专利名称：纤维素酶组合物以及单一成分的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是纤维素酶组合物以及其中单一成分的制备方法。
背景技术：
纤维素酶为复合酶，广泛应用于酿酒、食品、词料、纺织、造纸、制药、环保、石油开 采等工业。纤维素酶来源非常广泛，昆虫、微生物(细菌、放线菌和真菌等)和一些动物都 能产生纤维素酶。真菌和细菌产生的纤维素酶是人们研究的主要对象。在纤维素酶研究领域， 其中几个著名的菌禾中是7Wc/wJewz" we^z'禾卩CW/w/o/wowas浙77zermo6诉cfo/twc"，其中前 者为真菌，后两个为放线菌。早期的纤维素酶研究以真菌为主，直到20世纪80年代，放线 菌产生的纤维素酶才开始进入人们的视线。纤维素酶在工业领域中的主要应用方面主要包括: 将纤维素降解成糖类生产生物乙醇，织物处理如"石洗(stone washing)"和"生物抛光 (biopolishing)"，以及用于洗涤剂组合物中。本领域中虽然己经有一些纤维素酶组合物应 用与实际生产中，但目前仍需要具有各种特性范围的新纤维素酶，它们或者用于洗涤剂组合 物的成分，或者处理纸浆和纤维素乙醇等方面。申请人从盐环境中分离到的一株耐盐放线菌， 从其发酵液中已发现的纤维素酶具耐热和耐碱性，在以上提到的领域有很大的应用前景。
中国专利申请号200610002014. 2公开了一种"微生物发酵生产低温纤维素酶的方法"， 是将产生纤维素酶的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的纤 维素酶产生菌在10 16'C逐级扩大培养，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基 中，在10 16。C培养72 144h时，即微生物发酵生产低温纤维素酶结束；发酵液在4，000 8，000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗 酶液进一步浓縮、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。中国专利申请 号200510070368.6公开了一种"利用酵母菌生产纤维素酶的方法"，是在培养基中加入酵 母菌种进行培养，然后经离心分离得到的上清液即为酶液，将酶液经沉淀分离可得粗酶，粗 酶分离纯化，即得产品纤维素酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种由微生物菌种发酵液产生、分离、纯化制备纤维素酶组合物 的方法。
本发明的另一目的在于提供上述纤维素酶组合物中一种单一成分的制备方法。本发明所述的纤维素酶组合物的制备方法由以下步骤组成-
一、 粗酶液的制备将7T mw^诉cfo /w/oto/erara YIM 90462T以体积百分比为5 — 10%的 接种量接入液体种子培养基中，在37 45'C的条件下振荡培养至指数生长期，将处于指数生 长期的菌液以体积百分比5_10%的接种量转接于液体发酵培养基中，在37 45'C培养至稳 定期初期，将发酵液离心，取上清液，滤纸过滤，得粗酶液；
二、 用截留分子量为10KDa的超滤膜包将粗酶液的体积浓縮至原来的1/6;
三、 浓縮后的酶液加硫酸铵至30%饱和度，离心取上清液，继续加硫酸铵至50°/。饱和度， 离心取沉淀，溶解在pH8.0、 0.3M硫酸铵的Tris-HCI缓冲液中，得到的酶液即纤维素酶组合 物。其酶活可达165.25U/ml.
本发明步骤一所述的T7 enwo6(/^a /^/o,o/erara YIM 90462T是耐盐高温双歧菌(刊登于 rAer附o6诉cfar / fl/Wo/erara sp. nov.， isolated from a salt mine sample, and emended description of the genus ter附o6zy c/a Yang etal./"/J5^/5w/MZcraZ7/o/.2008; 58: 1821-1825)。所述的液体种 子培养基和发酵培养基均可以采用现有培养基，但在液体发酵培养基中应含有质量体积百分 比为0.1—2% (w/v)的AVICEL、质量体积百分比为1一5% (w/v)的NaCl，这样既可以保 证酶的产生，又能有效地减少发酵过程中的杂菌污染。
所述的指数生长期为2-3天，所述的稳定期初期为5-7天，当培养至稳定期初期时即为 产酶高峰期。该时期的酶活性为15.1U/ml。
上述步骤一至三所制得的是纤维素酶组合物，其中主要为纤维素酶组分，其中也含有纤 维素酶以外的组分，但并不影响本组分作为纤维素酶组合物的应用。
对本纤维素酶组合物再进行进一步的分离、提纯，可以制得其中的一种单一成分—— S'DS-PAGE电泳纯中温纤维素酶。具体步骤为上述步骤一至三，再加入以下步骤
四、 将步骤三得到的酶液离心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平 衡好的Butyl-Sepharose预装柱，将透过峰按保留时间的先后分别收集，直至缓冲液流过8-10 个层析柱体积，保留有羧甲基纤维素酶活性的透过峰酶液部分 '
五、 将步骤四得到的酶液离心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平 衡好的pentyl-Sepharose预装柱，用无硫酸铵pH8.0的Tris-HCl缓沖液洗脱，收集所有洗脱峰 组分；
六、 将步骤五得到的酶液离心，取上清液加到pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡好的 Q-Sepharose预装柱，用含NaCl pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，首先使洗脱液电导达封 30mS/cm，将洗脱峰按保留时直至缓冲液流过5-10个层析柱体积，然后使洗脱液电导达到
435mS/cm，将洗脱峰按按保留时间的先后分别收集，直至缓冲液流过5-10个层析柱体积，保 留有羧甲基纤维素酶活性的部分，即为SDS-PAGE电泳纯中温纤维素酶。
本发明所制得的纤维素酶组合物的分子量经SDS-PAGE测定，其在40000道尔顿 120000道尔顿之间，最适反应温度55 70°C，最适反应为pH5.0 pH6.5。本发明提供的由 耐盐高温双歧菌产生的电泳纯中温纤维素酶酶活反应最适温度55'C，最适反应pH值6.0，而 且在碱性条件下能保持较高的活力。本发明由耐盐高温双歧菌产生的纤维素酶组合物和电泳 纯纤维素酶，可在造纸及饲料工业中将得到广泛应用，例如去污剂、纺织物处理或作为一种 动物饲料添加剂。
本发明的优点是所得到纤维素酶在高温下仍具有较高的酶活力，在造纸，生物转化行 业有一定的工业应用价值。全部分离纯化过程中均用pH8.0的Tris-HCl缓冲液，且全部分离 纯化过程简单易行。
本发明制备的电泳纯中温纤维素酶，具有以下酶学性质:
1、 耐盐高温双歧菌产纤维素酶最适酶活温度55'C。酶活力达68.5U/ml。
2、 耐盐高温双歧菌产纤维素酶在4 6(TC之间活力较为稳定，55'C保温5小时，还保持 30% (20.5U/ml)以上的酶活力。温度超过60'C，酶活力下降很快。在75'C保温60min会导 致酶活力下降近90%。
3、 耐盐高温双歧菌产纤维素酶最适pH为6.0，酶活力达68.5U/ml。 pH小于4或大于10
酶活力较低。
4、 耐盐高温双歧菌纤维素酶pH6.0 9.0之间酶活力稳定，在pH6.0 9.0的缓冲液中保 温过夜，其残余酶活力均在80% (54.8U/ml)以上。
5、 Mn2+、 Mg2+、 Al3+、 Pb2+、 C^+和CcP对耐盐高温双歧菌纤维素酶有激活作用，Li+、、 Mn2+、 Na+、 Ca2+、 Fe2+、 Ba"和Fe"对酶活力没有明显的作用作用，Hg2+、 Cu2+、 Zn2+、 Ni2+ 对酶有显著的抑制作用。
6、 变性剂SDS对耐盐高温双歧菌产纤维素酶有明显的抑制作用。鳌合剂EDTA和丝氨 酸蛋白酶专一抑制剂苯甲基磺酰氟化物(PMSF)对耐盐高温双歧菌纤维素酶没有抑制作用， 表明了耐盐高温双歧菌纤维素酶对金属离子没有依赖性且活性中心不含有丝氨酸。
图1为耐盐高温双歧菌产电泳纯中温纤维素酶的反应温度和相对活性的关系曲线。 图2为耐盐高温双歧菌产电泳纯中温纤维素酶的反应pH和相对活性的关系曲线。图3为耐盐高温双歧菌产纤维素酶组合物的反应温度和相对活性的关系曲线c 图4为耐盐高温双歧菌产纤维素酶组合物的反应pH和相对活性的关系曲线。 上述图2中
醋酸-醋酸钠缓冲液。
柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液。 Tris-HCl缓冲液。 甘氨酸--氢氧化钠缓冲液。
醋酸-醋酸钠缓冲液。 柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液。 Tris-HCl缓冲液。 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
表示pH3.0、 3.6、 4.8
■ 表示pH4、 5、 6、 7、 7.6
▲ 表示pH7.5、 8.5 攀表示pH9、 10
上述图4中
表示pH3.0、 3.6、 4.8
■ 表示pH4、 5、 6、 7、 7.6
▲ 表示pH7.5、 8.5 參表示pH9、 10
具体实施例方式
实施例1、
一、 粗酶液的制备将7Tzmwo&y 必/ a/Wo/era似YIM 90462T以10% (体积百分比)接种 量接入液体种子培养基中，在5(TC的条件下振荡培养36小时至指数生长期，将处于指数生 长期的菌液以10% (体积百分比)接种量转接于液体发酵培养基中，在37 45'C培养至5-7 天至稳定期初期即为产酶高峰期，将发酵液离心，取上清液，滤纸过滤，得粗酶液；
二、 用截留分子量为10KDa的超滤膜包将粗酶液的体积浓缩至原来的1/6;
三、 浓縮后的酶液加硫酸铵至30%饱和度，离心取上清液，继续加硫酸铵至50%饱和度， 离心取沉淀，溶解在pH8.0、 0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液中。
上述得到的液体，经纤维素酶活力测定和SDS-PAGE电泳分析，确定为纤维素酶组合物。
四、 将步骤三得到的酶液离心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平 衡好的Butyl-Sepharose预装柱，将透过峰按保留时间的先后分别收集，直至缓冲液流过8-10 个层析柱体积，保留有羧甲基纤维素酶活性的透过峰酶液部分；
五、 将步骤四得到的酶液离心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平 衡好的pentyl-Sepharose预装柱，用无硫酸铵pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集所有洗脱峰 组分；
六、 将歩骤五得到的酶液离心，取上清液加到pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡好的 Q-Sepharose预装柱，用含NaCl pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，首先使洗脱液电导达到 30mS/cm，将洗脱峰按保留时直至缓冲液流过5-10个层析柱体积，然后使洗脱液电导达到35mS/cm，将洗脱峰按按保留时间的先后分别收集，直至缓冲液流过5-10个层析柱体积，保 留有羧甲基纤维素酶活性的部分，即为SDS-PAGE电泳纯中温纤维素酶。
上述步骤四、六中所涉及的羧甲基纤维素酶活性测定方法参考文献Methods for Measuring Cellulase Activities. T. M. WOOD et al. METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 160。
经底物特异性试验分析和SDS-PAGE电泳分析，确定为SDS-PAGE电泳纯中温纤维素酶。
在步骤一中的所述的种子培养基的组成
IOX大量盐溶液 100ml
50X微量量盐溶液 20ml
Peptone 5g
加水定容至1L。
上面提到的IOX大量盐溶液配方为
NaCl 15g (NH4)2S04 31g Na2HP04 91 g 加水定容至1L。
上面提到的50X微量量盐溶液配方为
EDTA 0.5g
MgS04 2.00g
ZnS04 0.08g
FeS04 0.2g
MnS04 0.15g
CaCl2 0.2g
加水定容至200ml。
在步骤一中的所说的发酵培养基的组成 Peptone 10g Yeast 5g NaCl 10-50g
AVICEL (微晶纤维素sigma公司)l一20g 加水定容至1L。
权利要求
1、一种纤维素酶组合物的制备方法，其特征在于由以下步骤组成一、粗酶液的制备将Thermobifida halotolerans YIM 90462T以体积百分比为5-10％的接种量接入液体种子培养基中，在37～45℃的条件下振荡培养至指数生长期，将处于指数生长期的菌液以体积百分比5-10％的接种量转接于液体发酵培养基中，在37～45℃培养至稳定期初期，将发酵液离心，取上清液，滤纸过滤，得粗酶液；二、用截留分子量为10KDa的超滤膜包将粗酶液的体积浓缩至原来的1/6；三、浓缩后的酶液加硫酸铵至30％饱和度，离心取上清液，继续加硫酸铵至50％饱和度，离心取沉淀，溶解在pH8.0、0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液中，得到的酶液为纤维素酶组合物。
2、 一种纤维素酶组合物单一成分的制备方法，其特征在于由以下步骤组成一、粗酶液的制备将7T^mo&拆^ /w/o/o/erara YIM 90462T以体积百分比5 — 10%的接 种量接入液体种子培养基中，在37 45'C的条件下振荡培养至指数生长期，将处于指数生长 期的菌液以体积百分比5 — 10%的接种量转接于液体发酵培养基中，在37 45t:培养至稳定 期初期，将发酵液离心，取上清液，滤纸过滤，得粗酶液；三、用截留分子量为10KDa的超滤膜包将粗酶液的体积浓縮至原来的l/6;三、 浓縮后的酶液加硫酸铵至30%饱和度，离心取上清液，继续加硫酸铵至50%饱和度， 离心取沉淀，溶解在pH8.0、 0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液中；四、 将步骤三得到的酶液离心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平 衡好的Butyl-Sepharose预装柱，将透过峰按保留时间的先后分别收集，直至缓冲液流过8-10 个层析柱体积，保留有羧甲基纤维素酶活性的透过峰酶液部分；五、 将步骤四得到的酶液离心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平 衡好的pentyl-Sepharose预装柱，用无硫酸铵pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集所有洗脱峰 组分；六、 将步骤五得到的酶液离心，取上清液加到pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡好的 Q-Sepharose预装柱，用含NaCl pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，首先使洗脱液电导达到 30mS/cm，将洗脱峰按保留时直至缓冲液流过5-10个层析柱体积，然后使洗脱液电导达到 35mS/cm，将洗脱峰按按保留时间的先后分别收集，直至缓冲液流过5-10个层析柱体积，保 留有羧甲基纤维素酶活性的部分，即为SDS-PAGE电泳纯中温纤维素酶。
3、 如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于在步骤(一)所述的液体发酵培养基 中含有质量体积百分比为0.1—2%的AVICEL，质量体积百分比为l一5。/。的NaCl。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，尤其是纤维素酶组合物以及其中单一成分的制备方法。本纤维素酶组合物的制备方法为一、粗酶液的制备将Thermobifida halotolerans YIM 90462<sup>T</sup>以体积百分比5-10％的接种量接入液体种子培养基中，振荡培养，以体积百分比5-10％的转接于液体发酵培养基中，培养至稳定期初期，将发酵液离心，取上清液，滤纸过滤，得粗酶液；二、用截留分子量为10KDa的超滤膜包将粗酶液的体积浓缩至原来的1/6；三、浓缩后的酶液加硫酸铵至30％饱和度，继续加硫酸铵至50％饱和度，离心取沉淀，溶解在pH8.0、含有0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液中，得到的酶液为纤维素酶组合物。对本纤维素酶组合物再进行进一步的分离、提纯，可以制得其中的一种单一成分——SDS-PAGE电泳纯中温纤维素酶。该电泳纯纤维素酶的活力为68.5U/ml.本发明的优点是所得到纤维素酶在高温下仍具有较高的酶活力，在造纸、生物转化行业有一定的工业应用价值。
文档编号C12R1/01GK101525608SQ20091009434
公开日2009年9月9日 申请日期2009年4月13日 优先权日2009年4月13日
发明者唐蜀昆, 姜成林, 徐丽华, 李文均, 胡松楠, 赵立兴, 魏云林 申请人:云南大学