专利名称：一种纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医用材料领域，特别涉及一种纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿 化复合纤维的制备方法。
技术背景硬组织(骨、牙)替代材料是生物医学材料中的一大类，具有量大面广的特点。美国国内每年涉及骨置换的外科治疗已超过100万人次，而对我国这样一个人口众多的发展中国家，潜在的巨大需求是不言而喻的。体内骨组织是受 细胞高度调节控制生长而成的生物矿化组织，由两大部分构成——有机质和无机质。成年人的有机质占30%，主要是骨胶原纤维束，它作为骨的网状支架， 赋予骨的弹性和韧性；无机质，主要是羟基磷灰石结晶，另外还包括硅、镁、 钾、钠、锌等矿质元素)占70%，决定骨骼的硬度及刚性特征，同时，羟基磷 灰石结晶的纯度对其活性起着很大的作用。随着组织工程学的发展，国内外利 用仿生自组装的概念，通过控制生物矿化过程，设计生物材料并将其用于骨组 织的修复取得了较大的进步(S丄Stupp; RV. Braun, Molecular manipulation of microstmctures: Biomaterials, ceramics, and semiconductors. Science, 1997; 277: 1242-1248)。当前，国内外的相关模拟生物矿化及相关骨组织工程材料的研究中， 选用的蛋白质大多为I型胶原蛋白，这是因为天然骨中I型胶原蛋白是含量最多 的有机基质。作为天然骨的成分，胶原蛋白虽然具有一定的优势，但它也有自 身劣势。首先，目前骨材料中选用的胶原蛋白的提纯工艺复杂，低纯度胶原则 容易引起炎症反应等问题；其次，目前临床应用较多的是哺乳动物牛肌腱中提 取的胶原蛋白，存在着疯牛病等牲畜疾病与人交叉感染的潜在威胁。因此，利 用胶原以外的有机基质，如丝蛋白，作为调制生物矿化的模板，从而制备骨组 织修复材料可能是一条理想的途径。我国是蚕丝生产和出口大国，蚕丝纤维产量约占世界产量的80%。家蚕丝 主要是由丝素和丝胶两部分组成，通过对天然蚕丝在低浓度肥皂水中煮沸可以 去除丝胶而得到丝素。丝胶是一种球状蛋白，易溶于水，但它是一种潜在的过 敏源，会引发Typel型过敏反应。而丝素是天然蚕丝的主要组成部分，约占其 总质量的70%，是一种纤维蛋白，具有良好的生物相容性。丝素由18种氨基酸 组成，其中赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸为人体必须从体外摄取的八种氨基酸。因此，丝蛋白除了应用于纺织 面料外，还广泛应用于生物医学领域，如手术缝合线，控制缓释给药，人工皮 肤等。 发明内容本发明的目的在于提供一种纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的制备 方法。本发明的一种纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的制备方法，该方法 依次包括下列步骤(1) 天然蚕丝在含质量百分比浓度为0.5% Na2C03溶液中煮沸30 60分 钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2) 将所得丝蛋白在40 45 。C条件下，溶解于饱和溴化锂水溶液，在蒸 馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3) 将装有纯丝蛋白溶液的透析袋浸没于含有碱金属离子的水溶液中12 36小时；碱金属离子的浓度为0.5 2 mol/L;(4) 在步骤(3)的溶液中滴加含有钙离子的水溶液，并且不断搅拌；(5) 在歩骤(4)的溶液中滴加含有磷酸根离子的水溶液，并且不断搅拌。 最终钙离子与磷酸根离子的终浓度分别为0.02 0.1 mol/L和0.01 0.05 mol/L; 最终丝蛋白的质量百分比浓度为0.1% 1%， pH为6 8;(6) 将步骤(5)的溶液搅拌5 15分钟，然后离心分离出沉淀，用去离 子水洗涤去掉多余的盐分；(7) 将步骤(6)洗涤后的沉淀物放入真空干燥箱在40 45i:下干燥，即 得纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维。步骤(2)中饱和溴化锂水溶液的浓度为9mol/L。步骤(3)中，所述含有碱金属离子的水溶液为氯化钾溶液、氯化钠溶液或 氯化钾和氯化钠的混合溶液。步骤(4)中，所述含有钙离子的水溶液为氯化钙溶液或硝酸钙溶液。步骤(5)中，所述含有磷酸根离子的水溶液为磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二 钠溶液、磷酸氢二钾溶液或磷酸二氢钾溶液。所述的天然蚕丝为家蚕丝、天蚕丝、蓖麻蚕丝或柞蚕丝。本发明的有益效果是通过运用碱金属离子对丝蛋白结构的影响，制备纳米级的丝蛋白-羟基磷灰 石矿化复合纤维，纤维直径为20 30nm，并且相互结合成三维多孔结构，分布比较均匀。这种微观结构在组织生长过程中，有利于氧气和营养物质的传输、代谢产物的排出，以保持载体内部细胞旺盛的代谢活性。
图1为本发明实施例中0.5 mol/L氯化钾溶液处理后得到的纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的SEM图。图2为本发明实施例中2 mol/L氯化钠溶液处理后得到的纳米级丝蛋白-羟 基磷灰石矿化复合纤维的SEM图。图3为本发明实施例中1 mol/L氯化钾和1 mol/L氯化钠混合溶液处理后得 到的纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的SEM图。图4为本发明对照例中无碱金属离子溶液处理得到的丝蛋白-羟基磷灰石矿 化复合物的SEM图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。本发明中所用的含碱金属离子溶液为碱金属盐溶液，为氯化钾溶液、氯化 钠溶液、氯化钾和氯化钠的混合溶液；所用的含磷酸根离子的溶液为磷酸盐 溶液，为磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、磷酸氢二钾溶液、磷酸二氢钾 溶液；所用的含钙离子的溶液为钙盐溶液，为氯化钙溶液、硝酸钙溶液。所 用试剂均为分析纯。实施例1:(1) 将天然蓖麻蚕丝放于含质量百分比浓度为0.5% Na2C03溶液中煮沸60 分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2) 将所得丝蛋白在40 45 。C条件下，溶解于9 mol/L的饱和溴化锂溶液， 在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3) 将10 mL质量百分比浓度为0.4X的纯丝蛋白溶液装入透析袋浸没于 100 mL浓度为0.5 mol/L的KC1溶液中36小时；(4) 取出上述溶液并盛放于烧杯中，依次缓慢滴加20 mL浓度为0.04 mol/L 的CaCl2溶液和10 mL浓度为0.04 mol/L的NaH2P04溶液，并用磁力搅拌器不 断搅拌，使Ca^和PO^的终浓度达到0.02 mol/L和0.01 mol/L，丝蛋白的质量 百分比浓度为0.1%;(5) 在上述溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值达到8.0后， 继续搅拌5分钟，然后离心分离出沉淀，用去离子水洗涤去掉多余的盐分；(6) 将上述洗涤后的沉淀物放入真空干燥箱，在40 45i:下干燥，得粉末状固体。实施例2:(1) 将天然柞蚕丝放于含质量百分比浓度为0.5% Na2C03溶液中煮沸30 分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2) 将所得丝蛋白在40 45 。C条件下，溶解于9 mol/L的饱和溴化锂溶液， 在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3) 将10 mL质量百分比浓度为4.0X的纯丝蛋白溶液装入透析袋浸没于 100 mL浓度为2 mol/L的NaCl溶液中12小时；(4) 取出上述溶液并盛放于烧杯中，依次缓慢滴加浓度为20 mL浓度为 0.2 mol/L的Ca(N03)2溶液和10 mL浓度为0.2 mol/L的&10>04溶液，并用磁 力搅拌器不断搅拌，使Ca^和P(V-的终浓度达到0.1 mol/L和0.05 mol/L，丝蛋 白的质量百分比浓度为1.0。％;(5) 在上述溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值达到8.0后， 继续搅拌15分钟，然后离心分离出沉淀，用去离子水洗涤去掉多余的盐分；(6) 将上述洗涤后的沉淀物放入真空干燥箱，在40 45。C下干燥，得粉末 状固体。实施例3:(1) 将天然家蚕丝放于含质量百分比浓度为0.5% Na2C03溶液中煮沸45 分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2) 将所得丝蛋白在40 45 。C条件下，溶解于9 mol/L的饱和溴化锂溶液， 在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3) 将10 mL质量百分比浓度为1.75%的纯丝蛋白溶液装入透析袋浸没 于100 mL浓度均为1 mol/L的KC1和NaCl的混合溶液中24小时；(4) 取出上述溶液并盛放于烧杯中，依次缓慢滴加浓度为20 mL浓度为 0.1 mol/L的Ca(N03)2溶液和10 mL浓度为0.1 mol/L的KH2P04溶液，并用磁 力搅拌器不断搅拌，使Ca"和PO '的终浓度达到0.05 mol/L和0.025 mol/L，丝 蛋白的质量百分比浓度为0.44%;(5) 在上述溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值达到7.4后， 继续搅拌10分钟，然后离心分离出沉淀，用去离子水洗涤去掉多余的盐分；(6) 将上述洗涤后的沉淀物放入真空干燥箱，在40 45。C下干燥，得粉末 状固体。实施例4:(1) 将天然天蚕丝放于含质量百分比浓度为0.5% Na2C03溶液中煮沸45 分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2) 将所得丝蛋白在40~45 。C条件下，溶解于9 mol/L的饱和溴化锂溶液， 在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3) 将10 mL质量百分比浓度为2%的纯丝蛋白溶液装入透析袋浸没于 100 mL浓度均为2 mol/L的NaCl的混合溶液中24小时；(4) 取出上述溶液并盛放于烧杯中，依次缓慢滴加浓度为20 mL浓度为 0.1 mol/L的Ca(N03)2溶液和10 mL浓度为0.1 mol/L的認^04溶液，并用磁 力搅拌器不断搅拌，使Ca^和PO^的终浓度达到0.05 mol/L和0.025 mol/L，丝 蛋白的质量百分比浓度为0.5%;(5) 在上述溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值达到7.4后， 继续搅拌10分钟，然后离心分离出沉淀，用去离子水洗涤去掉多余的盐分；(6) 将上述洗涤后的沉淀物放入真空干燥箱，在40 45"C下干燥，得粉末 状固体。对照例(1) 将天然家蚕丝放于含质量百分比浓度为0.5% Na2C03溶液中煮沸45 分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2) 将所得丝蛋白在45 。C条件下，溶解于9 mol/L的饱和溴化锂溶液， 在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3) 取10mL质量百分比浓度为1.75%的纯丝蛋白溶液并盛放于烧杯中， 依次缓慢滴加浓度为20 mL浓度为0.1 mol/L的CaCV溶液和10mL浓度为0.1 mol/L的Na2HP04溶液，并用磁力搅拌器不断搅拌，使Ca^和PO,的终浓度达 到0.05 mol/L和0.025 mol/L，丝蛋白的质量百分比浓度为0.44%;(4) 在上述溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值达到7.4后， 继续搅拌10分钟，然后离心分离出沉淀，用去离子水洗涤去掉多余的盐分；(5) 将上述洗涤后的沉淀物放入真空干燥箱，在40 45"C下干燥，得粉末 状固体。实施例结合图1:图1为本发明实施例中0.5 mol/L氯化钾溶液处理后得到的 纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的SEM图。形成具有纤维形貌的复合材 料，纤维直径为20 30 nm，并且相互结合成三维多孔结构，分布比较均匀。实施例结合图2:图2为本发明实施例中2 mol/L氯化钠溶液处理后得到的纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的SEM图。形成具有纤维形貌的复合材 料，纤维直径为20 30 nm，并且相互结合成三维多孔结构，分布比较均匀。实施例结合图3:图3为本发明实施例中1 mol/L氯化钾和1 mol/L氯化钠混 合溶液处理后得到的纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的SEM图。形成具 有纤维形貌的复合材料，纤维直径为20 30nm，并且相互结合成三维多孔结构， 分布比较均匀。对照例结合图4:图4为本发明对照例中无碱金属离子溶液处理得到的丝蛋 白-羟基磷灰石矿化复合物的SEM图。形成片状丝蛋白-羟基磷灰石复合物，并 且相互堆积。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然， 本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从 本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1、一种纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的制备方法，其特征在于该方法依次包括下列步骤(1)天然蚕丝在含质量百分比浓度为0.5％Na2CO3溶液中煮沸30～60分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2)将所得丝蛋白在40～45℃条件下，溶解于饱和溴化锂水溶液，在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3)将装有纯丝蛋白溶液的透析袋浸没于含有碱金属离子的水溶液中12～36小时；碱金属离子的浓度为0.5～2mol/L；(4)在步骤(3)的溶液中滴加含有钙离子的水溶液，并且不断搅拌；(5)在步骤(4)的溶液中滴加含有磷酸根离子的水溶液，并且不断搅拌。最终钙离子与磷酸根离子的终浓度分别为0.02～0.1mol/L和0.01～0.05mol/L；最终丝蛋白的质量百分比浓度为0.1％～1％，pH为6～8；(6)将步骤(5)的溶液搅拌5～15分钟，然后离心分离出沉淀，用去离子水洗涤去掉多余的盐分；(7)将步骤(6)洗涤后的沉淀物放入真空干燥箱在40～45℃下干燥，即得纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维。
2、 根据权利要求1所述的一种纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的制 备方法，其特征在于步骤(2)中饱和溴化锂水溶液的浓度为9mol/L。
3、 根据权利要求1所述的一种纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的制 备方法，其特征在于步骤(3)中，所述含有碱金属离子的水溶液为氯化钾溶 液、氯化钠溶液或氯化钾和氯化钠的混合溶液。
4、 根据权利要求1所述的一种纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的制 备方法，其特征在于步骤(4)中，所述含有钙离子的水溶液为氯化钙溶液或 硝酸钙溶液。
5、 根据权利要求1所述的一种纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的制 备方法，其特征在于步骤(5)中，所述含有磷酸根离子的水溶液为磷酸二氢 钠溶液、磷酸氢二钠溶液、磷酸氢二钾溶液或磷酸二氢钾溶液。
6、 根据权利要求1所述的一种纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的制备方法，其特征在于所述的天然蚕丝为家蚕丝、天蚕丝、蓖麻蚕丝或柞蚕丝。
全文摘要
本发明公开了一种纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维的制备方法。先将天然蚕丝制成丝蛋白溶液，并装入透析袋后浸没于含有碱金属离子的溶液中处理，再在处理后的丝蛋白溶液中依此滴加含有钙离子和磷酸根离子的溶液，并且不断搅拌，然后离心分离沉淀，用去离子水洗涤后，将沉淀物放入真空干燥箱干燥，即得纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维。本发明制备的纳米级丝蛋白-羟基磷灰石矿化复合纤维直径为20～30nm，并且相互结合成三维多孔结构，分布比较均匀。这种微观结构在组织生长过程中，有利于氧气和营养物质的传输、代谢产物的排出，以保持载体内部细胞旺盛的代谢活性。
文档编号A61L27/46GK101327341SQ20081006341
公开日2008年12月24日 申请日期2008年8月1日 优先权日2008年8月1日
发明者姚菊明, 孔祥东, 蔡玉荣 申请人:浙江理工大学