一种提高ε-聚-L-赖氨酸产量的新方法

专利名称：一种提高ε-聚-L-赖氨酸产量的新方法
技术领域：
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种提高一株淀粉酶产色链霉菌(5^卬to附少c^s fZ/aWatoc/jramogew^)或白色链霉菌(5^e/ toOT少c^ a/6w/船)生产s-聚-L-赖氨酸产量的新方法， 该新方法涉及到在发酵过程中流加L-赖氨酸。
背景技术：
s-聚-L-赖氨酸是一种含有25 30个残基的赖氨酸同聚物，它易溶于水，但不溶于乙酸乙 酯、乙醇、乙醚等有机溶剂；其热稳定性高，12(TC加热10min仍具有抑菌活性。s-聚-L-赖 氨酸是一种具有抑菌功效的多肽，其抑菌谱广，在中性和微酸性条件下，对革兰氏阳性菌、 革兰氏阴性菌、霉菌和酵母菌都有抑制作用，其对耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用。 在一定条件下，也可使某些噬菌体明显失活。s-聚-L-赖氨酸安全性高，在人体内分解为赖氨 酸，而赖氨酸是人体必需的八种氨基酸之一，也是世界各国允许在食品中强化的氨基酸。FDA 于2004年1月批准日本Chisso公司的e-聚-L-赖氨酸为GRAS产品。因此，s-聚-L-赖氨酸是 一种理想的生物防腐剂。
到目前为止，已知岩田敏治等人在中国申请的专利(专利名称为大量生产S-聚-L-赖氨 酸的菌株和生产方法，专利号97182253.0)是在培养基中培养菌株B21021 (FERM BP-5926)， 然后从培养基中分离和纯化s-聚-L-赖氨酸。该菌株是通过对小白链霉菌lysinopolymerus亚种 U011A-1菌株(FERMBP-U09)进行诱变处理而获得的，其对浓度为10mg/mL或更高的 AEC具有抗性。
徐虹等人申请的专利(专利名称为利用北里孢菌PL6-3制备的方法，专利号为 200510037774.2)是以北里孢菌(iOto^tospora sp.)即CCTCC No.M205012培养在含有碳源、 氮源等的培养基上，然后通过离子交换树脂法从发酵液中分离得到s-聚赖氨酸及其盐。
贾士儒等申请的专利(专利名称为回流工艺生产S-聚-L-赖氨酸的方法，专利号为 200610013800.2)是以从土壤中筛选所获得的白色链霉菌(S/re/ /ow;^esflf/Zw/w5) [AEC、甘氨 酸和磺胺胍都具有抗性]为生产菌种，在发酵过程中流加提取过程的后期穿透液，然后通过离
子交换树脂法提取得到S-聚-L-赖氨酸。
贾士儒等申请的专利(专利名称为 一种诱变菌株白色链霉菌TUST2及利用该诱变菌株 生产s-聚赖氨酸及其盐的方法，专利号为200710057098.4)是以在中国海南省土壤中分离 得到的TUST1为基础上利用紫外诱变、紫外和化学诱变相结合，以及N离子注入等诱变方 法选育出的s-聚赖氨酸的高产菌株，该菌株对10mg/mL或更高浓度AEC有抗性，优化后产 酸达10 30g/L。发酵液经离心、过滤和离子交换树脂等处理后得到分子量分布为4000 6500Da 的s-聚赖氨酸。
吴光耀申请的专利(专利名称为 一种天然抗菌防腐剂聚赖氨酸及其制备方法，专利号为200710067250.7)是以白色链霉菌经过2~4次扩大培养，接种于麦芽汁发酵培养液中， 然后从发酵混合物中分离得到聚赖氨酸。
L-赖氨酸是S-聚-L-赖氨酸的直接前体，但是现有的s-聚-L-赖氨酸的发酵工艺中，没有关于 流加L-赖氨酸的报道。

发明内容
本发明的主要目的是提供一种与常规S-聚-L-赖氨酸生产方法相比，目的产物获得量更高 的发酵生产方法。本发明所述的新方法是在发酵过程中流加L-赖氨酸，该方法较原有工艺显 著提高了 S-聚-L-赖氨酸的生成量，降低了成本。

发明内容
本发明的目的是提供一种釆用流加工艺生产S-聚-L-赖氨酸的新方法，该方法是在发酵过 程中间歇流加L-赖氨酸，然后从发酵液中分离得到S-聚-L-赖氨酸。 实现本发明的技术方案是
利用经活化的淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌菌株进行发酵培养，获得本发明的S-聚-L-赖氨酸。在发酵培养过程中，可将斜面菌种首先进行液体种子培养，再以10%接种于发酵培 养基中进行发酵培养。
本发明所指出的s-聚-L-赖氨酸可在以下条件下进行培养。初始pH6.8 7.0、温度25~35 °C、 好气条件下振荡培养或搅拌培养，种子培养15 30h;发酵时间在40 120h之间时，每2h测
定一次残糖含量，当残糖含量小于10g/L时，流加葡萄糖和(NH4)2S04，同时流加L-赖氨酸，
使发酵培养基中葡萄糖含量维持在13 g/L左右。培养时间约为120 h，只要在本发明的s-聚-L-赖氨酸产量达到最高时结束即可。经如上所述的培养，主要在培养液中产生本发明的s-聚-L-赖氨酸。
如上所得的培养液中收集S-聚-L-赖氨酸，可按照常规方法进行。本发明获得所述S-聚-L-
赖氨酸是将发酵液离心以除去菌体及部分固形物，具体操作是利用D152大孔弱酸性阳离子 交换树脂对上清液进行交换吸附后洗脱，洗脱液经D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后， 再经过滤、真空浓縮、干燥，得到S-聚-L-赖氨酸盐酸盐。
通过本发明如上的阐述，得到后面实施例的进一步验证，得知本发明所改进的流加方案 的有效性。
通过实施本发明具体的技术指标，可以实现本发明内容。
具体实施例方式
首先需要说明的是
1. 所用白色链霉菌(5^e;7to附少CM"/to/M)已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏编号为CGMCCNo.1986，保藏日期分别为2007年3月23日。
2. 所用淀粉酶产色链霉菌(5W/^函yc^ ^wtotoc/rowogeM^)已由中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.3145，保藏日期为2009年6月29日。
4以下是实施例，将对本发明作进一步说明，但是本发明并不仅限于以下实施例。 实施例1叙述的是现有的生产工艺；
实施例2，实施例3及实施例4为与实施例1相对比的创新工艺。 实施例1:
在装有2.7 L培养基的5 L发酵罐中，接种300 mL淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的种 子培养液，30 T:培养，待DO降至30 %时自动控制为30 %，好气培养120 h，空气流速为4.0~6.0 L/min。当pH降至6.0左右时，流加氨水(25~30%)维持pH为6.0，当发酵液中的残糖浓度 降至10g/L时，通过流加葡萄糖(400g/L)和(NH4)2S04 (80g/L)使残糖浓度达到13 g/L。 同时，不再控制pH，让其自然降至4.0并维持在4.0左右。
培养120h，结束发酵，发酵液中最高积累s-聚-L-赖氨酸为10.7g/L。离心去除菌体及部 分固形物，利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附后洗脱，洗脱液经 D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤，真空浓縮，旋风干燥器干燥，得到s-
聚-L-赖氨酸盐酸盐。
实施例2:
在装有2.7 L培养基的5 L发酵罐中，接种300 mL淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的种 子培养液，30 'C培养，待DO降至30 %时自动控制为30 %，好氧培养120 h，空气流速为4.0~6.0 L/min。当pH降至6.0左右时，流加氨水(25-30 %)维持pH为6.0，当发酵液中的残糖浓 度降至10g/L时，通过流加葡萄糖(400g/L)和(NH4)2S04 (80g/L)使残糖浓度达到13 g/L， 并向发酵液中流加L-赖氨酸(10g/L)。同时，不再控制pH，让其自然降至4.0并维持在4.0 左右。
培养120h，结束发酵，发酵液中最高积累s-聚-L-赖氨酸19.0g/L。离心去除菌体及部分 固形物，利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附后洗脱，洗脱液经D392 大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤，真空浓縮，旋风干燥器干燥，得到e-聚-L-赖 氨酸盐酸盐。
实施例3:
在装有16.2L培养基的30L发酵罐中，接种1.8L淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的二级 摇瓶种子培养液，30'C培养，待00降至30%时自动控制为30%，好气培养120h，空气流 速为4.0~6.0 L/min。当pH降至6.0左右时，流加氨水(25~30%)维持pH为6.0，当发酵液 中的残糖浓度降至10g/L时，通过流加葡萄糖(400g/L)和(NH4)2S04 (80g/L)使残糖浓度 达到13g/L，并向发酵液中流加L-赖氨酸(10g/L)。同时，不再控制pH，让其自然降至4.0 并维持在4.0左右。
培养120h，结束发酵，发酵液中最高积累s-聚-L-赖氨酸为14.6 g/L。离心去除菌体及部 分固形物，利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附后洗脱，洗脱液经 D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤，真空浓縮，旋风干燥器干燥，得到e-聚-L-赖氨酸盐酸盐。 实施例4:
在装有16.2L培养基的30L发酵罐中，接种1.8L淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的二级 摇瓶种子培养液，30'C培养，待DO降至30。/。时自动控制为30。/。，好气培养120h，空气流 速为4.0~6.0 L/min。当pH降至6.0左右时，流加氨水(25~30%)维持pH为6.0，当发酵液 中的残糖浓度降至10g/L时，通过流加葡萄糖(400g/L)和(NH4)2S04 (80g/L)使残糖浓度 达到13g/L，并向发酵液中流加L-赖氨酸(15g/L)。同时，不再控制pH，让其自然降至4.0 并维持在4.0左右。
培养120h，结束发酵，发酵液中最高积累s-聚-L-赖氨酸为17.6g/L。离心去除菌体及部 分固形物，利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附后洗脱，洗脱液经 D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤，真空浓缩，旋风干燥器干燥，得到s-聚-L-赖氨酸盐酸盐。
权利要求
1.一种提高ε-聚-L-赖氨酸产量的新方法，其特征在于以淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)或白色链霉菌(Streptomyces albulus)为生产菌株，在发酵生产ε-聚-L-赖氨酸的过程中，产物开始积累以后，向培养基中流加L-赖氨酸，达到提高产量的目的。这种生产ε-聚-L-赖氨酸的具体方法是步骤1采用从土壤中筛选所获得的淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)或白色链霉菌(Streptomyces albulus)进行ε-聚-L-赖氨酸发酵生产，培养条件为初始pH 6.8～7.0、温度25～35℃、有氧条件下振荡培养或搅拌培养，种子培养15～30h，发酵时间为96～120h；培养过程中，流加碳源和氮源的同时流加L-赖氨酸。步骤2发酵结束后，将发酵液离心以除去菌体及部分固形物，利用阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附后洗脱，洗脱液经阴离子交换树脂脱色后，再经过滤、真空浓缩、干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐。
2. 如权利要求1所述的生产菌株，其特征在于白色链霉菌(5V^ptow;;cesa/^/iw)和淀粉酶产色链霉菌(S&eptomycMWa^加od2ramogewM)已由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号分别为CGMCCNo.l986和CGMCCNo.3145，保藏日期分别为2007年3月23日和2009年6月29日。
3. 如权利要求1所述的工艺生产s-聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于当发酵时间在40~120h之间时，每2h测定一次残糖含量，当残糖含量小于10g/L时，流加葡萄糖和(NH4hS04，同时流加L-赖氨酸，直至葡萄糖含量达到13 g/L左右。
4. 如权利要求l所述的工艺生产s-聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于分离提取所用的阳离子交换树脂为D152大孔弱酸性阳离子交换树脂；所述的阴离子交换树脂为D392大孔弱碱性阴离子交换树脂。
5. 如权利要求1所述的工艺生产s-聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于流加L-赖氨酸较不流加时，s-聚-L-赖氨酸的产率较原有工艺提高了25 50e/。，显著降低了成本。
全文摘要
本发明涉及一种提高ε-聚-L-赖氨酸产量的新方法，是采用从土壤中筛选所获得的淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)或白色链霉菌(Streptomyces albulus)[对S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(以下简称AEC)、甘氨酸和磺胺胍都具有抗性]，在原生产工艺基础上，通过流加L-赖氨酸、葡萄糖和(NH₄)₂SO₄的混合液进行ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产，产物量比不流加L-赖氨酸的过程提高25～50％。本发明改变了原有生产工艺方法，显著提高了ε-聚-L-赖氨酸的产率，降低了成本，可用于工业规模的发酵。
文档编号C12P13/02GK101671703SQ20091006951
公开日2010年3月17日 申请日期2009年7月1日 优先权日2009年7月1日
发明者斌 周, 琳 李, 甜 王, 王国良, 范宝庆, 莫治文, 谭之磊, 贾士儒 申请人:天津科技大学