明圈培养基和半纤维素 作为唯一碳源的半纤维素透明圈培养基。 以该菌株为基础涉及的培养方法-
(O菌种的制备菌种保存用牛肉膏蛋白胨培养基(W/VW):牛肉膏0.5g，蛋白胨lg,
氯化钠0.5g (pH7.4-7.6)， 37°C 200rpm培养过夜，添加冻存缓冲液；
(2)菌种活化剂种子扩大培养将营养肉汤培养基分装于250mL容器中，每个容器 中50mL，封口包扎后，于121 "C灭菌20min;冷却后接入斜面培养24 h的菌一环，在转 速200 r/min、温度40 'C条件下摇瓶培养24 h;
G)发酵体系苎麻发酵培养基(w/v。/。)苎麻原麻5g， KC10.05g，磷酸氢二钾0.1g， MgSO4 0.05g， FeSO4 0.001g， (NH4) 2S04 0.5g， 脱胶在250ml容器中进行，每个容器中 装液量为100ml (含有5g苎麻)，浴比为1: 20，加热煮沸30min后，调节pH值至8， 121°C 灭菌20min后，以5%的接种量接入种子液，将三角瓶置于4(TC条件下200rpm摇床培养， 直至96h后脱胶结束，除去脱胶液，沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗数次以去除苎麻上 的细菌，停止脱胶。
所述步骤(1)冻存缓冲液由磷酸二氢钾0.0627g，磷酸氢二钾0.0177g，柠檬酸钠 0.0588g，七水合硫酸镁0.02645g，甘油10ml，加水定容至100ml制得。
苎麻脱胶培养体系酶活测定-
果胶酶和木聚糖酶活测定方法如下
果胶酶、木聚糖酶用DNS比色法测定，并在此基础上稍作修改。将该菌接种于苎麻 发酵培养基中培养。酶活测定底物分别为0.25%的果胶，1%木聚糖(均用pH4.8的醋酸缓 存液配制)。酶活性测定方法如下d. 取25ml比色管，先加底物1.8ml，再取经8000rpm， 4'C离心15min后的发酵液上清液0.2ml (稀释倍数分别为IOO倍、5倍)，加塞摇匀，50。C水浴保温30min，取出；
e. 加1.5mlDNS显色液并摇匀，立即置沸水中显色5min，取出流水冷却。加蒸馏水稀释至刻度，摇匀；
f. 用灭活处理过的酶液作对照，用UNICO VU2100型分光光度分别在520nm和540nm波长下，计测定果胶酶和木聚糖酶酶活力。
其中，酶活单位定义
每小时酶催化果胶分解生成1毫克游离半乳糖醛酸的酶量定为一个酶活力单位。每分钟催化半纤维素水解生成1微克木糖的酶量定为一个酶活力单位。测得其果胶酶酶活力为169.88U/mL，木聚糖酶酶活力为134.96U/ml，其在pH6.5-9.0，
40'C以下酶活较稳定。
有益效果
(1) 本发明提供菌株及培养系统能够直接用于苎麻脱胶，具有脱胶周期短，纤维分散率达100%，脱胶效率达95%，菌种不易被污染，处理成本低，纤维质量好，脱胶条件温，抗污染能力强，耐热性能好，无环境污染等优点；
(2) 本发明提供的枯草芽孢杆菌经检测可同时高产果胶酶和半纤维素酶，且对苎麻脱胶效果良好；
(3) 本发明具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点。利用该体系进行苎麻脱胶具有脱胶时间短，苎麻纤维分散率达到100%，脱胶率达到卯％以上，精干麻质量达到化学脱胶水平。
图1菌株16S rRNA基因组PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2菌株16S rRNA序列系统发育树；
图3正交试验结果；
图4荚膜染色照片(油镜)。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人
8员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
实施例1
脱胶优势菌株的筛选及鉴定 1)将腐烂苎麻原径剪成1.5-2cm的小段，充分混匀后取5g依次放入装有200mL富 集培养基的250mL锥形瓶中，(富集培养基l:牛肉膏0.3g蛋白胨lgNaCl 0.5g水1000ml， pH7.4-7.6; 富集培养2: K2HP04 0.15g，柠檬酸铁铵0.15g， MgS04 0.15g，甘油6g，柠 檬酸0.6g， L-谷氨酸1.2g，水1000ml， pH 7.4)室温下静置富集培养一个月后，稀释 10-3，10-4,10-5,10-6梯度后,涂布于苎麻分离培养基(苎麻15g, (NH4)2S045g， K2HP04 lg， MgSO40.5g， KC10.5g， FeSO40.01，琼脂20g，水1000mL， pH自然，约7.0-7.2)上28。C， 培养5天后挑取单菌落于苎麻培养基上划线分离。待菌落形成后，观察记录菌落的色泽， 表面形状，隆起状况，边缘形状，透明感等形态特征，结合细胞形态，革兰氏染色等镜检 结果进行分析，挑取单菌落，划线分离，纯化后保存。将初筛获得的菌种点种于果胶培养 基(果胶2g， NAN03 3g， K2HP04 0.5g， MgS04 lg，琼脂20g,水1000mL)和半纤维 素培养基(半纤维素(自制)20g， NH4N032g， K2HP042g， MgS04 0.2g，酵母膏5g， 琼脂20g，水lOOOmL)平板上，细菌用滤纸片接种，霉菌点种，放线菌划线接种，每株 个点3个重复，28"C培养72h，带菌落形成后，用0.2。/。刚果红水溶液染色4h，倒去表面剩 余刚果红溶液，加入少量蒸馏水荡去薄层表面刚果红，对光即可见明显的绛红色水解圈。 在菌落周围出现绛红色水解圈者即为果胶分解菌。测量果胶琼脂平板上菌周围的透明圈直 径和菌落直径，水解圈与菌落直径之比大者一般有较高果胶酶活力。半纤维素水解圈不需 要染色可直接测得。 2) 16SrRNA测定
参考试剂盒的使用说明提取细菌基因组DNA。
PCR扩增选用细菌16S rRNA基因通用引物，正向引物BSF8/20 ， 5/-AGAGTTTGATCCTGGCTAAG-3/ (E.coli对应位置为8 27);反向引物BSR1541/20, 5/-AAGGAGGTGATCCAGCCG-3/ (E.coli对应位置为1541 1522)。 PCR反应在50(il反 应体系中进行，其中含有Taq酶0.3^1， 10xBuffer 5^1， dNTP4pl，引物2pl，模板DNA 2^1。 PCR扩增条件为94。C预变性4min后，接着以94。C变性lmin， 53。C退火30s， 72°C 延伸1.5min，经35个循环后72'C延伸10min，后将系统稳定在4°C。取3pL的PCR产物，在1。/。的琼脂糖凝胶100V。下电泳30min，电极缓冲液为0.5xTAE，然后用溴化乙锭(EB) 染色检验扩增产物(结果见图2)。序列的常规分析使用DNAMAN、 DNASTAR等软件进 行。序列同源性搜索使用Blast在NCBI (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行。并应 用Molecular Evolutionary Genetics Analysis(version 3)对其进行进化树的构建，GenBank中 的相近序列用clustalW程序进行多序列匹配排列(multiple alignments)分析，最后形成一 个多重序列匹配排列阵，用Neighbor-Joining法构建系统进化树，使用Kimura 2-parameter 法，系统树各分枝的置信度经重抽样法(Bootstrap) 1000次重复检测，得到图3所示的种 系进化树。
实例2
苎麻脱胶过程及其结果
苎麻微生物脱胶在250ml三角瓶中进行，每个三角瓶中装液量为100ml (含有5g苎麻 原麻)，浴比为1: 20，加热煮沸30min后，调节pH值，121。C灭菌20min后，将三角瓶 至于不同条件下摇床培养。直至脱胶结束，除去脱胶液，沸水浴中煮沸5min，用自来水冲 洗数次以去除苎麻上的细菌，停止脱胶。
该菌株接种于含灭菌处理过的苎麻发酵培养基(苎麻原麻5%， (NH4)2S04 0.5%， MgS04 0.05%, KC10.05%， K2HPO40.1%， FeS04 0厕％)中，40°C， 200rpm进行摇床发 酵培养，1天后即可见苎麻纤维有明显的分散，发酵液颜色变深变浑浊；发酵2天后原本 成束的苎麻已完全分散成纤维状，发酵液明显变稠， 经过4天发酵后苎脱胶率达到90%以 上，这表明此菌株具有较强的脱胶能力。表l 16SrRNA序列
ATGCTATCTGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTA
GCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGAT
AACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGT
TCAAACATAAAAGGTGGCTTTGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCG
CATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCC
GACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTC
CTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACG
GAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTG
TTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCT
AACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG
GTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTT
TCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGA
AACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTACACGTGTAGCG
GTGAAATGCGTAAAGATGTGGAGGAACACCAGTGTCGAAGGCGACTCTCT
GGTCTGTAACTGACGCTGAAGAGCGAATACGTGGGGAGCGAACAGGATCA
AATACCCCGGGTAGTCCACGCCGATACGATGATTTCTTTGTGTTAGGGGT
TTCCGCCCCTTTTGCTGCAGATACGCTCAAGCTCTCCGCCAGGGTAGTGG
TTGGCTGACATAATCTCCACGACTGAGGGGAAT
1权利要求
1.具有苎麻脱胶活性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DZ5CGMCC No.3091，其16S rRNA序列如下ATGCTATCTG CAAGTCGAGC GGACAGATGG GAGCTTGCTC CCTGATGTTAGCGGCGGACG GGTGAGTAAC ACGTGGGTAA CCTGCCTGTA AGACTGGGATAACTCCGGGA AACCGGGGCT AATACCGGAT GGTTGTTTGA ACCGCATGGTTCAAACATAA AAGGTGGCTT TGGCTACCAC TTACAGATGG ACCCGCGGCGCATTAGCTAG TTGGTGAGGT AACGGCTCAC CAAGGCAACG ATGCGTAGCCGACCTGAGAG GGTGATCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTCCTACGGGAGG CAGCAGTAGG GAATCTTCCG CAATGGACGA AAGTCTGACGGAGCAACGCC GCGTGAGTGA TGAAGGTTTT CGGATCGTAA AGCTCTGTTGTTAGGGAAGA ACAAGTACCG TTCGAATAGG GCGGTACCTT GACGGTACCTAACCAGAAAG CCACGGCTAA CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGTAGGTGGCAAGCG TTGTCCGGAA TTATTGGGCG TAAAGGGCTC GCAGGCGGTTTCTTAAGTCT GATGTGAAAG CCCCCGGCTC AACCGGGGAG GGTCATTGGAAACTGGGGAA CTTGAGTGCA GAAGAGGAGA GTGGAATTAC ACGTGTAGCGGTGAAATGCG TAAAGATGTG GAGGAACACC AGTGTCGAAG GCGACTCTCTGGTCTGTAAC TGACGCTGAA GAGCGAATAC GTGGGGAGCG AACAGGATCAAATACCCCGG GTAGTCCACG CCGATACGAT GATTTCTTTG TGTTAGGGGTTTCCGCCCCT TTTGCTGCAG ATACGCTCAA GCTCTCCGCC AGGGTAGTGGTTGGCTGACA TAATCTCCAC GACTGAGGGG AAT
2. 具有苎麻脱胶活性的枯草芽孢杆菌菌株的(^"C77/MW^'fo)DZ5培养方法，包括(1) 在富集培养基和分离培养基中，培养获得自野生型脱胶优势菌株；(2) 将步骤(1)中得到的菌株依次培养在含果胶的营养培养基和含半纤维素的营养 培养基中进行定向驯化；(3) 通过透明圈法从上述培养基中选择出具有产果胶酶和半纤维素酶能力的菌株。
3. 根据权利要求2所述的具有苎麻脱胶活性的枯草芽孢杆菌菌株的(S^!7/r^ rato'to)DZ5培 养方法，其特征在于所述步骤(1)分离培养基含有苎麻粉、氮源以及无机盐，使用NaOH 将pH调节到7,2-7.4;碳源来自果胶和半纤维素，氮源来自硫酸铵，无机盐选自氯化钾、 磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸亚铁。
4. 根据权利要求2所述的具有苎麻脱胶活性的枯草芽孢杆菌菌株的(Bacillus subtilis)DZ5培养方法，其特征在于所述步骤(2)营养培养基分别以果胶作为唯一碳源的果胶透明圈培养基和半纤维素作为唯一碳源的半纤维素透明圈培养基。
5. 具有苎麻脱胶活性的枯草芽孢杆菌的应用，具体过程如下(1) 菌种保存用牛肉膏蛋白胨培养基w/vy。牛肉膏0.5g，蛋白胨lg，氯化钠0.5g， 37°C 200rpm培养过夜，添加冻存缓冲液；(2) 将营养肉汤培养基分装于250mL容器中，每个容器中50mL，封口包扎后，于121 。C灭菌20min;冷却后接入斜面培养24 h的菌一环，在转速200 r/min、温度4(TC条件下 摇瓶培养24h;(3) 苎麻发酵培养基w/v。/。苎麻原麻5g， KC10.05g，磷酸氢二钾0.1g， MgS04 0.05g， FeSO4 0.001g， (NH4) 2SO40.5g， 脱胶在250ml容器中进行，每个容器中装液量为100ml 含有5g苎麻，浴比为l: 20，加热煮沸30min后，调节pH值至8， 121。C灭菌20min后， 以5%的接种量接入种子液，将三角瓶S于40t:条件下200rpm摇床培养，直至96h后脱胶 结束，除去脱胶液，沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗数次以去除苎麻上的细菌，停止脱 胶。
6. 根据权利要求5所述的具有苎麻脱胶活性的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于所述步 骤(1)冻存缓冲液由磷酸二氢钾0.0627g，磷酸氢二钾0.0177g，柠檬酸钠0.0588g，七水 合硫酸镁0.02645g，甘油10ml，加水定容至100ml制得。
7. 根据权利要求5所述的具有苎麻脱胶活性的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于苎麻脱 胶培养体系果胶酶和木聚糖酶活测定方法如下-果胶酶、木聚糖酶用DNS比色法测定，并在此基础上稍作修改；将该菌接种于苎麻 发酵培养基中培养；酶活测定底物分别为0.25%的果胶，1%木聚糖，酶活性测定方法如下-a. 取25ml比色管，先加底物1.8ml，再取经8000rpm， 4'C离心15min后的发酵液上 清液0.2ml，加塞摇匀，5(TC水浴保温30min,取出；b. 力Q1.5mlDNS显色液并摇匀，立即置沸水中显色5min,取出流水冷却。加蒸馏水 稀释至刻度，摇匀；c. 用灭活处理过的酶液作对照，用UNICO VU2100型分光光度分别在520nm和 540nm波长下，计测定果胶酶和木聚糖酶酶活力。
8.根据权利要求7所述的具有苎麻脱胶活性的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于测得其果胶酶酶活力为169.88U/mL，木聚糖酶酶活力为134.96U/ml，其在pH6.5-9.0， 40。C以下 酶活较稳定。
全文摘要
本发明涉及具有苎麻脱胶活性的枯草芽孢杆菌菌株、其制备和应用，利用以该菌株为核心的体系用于苎麻脱胶。该体系菌种繁殖速度快，果胶酶和木聚糖酶产率高，生产周期短，抗污染能力强，耐热性能好。体系及培养过程操作安全，无毒性、无环境污染。与现有技术相比，本发明具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点。利用该体系进行苎麻脱胶具有脱胶时间短，苎麻纤维分散率达到100％，脱胶率达到90％以上，精干麻质量达到化学脱胶水平。
文档编号C12N1/20GK101654660SQ20091005478
公开日2010年2月24日 申请日期2009年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者张兴群, 曹张军, 陈杨栋 申请人:东华大学