专利名称：：克力托辛在制备抗肿瘤多药耐药性药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属制药
技术领域：
，涉及克力托辛在制备抗肿瘤多药耐药性药物中的应用。
背景技术：
：肿瘤化疗是治疗肿瘤的一种基本手段，但肿瘤化疗的效果会因为肿瘤细胞获得抗药性而失败，多药耐药(multipledrugresistanceMDR)指肿瘤细胞对不同结构和作用机理的多种药物产生交叉耐药性，是化疗失败的主要原因。MDR的产生机制复杂，其中一个原因与MDR1基因编码产物--ATP能量依赖性药物外排泵P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)过度表达有关，致使药物外排增加，细胞内药物浓度减少；此外，也与细胞凋亡过程有关，缺失凋亡蛋白Bax或过表达抗凋亡蛋白Bcl-2均会导致某些肿瘤细胞产生多药耐药性。目前临床上使用的抗癌药物，阿霉素，表阿霉素，丝裂霉素，柔红霉素，紫杉醇，长春新碱，顺铂等，均为P-糖蛋白的底物，为耐药肿瘤细胞所抗，因此，当肿瘤细胞内P-gp高表达后，肿瘤细胞获得的抗药性，并不针对一种抗癌药，而是对多种抗癌药，即多药耐药，要增加P-gp高表达肿瘤细胞对药物的敏感性，最有效的办法就是抑制这种蛋白的功能，使其不能发挥"药泵"作用，并增强肿瘤细胞的凋亡，因此研制抑制这种蛋白功能的药物对肿瘤的化疗有重要意义，目前临床上还没有一种针对P-gp的药物。
发明内容本发明的目的是提供克力托辛(clitocine)在制备抗肿瘤多药耐药性的药物中的应用，该clitocine是从高等真菌大白桩燕菌(丄ewco/oxz7/w子实体中分离所得，分子式为C9H13N506，分子量287。所述药物由克力托辛与制剂允许的药物赋形剂或载体组成。本发明所述的高等真菌大白桩菇菌awC0;7axZ//W<$g/gaw^^)属白蘑科，夏秋季于草原上单生或群生，有时生于林中草地上。分布于河北、内蒙古、吉林、辽宁、山西、黑龙江、青海、新疆等地。本发明提供的药物，其制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、软胶丸、软胶囊、滴丸剂或注射剂。本发明提供的药物，制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。克力托辛对多药耐药肿瘤细胞的杀伤作用明显优于紫杉醇，阿霉素，顺铂等临床常用药，克力托辛杀死高表达P-糖蛋白肿瘤细胞的机理是抑制P-糖蛋白的功能并诱导细胞凋亡，与其亲本药敏细胞一致，目前临床上缺乏能逆转肿瘤多药耐药性的药物，因此克力托辛具有很好的制备抗肿瘤多药耐药性药物的应用前景。图1是克力托辛的液相色谱分析。图2是耐药肿瘤细胞及亲本药敏细胞的P-糖蛋白表达量比较。图3是不同浓度克力托辛抑制HepG2和R-HepG2体外增殖比较。图4是克力托辛诱导HepG2和R-HepG2细胞产生DNA梯状条带的凝胶电泳比较图。图5是克力托辛诱导HepG2和R-HepG2细胞凋亡的AnnexinV-PI双染凋亡比较图。图6是克力托辛诱导HepG2和R-HepG2细胞线粒体膜电位变化的JC-1染色比较图。图7是克力托辛诱导HepG2和R-HepG2细胞释放细胞色素c的免疫印迹比较。图8是Caspase-8抑制剂逆转克力托辛诱导的HepG2和R-HepG2凋亡作用比较图。图9是Caspase-9抑制剂逆转克力托辛诱导的HepG2和R-HepG2凋亡作用比较图。图10是克力托辛抑制R-HepG2的P-糖蛋白表达免疫印迹图。图11是克力托辛部分逆转R-HepG2对阿霉素的抗药性。具体实施例方式以下将结合具体实施例与附图详细说明本发明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例一从新鲜大白桩菇菌子实体提取分离纯化抗肿瘤活性化合物及其结构鉴定实验方法l.提取和纯化将原料新鲜大白桩菇菌子实体(2.7kg)真空冷冻干燥，粉碎机粉碎，所得340g菌粉浸于1.5L95%(v/v)酒精中，其间更换新鲜溶剂一次，合并两次浸提液，减压浓縮得酒精浸膏(25.7g)，浸膏经乙酸乙酯萃取，减压浓縮得乙酸乙酯浸膏(15.7g)。取15g乙酸乙酯浸膏上硅胶柱，CH2Cl2/MeOH(10:0-0:10)梯度洗脱，收集细胞筛选有活性的洗脱峰(6.5g)，然后上反相株RP-18(ODS,50pm，025x420mm)，MeOH/H20(1:9)洗脱，细胞筛选有活性的部分再经过反相株RP-C8制备[5020x250mm;MeOH/H20(5:95);8ml/min]，得到目的化合物克力托辛(815mg)。其液相色谱分析图参见附图1，在洗脱时间9.0分时出现单一峰即为克力托辛。2.结构鉴定核磁共振仪(INOVA-400)，质谱仪(BrukerEsquire3000plus)3.实验结果克力托辛，分子式为C9H13N506，ESI-MS:m/z287。其一维的二维的核磁数据列于表1，根据这些数据与文献比较所得克力托辛的化学结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>表1克力托辛的核磁数据<table>complextableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>C3'70.4(d)71.7(d)4.09(1H,t,9.83)3.94(1H,t,9.98)C4'84.4(d)83.6(d)3.81(lH，dd,3.11,6.98)3.82(1H,dd,4.60,8.64)C5'60.9(t)62.0(t)3.46(2H，dd,5.16,10.45)3,44(2H,dd，6.80,11.55)N49.30(1H，d,7.52)9.9680(1H，d,8.45)N68.57(2H,brs)8.60(2H,brs)02'5.23(1H，brs)5.64(m,brs)03'5.08(1H，brs)5.26(1H,brs)05'4.78(1H,brs)4.77(1H,brs)实施例二肝癌HepG2细胞和R-HepG2对临床抗肿瘤药的敏感性及P-糖蛋白表达量的比较实验材料和方法肝癌细胞HepG2购自美国AmericanTypeCultureCollection,耐药细胞R-HepG2的建立，系由HepG2加抗癌药物阿霉素培养，存活下来的细胞继续添加较高浓度的阿霉素继代培养，不断培养一段时间后，挑选抗药性克隆建系即R-HepG2。两株细胞均培养在DMEM培养基(Invitrogene)，添加5%小牛血清(Invitrogene)，2mM谷氨酰胺，37°C，10%0)2培养箱。四甲基偶氮唑盐(简称MTT法)检测药物对肿瘤细胞增殖的影响选择对数生长期细胞，以1><104的密度接种于96孔板中，置37"C，10%培养箱中培养4小时后加入不同浓度的药物，每个浓度设复孔6个，培养48小时，吸出孔板中培养液，往每孔中加入浓度为lmg/ml的MTT50^，放入培养箱中继续培养4小时，取出加过MTT的96孔板，每孔加入150|il的DMSO，轻轻震荡孔板10min，待孔底部的结晶物完全溶解后，将孔板放入酶标仪中测波长在570nm的各孔的光吸收值，记录结果，实验重复三次，用IC5Q软件计算半数增殖抑制浓度IC5o。Westernblot实验3xl(^个对数生长期的HepG2和R-HepG2细胞与克力托辛共同孵育48h，用RIPA裂解液裂解，14,000xg离心7min后，用Bradfor测定蛋白浓度，在12%SDS-PAGE胶上进行电泳，胶上的斑点转移到PVDF膜上，然后与P-糖蛋白抗体在室温下孵育，清洗后再与二抗共同孵育。最后用ECL试剂盒(Amersham)进行显色观察。阿霉素，顺铂，紫杉醇，MTT均购自Sigma公司，P-糖蛋白抗体购自SantaCruz。克力托辛溶解在DMSO中配成lmg/ml母液，置于-2(TC冰箱，实验时用培养液稀释成所需浓度供用。实验结果见表2和附图2。表2为不同浓度的临床抗肿瘤药阿霉素，顺铂和紫杉醇分别作用于HepG2和R-HepG2，其半数增殖抑制浓度IC5o和耐药指数RI的比较。由表中可见，三种抗肿瘤药作用于HepG2的ICso小于作用于R-HepG2，均表现出HepG2细胞对这些药物敏感而R-HepG2细胞耐药，相应的耐药指数(RI)，即耐药株R-HepG2与亲本敏感株HepG2的IC5Q值之比对阿霉素，顺铂和紫杉醇分别是50，3.3和2.5。说明R-HepG2是来自HepG2的多药耐药细胞株，且对多种抗癌药物有耐受性，尤其抗阿霉素。表2.HepG2和R-HepG2对抗肿瘤药的敏感性抗肿瘤药IC50(pM)HepG2R-HepG2RI阿霉素4〉200〉50顺铂501673.3紫杉醇20502.5Clitocin60.490.350.7为了进一步说明耐药株R-HepG2所以耐药的分子基础，我们用WesternBlot的方法检测P-糖蛋白在两种肿瘤细胞株中的表达，结果见附图2，图A、B分别表示HepG2和R-HepG2细胞P-糖蛋白表达量的免疫印迹图，可见，P-糖蛋白在耐药株R-HepG2中表达量高，而在其亲本药敏株HepG2中几乎不表达，因此得出结论R-HepG2为P-糖蛋白高表达的耐药细胞株，换言之，P-糖蛋白高表达是R-HepG2肿瘤细胞耐药的主要原因。实施例三克力托辛对HepG2和R-HepG2的体外增殖抑制实验材料和方法细胞来源和MTT法同实施例二实验结果见附图3。克力托辛对HepG2细胞和R-HepG2细胞的体外增殖抑制均呈剂量依赖性，且R-HepG2细胞对其更敏感，克力托辛作用48h，对HepG2和R-HepG2的半数增殖抑制浓度IC5o分别是0.49pM和0.35pM，抗药指数RI为0.71，远小于阿霉素50(表2)，表明R-HepG2对clitocine没有抗药性。实施例四克力托辛抑制HepG2和R-HepG2体外增殖分子机制实验材料和方法实验材料同实施例二方法1:DNA梯状条带实验肿瘤细胞HepG2和R-HepG2经不同浓度的clitocine处理48h后收集细胞，加裂解液在45""C裂解lh(5mMTris-HCl,100mMEDTA,1%(w/v)SDS,and蛋白酶K)，基因组DNA用酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提，70%酒精-20匸下沉淀，用RNA酶除去RNA后，加40吗DNA在1.2%琼脂糖凝胶上电泳并经凝胶成像仪拍照。方法2:AnnexinV-PI双染实验约3xl05个对数生长期的肝癌HepG2和R-HepG2细胞与clitocine共同孵育48h，，胰酶消化收集细胞，PBS清洗一次，加入500^1的AnnexinV-FITC结合缓冲液，含25^1的AnnexinV-FITC和5^1的PI缓冲液，然后避光孵育15min，用FACSCanto流式细胞仪(BectonDickinson)分析结果。实验结果见附图4-5。细胞凋亡最典型的特征之一，是细胞在接受药物作用后，DNA会被核酸酶在核小体连接处切断，产生180-200bp或其整数倍大小的DNA碎片，琼脂糖凝胶电泳时呈现有规则的梯状体条带，这是区分凋亡与坏死的重要标志[1()]。附图4中，图A表示HepG2细胞，图B表示R-HepG2细胞的凝胶电泳图，从左至右每一条带分别代表100bp标记、clitocine浓度0、0.3jiM、0.6pM和0.9pM处理，可以看出clitocine可诱导HepG2和R-HepG2都产生典型的凋亡条带，且R-HepG2对其更敏感，在低浓度0.3pM时条带已清晰可辨，而HepG2则在较高浓度0.6|liM才依稀可见。细胞凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)会从细胞膜内翻转到细胞膜外，AnnexinV可与其结合，而凋亡细胞的细胞膜仍然保持完整，染料PI不能进入细胞进行染色，因此通过AnnexinV-PI双染实验，可区分凋亡与坏死细胞。附图5中，图A、C、E代表HepG2细胞的三个不同clitocine浓度0、0.3pM、0.6pM处理，B、D、F则代表R-HepG2相同的三个处理浓度，每张图的右下角百分数都表示该细胞在对应药物浓度下的凋亡百分率，而右上角百分数则代表相同条件下的死亡百分数，可以看出，clitocine均诱导两个细胞株产生凋亡，但对R-HepG2诱导更多的细胞产生凋亡，在相同浓度0.3)nM时，HepG2和R-HepG2产生的凋亡细胞百分比分别是6.24。/。和15.89%而0.6pM时，HepG2和R-HepG2产生的凋亡细胞百分比分别是8.22%和26.71%。实施例四表明，clitocine抑制HepG2和R-HepG2体外增殖是通过诱导HepG2和R-HepG2产生凋亡，且耐药株R-HepG2的敏感性高于其亲本药敏细胞HepG2。实施例五clitocine诱导HepG2和R-HepG2细胞产生凋亡的途径实验材料和方法实验材料同实施例二方法1，线粒体膜电位(A甲m)变化HepG2和R-HepG2细胞(2xl05)分别与不同浓度的克力托辛共孵育48h后，收集细胞与10pMJC-1在37。C黑暗中共孵育15min，用FACSCanto流式细胞仪(BectonDickinson)分析结果。方法2，细胞色素c的变化HepG2和R-HepG2细胞(2xl0"分别与不同浓度的克力托辛共孵育一段时间后，收集细胞用裂解液室温下破膜30秒(75mMNaCl,1mMNaH2P04,8mMNa2HP04,250mMsucrose,1mMPMSF，5mg/mlleupeptin,21mg/mlaprotinin)含狄吉宁(25|ig/106个细胞)，10000rpm离心lmin，取上清液中的蛋白在12%SDS-PAGE胶上进行电泳，胶上的斑点转移到PVDF膜上，然后与细胞色素c抗体在室温下孵育，清洗后再与二抗共同孵育。最后用ECL试剂盒(Amersham)进行显色观察。实验结果见附图6-7。凋亡早期往往伴随着线粒体膜的破裂，导致线粒体膜电化学的变化。使用线粒体特异性染料JC-1，可以检测这种变化。当膜电位高时，JC-1以聚合体形式发出红色荧光，当膜电位降低时，线粒体膜破裂，JC-1可选择性进入线粒体并以单体形式发出绿色荧光，两种荧光的百分比可以反映出线粒体膜电位的变化[12]。附图6中，图A、B、C分别代表HepG2细胞的三个不同浓度处理即0、0.3laM和0.6iaM，图D、E、F则代表R-HepG2同样的三个处理浓度，每张图的右下角百分数都表示该细胞在对应药物浓度下绿色荧光百分率，可见，克力托辛作用于HepG2和R-HepG2，导致两者绿色荧光百分率上升，表明细胞线粒体膜电位下降，线粒体膜破裂，在0.3pM时，JC-1绿色荧光百分数在HepG2和R-HepG2细胞中的百分率分别是19.44%，31.29%，而0.6iiM时，HepG2和R-HepG2细胞绿色荧光百分率23.93%，40.37%，表明R-HepG2对克力托辛更敏感，线粒体受损程度更大。伴随着线粒体膜电位下降，线粒体膜破裂。线粒体内膜蛋白如细胞色素c外流。细胞色素c外流也被认为是线粒体依赖的凋亡过程中一个关键的特征^。附图7中，图A、B分别表示HepG2和R-HepG2的细胞色素c表达量的免疫印迹图，从左至右依次代表clitocine浓度和时间分别为0、24h(0.3pM、0.6pM、0.9^iM)、48h(0.3j^M、0.6)LiM、0.9]LiM)，可见克力托辛作用于HepG2和R-HepG2，与对照相比，细胞色素c从破裂的线粒体中释放到细胞液，在其中的表达量随克力托辛作用时间延长和浓度增加而逐渐增多，并且R-HepG2对克力托辛更敏感，同样处理下细胞色素c的表达量更多，这与其线粒体受损程度大是一致的。实施例五从线粒体膜电位变化和细胞色素c释放的角度进一步表明，克力托辛诱导HepG2和R-HepG2产生凋亡，通过线粒体依赖途径，并且耐药株R-HepG2的敏感性高于其亲本药敏细胞HepG2。实施例六caspase家族抑制剂对克力托辛诱导凋亡的作用实验材料和方法实验材料同实施例二方法约3xl()S个对数生长期的HepG2和R-HepG2细胞分别与clitocine/caspase-8抑制齐!j(Z-正TD-FMK)或clitocine/caspase-9抑制剂(Z-LEHD-FMK)共同孵育48小时，胰酶消化收集细胞，PBS清洗一次，加入500^1的AnnexinV-FITC结合缓冲液，含25^1的AnnexinV-FITC和5^1的PI缓冲液，然后避光孵育15min，用FACSCanto流式细胞仪(BectonDickinson)分析结果。实验结果见附图8-9。在细胞凋亡的信号传导过程中，caspase(半胱氨酸水解酶)起着关键性的调节作用，因此它们的激活是凋亡的重要特征[14]，两个主要的caspase家族成员caspase-8和caspase-9分别代表了两条凋亡信号通路即死亡受体通路和线粒体通的执行者[14]。附图8中，图A、B、C分别代表HepG2细胞的对照、clitocine0.3单独处理和clitocine加caspase-8抑制剂组合，D、E、F则代表R-HepG2细胞同样的三个处理，每张图的右下角百分数都表示该细胞在对应处理下的凋亡百分率，而右上角百分数则代表相同条件下的死亡百分率，可以看出，克力托辛0.3|uM作用于HepG2和R-HepG2分别诱导两株细胞产生凋亡4.45%，11.85%，而添加caspase-8抑制剂，可以逆转这种凋亡的诱导，凋亡细胞百分比相应下调至2.52%,9.55%。同样，附图9中，图A、B、C分别代表HepG2细胞的对照、clitocine0.3pM单独处理和clitocine加caspase-9抑制剂组合，D、E、F则代表R-HepG2细胞同样的三个处理，每张图的右下角百分数都表示该细胞在对应处理下的凋亡百分率，而右上角百分数则代表相同条件下的死亡百分率，可以看出，克力托辛0.3pM作用于HepG2和R-HepG2分别诱导两株细胞产生凋亡3.48%，20.06%,而添加caspase-9抑制剂，也可以逆转这种凋亡的诱导，凋亡细胞百分比相应下调至1.78%,13.14%。实施例六表明，克力托辛诱导HepG2和R-HepG2凋亡是caspase依赖性的，并可能与死亡受体通路和线粒体通路都有关。实施例三至实施例六，从不同的角度说明了克力托辛可以抑制肿瘤细胞药敏株HepG2和耐药株R-HepG2体外增殖，这种抑制作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡而达到的，且对多药耐药性肿瘤细胞R-HepG2的药效更敏感，表明耐药性肿瘤细胞对克力托辛没有抗药性，因此克力托辛可在抗肿瘤多药耐药性药物中应用。实施例七克力托辛对耐药株R-HepG2高表达P-糖蛋白的抑制实验材料和方法实验材料同实施例二方法Westernblot实验，同实施例二实验结果见附图10-11。实施例三至六说明克力托辛可以抑制多药耐药肿瘤细胞R-HepG2增殖，诱导其凋亡，且不受其耐药性影响，进一步，我们要检测克力托辛的这种功能的分子基础,是否与其抑制了P-糖蛋白的功能有关。Westernblot实验结果如附图10所示，图中，从左到右依次为对照、clitocine0.3nM、0.6fiM和0.9|iiM处理，可见，对照P-糖蛋白高表达，而不同浓度的克力托辛处理R-HepG2细胞均可以完全抑制其P-糖蛋白的表达。附图11说明，低浓度的克力托辛(0.06pM)与阿霉素共同作用于R-HepG2，可以减少R-HepG2细胞的存活百分率，即提高了R-HepG2对阿霉素的药敏性，这与克力托辛能够抑制R-HepG2高表达的P-糖蛋白结果一致。实施例七说明，克力托辛可以逆转高表达P-糖蛋白的多药耐药肿瘤株的耐药性。综上实施例所述，本发明提供的克力托辛对多药耐药肿瘤株R-HepG2具有强烈的增殖抑制效果，其半数增殖抑制浓度IC5。为0.35)iM,远小于临床常用抗肿瘤药阿霉素，紫杉醇,顺铂等，克力托辛杀死多药耐药肿瘤细胞的机理是抑制MDR1基因表达产物P-糖蛋白的功能并诱导肿瘤细胞凋亡，与其药敏细胞一致。目前临床上缺乏能逆转肿瘤多药耐药性的药物，因此克力托辛具有很好的制备抗肿瘤多药耐药性药物的应用前景。权利要求1.克力托辛在制备抗肿瘤多药耐药性的药物中的应用，所述克力托辛的分子式为C9H13N5O6，分子量287，所述药物由克力托辛与制剂允许的药物赋形剂或载体组成。2.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述药物的制剂形式是液体制剂或固体制剂。3.根据权利要求2所述的应用，其特征是所述药物的给药形式是口服给药或注射给药。全文摘要本发明提供克力托辛在制备抗肿瘤多药耐药性的药物中的应用，所述克力托辛的分子式为C<sub>9</sub>H<sub>13</sub>N<sub>5</sub>O<sub>6</sub>，分子量287，所述药物由克力托辛与制剂允许的药物赋形剂或载体组成，制剂形式是液体制剂或固体制剂。本发明提供的药物对多药耐药肿瘤细胞的杀伤作用明显优于紫杉醇，阿霉素，顺铂等临床常用药，克力托辛杀死高表达P-糖蛋白肿瘤细胞的机理是抑制P-糖蛋白的功能并诱导细胞凋亡，与其亲本药敏细胞一致，具有很好的制备抗肿瘤多药耐药性药物的应用前景。文档编号A61K31/7064GK101347442SQ20081006343公开日2009年1月21日申请日期2008年8月5日优先权日2008年8月5日发明者冯国培,刘非燕,平吴,吴世华,郭添德申请人:浙江大学