专利名称：一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物动物细胞领域，具体涉及具有门静脉转移潜能的肝癌细胞系。
背景技术：
原发性肝癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，未经治疗的病人中位生存期不到一 年。手术切除是目前肝癌治疗最有效的措施。但即使切除了肿瘤，术后大多数病人仍死于 术后肿瘤复发转移。肝癌转移的主要特征是向门静脉内生长而形成门静脉癌栓。上海东方 肝胆外科医院对5524例肝癌患者行肝肿瘤切除术，切除标本发现门静脉内已形成癌栓的 比例达67. (中华外科杂志，2001，39:25-28)；通过对肝癌门静脉癌栓生长特征的研究 提出了癌栓分为5型8个亚型(中国现代普通外科进展，2003,6 171-173)，对肝癌合并门 静脉癌栓的患者的临床治疗及预后判断提供了重要的参考。但是目前对肝癌门静脉癌栓形 成的分子机制方面的研究还不够深入，纵观国内外人肝癌细胞系模型，尚无具有门静脉转 移潜能的人肝癌细胞系，无法在动物体内构建门静脉癌栓形成的过程，也就难以了解癌栓 倾向性生长的分子机制，无法寻找癌栓形成的防治策略。CN1338512A公开了利用人肝癌原位接种至裸鼠肝脏，从裸鼠的肺转移灶中取 材建立了人肝癌细胞系，为肝癌肺转移的机理和防治肺转移提供了适宜的实验材料。而 CN1232874A公开了利用人肝癌高转移的裸鼠模型移植瘤作为建系瘤源，采用体外培养结合 动物体内再接种生长的方式交替进行，建成具有高转移潜能的细胞系MHCC97。而来源于人 肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系及其建系方法方面罕有报道，具有门静脉转移倾向的肝癌细 胞系则未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系，命名 为人肝癌细胞系CSQT-2，保藏在武汉中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址武汉大 学，保藏日期2009-02-19，保藏编号C200913。本发明的第二个目的在于提供一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NO :C200913)的建系方法。为实现上述发明目的，本发明公开如下技术方案一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NO :C200913)，其特征在于将 该细胞形成的皮下移植瘤接种到裸鼠肝脏成瘤后，能检测到门静脉癌栓的形成，具有很强 的门静脉癌栓形成能力，且裸鼠门静脉癌栓与原移植瘤的组织结构相似。这株细胞系的核 型分析显示为超三倍体，主流在67-94条，占总数的88%。一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NO :C200913)的建系方法，包 括以下步骤(1)人肝癌门静脉癌栓组织在裸鼠皮下异种移植取手术切除的新鲜手术癌栓标本用D-Hand’ s冲洗干净，剔除纤维组织和血污，取鲜鱼肉状即活力强的部位剪成Imm大小碎块异种移植于裸鼠的皮下，建立人肝癌门静脉癌 栓裸鼠模型。(2)皮下移植瘤传代；术后观察裸鼠2次/日，皮下移植瘤长至直径为1.5cm左右时取出，去除坏死组 织，将新鲜的肿瘤组织剪切成约Imm大小，手术埋于裸鼠大腿背侧皮下，如此反复操作，构 建了皮下移植瘤的传代模型。(3)利用第5代皮下移植瘤进行 裸鼠肝脏接种从第5代的皮下移植瘤组织取材，进行裸鼠肝脏接种，形成裸鼠原位移植瘤模型， 其肝脏成瘤能力为100%，成瘤潜伏期为11 士2天。(4)利用肝脏肿瘤进行原代培养建系包括a.癌栓细胞的获取及原代培养；b.肿瘤“细胞岛”的克隆扩大培养；C.肿瘤 细胞的传代培养并建系。本发明所公开的一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系及其建系方法，其优点 表现在1、该细胞系(CCTCC NO :C200913)是从门静脉癌栓取材的，对肝癌门静脉癌栓形成 机制及倾向性生长机制有其他现存肝癌细胞系无法比拟的优点。(目前所存的肝癌细胞系 多从肝癌原发灶、肝癌的肺转移灶中取材，比如MHCC97。)2、将该细胞形成的皮下移植瘤接 种到裸鼠肝脏成瘤后，能检测到门静脉癌栓的形成，具有很强的门静脉癌栓形成能力。3、建 系方法的特异性从人肝癌门静脉癌栓取材并进行裸鼠原位移植，然后建立的细胞系，具有 门静脉转移潜能，对门静脉癌栓的形成机制研究提供了适宜的材料。
下面结合说明书附图，对本发明进一步详细说明。命名为CSQT-2的一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系，保藏在武汉中国典 型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2009-03-02，保藏编号C200913。图1 门静脉癌栓裸鼠皮下移植瘤。图2:裸鼠肝脏移植瘤。图3 单层贴壁生长的CSQT-2细胞(40 X)，细胞为簇样生长，细胞成典型的上皮样 细胞，其形状不规则，排列紧密，界限清楚，生长接触性抑制丧失。图4 :CSQT-2扫描电镜(3000X)，细胞表面有皱褶，周围有微绒毛或指状突起。图5 :CSQT_2细胞的透射电镜图片(3000X)，具有丰富的细胞器，箭头所指为细胞 间紧密连接。图6 :CSQT-2细胞的生长曲线图，在DMEM培养条件下，细胞群体倍增时间为36小 时。图7 :CSQT-2细胞的核型分析图，为超三倍体核型。图8 :CSQT-2细胞的染色体众数表。图9 :CSQT-2细胞的镜下门静脉癌栓(HE染色40X)。
具体实施例方式实施例
一、门静脉癌栓裸鼠皮下移植瘤模型及肝脏原位移植模型的构建(一)、材料1.手术器械 敷料剪，眼科镊，直尖剪，弯尖剪，眼科剪，持针钳(上海医疗器械有限公司手术器 械厂)2.标本来源上海东方肝胆外科医院患者刘XX (住院号115581)，男，60岁，术前征得患者本 人同意，签署知情同意书，术中切除的肝癌及门静脉癌栓标本。术后病理诊断为肝细胞癌伴 门静脉癌栓。3.实验动物BALB/c-nu/nu裸鼠，鼠龄为4 5周，由中国科学院上海斯莱克实验动物中心提{共。(二)、方法将人门静脉癌栓新鲜组织种植到裸鼠皮下，构建皮下移植瘤模型，具体操作如 下皮下移植瘤模型(命名为CSQT-2N)a.将手术切除的新鲜手术肝癌及癌栓标本用D-Hand’ s冲洗干净，剔除纤维组织 和血污，取鲜鱼肉状即活力强的部位剪成Imm大小碎块，备用。b. 的戊巴比妥钠50ul/10g裸鼠，腹腔注射。c.裸鼠大腿腹股沟侧用碘酒、酒精皮肤消毒，切开皮肤，将新鲜的肝癌组织或者癌 栓组织碎块包埋到皮下后缝合皮肤，一只裸鼠种植四个点位。d.待裸鼠苏醒后放回笼子。e.术后观察裸鼠2次/日，皮下移植瘤长至直径为1. 5cm左右时取出，去除坏死组 织，剪切成约2mm大小，手术埋于裸鼠大腿背侧皮下，如此传代5-7次，获取生长旺盛的移植 瘤进行肝包膜下原位移植。f.计算第1代，第3代，第5代移植瘤的成瘤潜伏期，瘤体直径大小。原位移植模型构建a.脱颈处死稳定传代的第5代皮下荷瘤裸鼠，碘酒、酒精皮肤消毒，取出皮下肿瘤。b.将皮下肿瘤立即浸入含青霉素、链霉素各lOOu/ml的1640培养基中。剔除周围 结缔组织，取肿瘤生长旺盛的部分，剪成2mm大小碎块，备用。c.实验动物以戊巴比妥钠(浓度l%，50ul/10g)腹腔麻醉，碘酒、酒精皮肤消毒， 0. 5%碘伏消毒，取左上腹横切口约1. 5厘米，进入腹腔暴露肝左叶。先用8-0丝线穿过肝 脏行8字缝合准备，然后用手术刀于丝线之间的肝包膜上戳一小孔，生理盐水纱布按压片 刻止血，将肿瘤组织小块移植于肝包膜下，将8字缝合线拉紧固定，彻底止血后逐层关腹。d.待裸鼠苏醒后放回饲养的笼子，5周后处死裸鼠。e.观察指标为肝脏病理切片有无门静脉癌栓的形成。(三)、结果皮下移植瘤模型(CSQT-2N)
第1代移植瘤成瘤率为80% (16/20)，潜伏期为28士3天，肝脏及肺脏未见明显的 转移灶。第3代移植瘤成瘤率为100% (20/20)，潜伏期为18士2天，肝脏及肺脏未见明显 的转移灶。第5代移植瘤成瘤率为100% (20/20)，潜伏期为11 士2天，皮下移植瘤如图1。 具体情况详见表一。表一 CSQT-2N各代移植瘤成瘤性和转移性
权利要求
一株具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NOC200913)，其特征在于将该细胞形成的皮下移植瘤接种到裸鼠肝脏成瘤后，能检测到门静脉癌栓的形成，且裸鼠门静脉癌栓与原移植瘤的组织结构相似。
2.根据权利要求1所述的具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCCN0:C200913), 其特征在于所述门静脉癌栓的形成率为80%。
3.根据权利要求1所述的具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCCN0:C200913), 其特征在于该细胞系为异倍体核型，染色体数目和结构畸变。
4.根据权利要求1或3所述的具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCCNO C200913)，其特征在于所述细胞系的核型分析显示为超三倍体，主流在67-94条，占总数 的 88%。
5.一株具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NO :C200913)的建系方法，包括 以下步骤(1)、人肝癌门静脉癌栓组织在裸鼠皮下移植；(2)、皮下移植瘤传代；(3)、利用第五代皮下移植瘤进行裸鼠肝脏接种；(4)利用肝脏肿瘤进行原代培养建系。
全文摘要
本发明公开了一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NOC200913)及其建系方法，将该细胞形成的皮下移植瘤接种到裸鼠肝脏成瘤后，能检测到门静脉癌栓的形成，具有很强的门静脉癌栓形成能力。建系方法包括以下步骤(1)人肝癌门静脉癌栓组织在裸鼠皮下移植；(2)皮下移植瘤传代；(3)利用第五代皮下移植瘤进行裸鼠肝脏接种；(4)利用肝脏肿瘤进行原代培养建系。其优点表现在CSQT-2细胞是从人门静脉癌栓组织中取材的，通过裸鼠肝脏异种原位移植后培养出来，该细胞系具有很强的门静脉癌栓形成能力，对肝癌门静脉癌栓形成机制及倾向性生长机制有其他现存肝癌细胞系无法比拟的优点，具有广泛的应用前景。
文档编号C12R1/91GK101955914SQ20091005474
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者吴孟超, 王涛, 程嘉颖, 程树群, 胡华生, 谢东 申请人:中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院