专利名称：BM－Cyclin1在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及BM-Cyclin1，具体的说，涉及BM-Cyclin1在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一。目前治疗肿瘤的方法主要有手术、放射、药物和免疫疗法。化学治疗是肿瘤治疗中发展最快的一个领域，在肿瘤治疗中发挥的作用越来越大。然而，肿瘤的多药耐药性严重地影响了化学治疗的效果，是肿瘤治疗中急需解决的问题。肿瘤的多药耐药产生的机制有多种，现有的多药耐药逆转剂往往是针对多药耐药产生过程中的某一环节，只能对某种肿瘤细胞有效，且活性较低，不良反应较大，很难在临床上广泛使用。寻找高效低毒的多药耐药逆转剂是当务之急。
BM-Cyclin1，大环内酯硫姆林(macrolide tiamulin)，它是短截北风菌素中的一种半合成衍生物，广泛应用于畜牧业、医学、基础实验研究。它在基础实验研究中的作用主要集中在克服细胞培养过程的支原体污染。它可以通过细菌核糖体大亚基为特异靶点而抑制细菌蛋白的合成。
发明内容
本发明的目的在于提供BM-Cyclin1在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用。
本发明经过长期的研究，发现BM-cyclin1能够明显逆转肿瘤细胞的多药耐药性，可与合适的辅料混合，从而制备肿瘤细胞的多药耐药逆转剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明发现BM-cyclin1能够明显逆转肿瘤细胞的多药耐药性，可与合适的辅料混合，从而制备肿瘤细胞的多药耐药逆转剂，应用于肿瘤的治疗。同时，BM-cyclin1是一种低毒物质，副作用小。
图1为BM-cyclin1对C-A120细胞裸鼠移植瘤多药耐药的逆转作用；图2为BM-cyclin1对C-A120细胞Topo IIα和MRP2蛋白的影响。
其中，图2A中，1为KB细胞，2为未处理C-A120细胞，3为BM-cyclin1(10μg/ml)处理C-A120细胞96小时，GAPDH为内参。图2B中，黑色条柱为KB细胞；灰色条柱为C-A120细胞；白色条柱为BM-cyclin1处理的C-A120细胞。
具体实施例方式
实施例1BM-cyclin1对C-A120细胞多药耐药性逆转作用所选的细胞株包括人口腔上皮癌细胞株KB-3-1(敏感株)及使用阿霉素诱导的多药耐药的人口腔上皮癌细胞株C-A120(耐药株)。取对数生长期肿瘤细胞制成一定浓度的细胞悬液接种于96孔板中，BM-cyclin1设1、5和10μg/ml的浓度组、不同浓度的AMD、VP-16和cisplatin以及相应的溶剂对照组。对照孔不加药物，每个浓度设4个平行孔。培养92小时加入MTT100ug/孔，继续培养4小时，弃去培养液，加入200ul二甲基亚砜，震荡15分钟完全溶解后，用酶标仪测定570/630nm双波长吸光光度值，用Logit法计算抑制50％细胞生长时的药物浓度(IC50)。
抑制率(％)＝(对照组平均OD值-用药组平均OD值)/对照组平均OD值×100％。
逆转倍数(reversal folds)＝未处理C-A120细胞组IC50值/BM-cyclin1处理C-A120细胞组的平均IC50值实验重复3次，C-A120细胞对AMD、VP-16和cisplatin三种化疗药物的耐药，呈剂量依赖性。并且显示了良好的低毒性，结果见表1，表2。
实施例2BM-cyclin1体内逆转C-A120细胞多药耐药性实验取对数生长期C-A120细胞，生理盐水稀释成1×106细胞悬液，作腋下注射，成瘤保种。选择肿瘤生长旺盛且无溃破、健康情况良好的荷瘤小鼠，经椎处死，剥离肿瘤组织，再将其剪成直径为0.2cm左右的小块，接种至裸鼠腋下皮下。一周后根据肿瘤大小将其分组，设阴性对照组(蒸馏水)、BM-cyclin1(0.5mg/ml)组、ADM(0.1mg/ml)组、BM-cyclin1与ADM联合用药组。每天腹腔注射一次，连续10天。每2天用游标卡尺测量肿瘤大小及体重。按公式(I)计算肿瘤体积，绘制生长曲线。处死小鼠，取其肿瘤组织，按公式计算(II)肿瘤体积抑制率。按照金正均法，即公式(III)计算药物间相互作用。
公式I肿瘤体积(V)＝(π/6)(a+b)3/8式中a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。
公式II肿瘤抑制率(IR)＝(C-T)/C×100％式中C为对照组肿瘤平均瘤重，T为各给药组肿瘤平均瘤重。
公式IIIq＝Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)式中Ea+b为合用药物抑制率；Ea，Eb分别为单用药物抑制率q值在0.85-1.15两药作用单纯相加q值＞1.15两药作用为协同q值＜0.85两药作用为拮抗结果单用BM-cyclin1组的肿瘤抑制率为5％，与对照组相比无明显差异(P＞0.05)；单用ADM组的肿瘤抑制率为28％，与对照组相比明显差异(P＜0.01)；BM-cyclin1与ADM联合用药组的肿瘤抑制率为52％，与对照组相比显著性差异(P＜0.01)，而与ADM组相比也显示明显差异(P＜0.05)。根据公式III计算q值为1.65，即q值＞1.15，说明两药作用为协同作用。各用药组裸小鼠和对照组小鼠体重没有明显差异，未见小鼠外观、活动状态等方面的差异。见表3，图1。
实施例3BM-cyclin1逆转肿瘤多药耐药性机制。
BM-cyclin1(10μg/ml)处理C-A120细胞96小时后制备蛋白样品，定量。每泳道加等量的样品后开始聚丙烯酰胺凝胶电泳，按常规转印及封闭，分别标记一抗、二抗，暗室中曝光、冲片。
结果C-A120细胞组Topo IIα蛋白比KB-3-1细胞组低了近4倍。而经BM-cyclin1(10μg/ml)处理C-A120细胞96小时后，处理组TopoIIα蛋白明显上调，结果显示BM-cyclin1处理组的Topo IIα蛋白水平是未处理的C-A120细胞组的2.2倍。C-A120细胞组MRP2蛋白比KB-3-1细胞组高出2.6倍。而经相同处理条件下，MRP2蛋白在处理组中明显下调，结果显示BM-cyclin1处理组的MRP2蛋白较未处理C-A120细胞下降了近80％。
实验证实C-A120细胞对ADM、VP-16、cisplatin、VCR等药物均有交叉耐药，对ADM、VP-16、cisplatin的耐药倍数分别为14、130、3倍。显示其具有广泛与较强的多药耐药特性。
体外药理实验表明，BM-cyclin1在10μg/ml浓度下，对ADM、VP-16和cisplatin的耐药逆转倍数分别为6.0、8.2、1.7。毒性实验显示BM-cyclin1在10μg/ml的浓度以下，对C-A120细胞毒性均无明显毒性。
同时，BM-cyclin1对C-A120细胞裸鼠移植瘤多药耐药的逆转作用实验结果表明，BM-cyclin1对肿瘤多药耐药性有明显逆转作用(结果见表3，图1)。因此，BM-cyclin1具有发展成为逆转肿瘤多药耐药药物的前景。
且研究证实这种逆转作用于其可以上调Topo IIα蛋白和下调MRP2蛋白有关(结果见图2)。
表1 体外逆转肿瘤细胞多药耐药性实验(IC50，μg)
表2 BM-cyclin1对C-A120细胞的细胞毒性作用
表3 BM-cyclin1对C-A120细胞裸鼠移植瘤多药耐药的逆转作用。
※腹腔注射给药，1次/1天×10天
权利要求
1.BM-Cyclin1在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了BM－Cyclin1在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用。本发明发现BM－cyclin1能够明显逆转肿瘤细胞的多药耐药性，可与合适的辅料混合，从而制备肿瘤细胞的多药耐药逆转剂，应用于肿瘤的治疗。同时，BM－cyclin1是一种低毒物质，副作用小。
文档编号A61P35/00GK101066265SQ20071002840
公开日2007年11月7日 申请日期2007年6月4日 优先权日2007年6月4日
发明者冼励坚, 王林, 李永强 申请人:中山大学