专利名称：：高温放线糖莱斯菌RHA1菌株产α-淀粉酶及其纯化方法高驗线糖莱斯菌廳菌株产a-淀粉酶及其纯化旅技术领膝本发明属应用微生物领域，具体地，涉及高温放线糖莱斯菌(Laceyellasacchari)RHA1菌株，以及从中获得的耐热性a-淀粉酶及其纯化方法。
背景技术：
：.a-淀粉醇，也称液化型淀粉酶，它能水解淀粉多糖分子中e-l，4-糖苷键，产生单糖和寡糖。它一直被用于多^i域，例如，在发酵液中被用于谷物和马铃薯的糖化，在纺织业中用作淀粉糊去除剂，在制药业中用作助消化药，而在食品业中用于制造粘稠的麦芽糖浆。由于淀粉酶在液化、糖化过程中一般要在高温下使淀粉糊化，因此，淀粉的转化需要热稳定的淀粉酶(heat-stableamylase)。耐热性a-淀粉酶具有良好的热稳定性，在工业生产中有着广泛的应用前景。目前已从中温型微生物和耐热型微生物中分离出了很多种热稳定的淀粉酶.不同来源的a-淀粉酶具有多方面不同性质，从而导致各具特色的应用范围，因而需要持续不断开发新特性a-淀粉酶以更好满足工业需求。现有技术中未有高温放线菌RHA1菌株，以及从中获得的耐热性a-淀粉酶及其纯化方法的报道。
发明内容本发明旨在提供一种能高效产生耐热性a-淀粉酶的高温放线糖莱斯菌RHAl菌株。本发明的另一目的在于提供一种从高M^夂线糖莱斯菌RHA1菌株中获得的a-淀粉酶及其纯化方法。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案高MJ夂线糖莱斯菌(Laceyellasacchari)RHA1菌株,保藏号为CGMCCNo.2639，其具有产生a-淀粉酶的能力。所述的高M^文线糖莱斯菌RHA1菌株，菌株菌落形态为白色透明，有褶铍，表面干燥，且正反颜色不同，球状、革兰氏阳性菌，无鞭毛，无菌毛，在液体培养时产生大量的菌丝体。从高温放线糖莱斯菌RHM菌株中获得的a-淀粉酶。所述的a-淀粉酶r其酶学性质为；liS反应温度为37-C，在28'C-85'C较宽范围内有较高催化活性；最适pH为6，在pH5.0-9.0下，有较高酶活；淀粉酶的分子量为11.9649KDa，为一单体蛋白。从高M^线糖莱斯菌RHA1菌株中获得的a-淀粉酶的纯化方法，包括(1)超*浓縮高温放线糖莱斯菌(Laceyellasacchari)鹏l菌株的发酵培养条件为温度50。C，PH7.5，培养时间16-18小时，将发酵液离心，取上清液，利用10KDa的超滤膜舰行超滤繊(2)硫酸铵沉淀鄉后液体加硫酸铵至40%的饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至60%的饱和度，离心弃上清，沉淀最后用PH7.0的磷酸盐缓冲液溶解，制成粗酶液；(3)Superdex7510/300凝胶过滤层析将获得的粗酶液离心，上清进行MI，上样于用50mM，PH7.0的磷酸盐缓冲液预平衡扭的Superdex7510/300凝胶过滤层析柱，洗脱，收集酶活性部分，即为a-淀粉酶纯酶。本发明高iU^文线糖莱斯菌(Laceyellasacchari)RHA1菌株已经于2008年8月26日在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.2639。本发明的高MJ夂线糖莱斯菌(Laceyellasacchari)RHA1菌株，分离自腾冲^7曳。菌株筛选培养基为(g/L):(NH4)2S04，1.3;蛋白胨，1;可溶性淀粉，4;KH2P04，0.276;MgS04'7H20,0.25;酵母提取物，1;Na2Mo042H20，0.000025;CuS04，0.000016;MnS04H20，0.0022;貼03，0.0005;ZnS047H20，0.0005;CoCl26H20，0.000046、CaS04'H20，0.06;FeS04，0.099;pH7.5。高M^夂线糖莱斯菌RHA1菌株，菌落形态为白色布透明，有褶铍，表面T^喿，且正反颜色不同。经革兰氏染色得，瞧l菌株为球状、革兰氏阳性菌，通过电镜观察，RHA1菌株细胞呈球状，直径在800ran左右；无鞭毛，无菌毛，在液体培养时产生大量的菌丝体，菌丝体直径约为300nm。.本发明所涉及的高M^文线糖莱斯菌RHA1菌株的a-淀粉酶的纯化步骤为(D超、搶浓縮高M^线菌腿l菌株的发酵培养^f牛为驢5(TC，PH7.5，培养时间约18小时。将发酔液离心，取上清液，禾佣lOKDa的超滤膜舰行超熗浓縮。(2)硫酸铵沉淀浓縮后液体加硫酸铵至40%的饱和度，离心取上清，继续力口硫酸铵至60%的饱和度，离心弃上清，沉淀最后用PH7.0的磷酸盐缓冲液溶解，制成粗酶液o(3)Superdex7510/300凝胶过滤层析将获得的粗酶液离心，上清进行、MI，上样于用50mM，PH7.0的磷酸盐缓冲液预平衡过的Superdex7510/300凝胶过滤层析柱，洗脱，收集酶活性部分，即为纯酶。高温放线糖莱斯菌RHA1菌株所产a-淀粉酶具有以下酶学性质-1、最适酶活温度为37'C，并在2885t:均有较高催化活力。2、最适ra为6.0，在PH5.0-9.0下均有较高酶活。3、金属离子依赖性为Na+、Ca2+、Mg2+对该酶有一定的激活作用，尤其是Mg"作用最强，而Zrf、Fe2+、Fe3+、、Cu2+、Ni2+、对其有较强的的抑制作用。4、底物特异性为:可溶性支链淀粉(100%》可溶性淀粉(70.6%》直链淀粉(50.3%)。5、蛋白酶的分子量为11.9KDa。图1为RHA1菌株产生的a-淀粉酶的反应温度和相对酶活关系曲线；图2为RHA1菌株产生的a-淀粉酶的反应PH和相对酶活关系曲线；图3RHA1菌株产生的高温a-淀粉酶水解可溶性淀粉的产物TLC分析，其中l:为Marker:葡萄糖、麦芽二糖、麦芽三糖；2:直连淀粉，3支链淀粉，4可溶性淀粉。具体实式下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。实施例l:高M^文线糖莱斯菌RHA1菌株的分离筛选及鉴定高M^线菌RHM菌株，分离自腾冲M^。菌株筛选培养基为(g/U:(Na)2S04，1.3;蛋白胨，1;可溶性淀粉，4;KH2P04，0.276;MgS047H20，0.25;酵母提取物，1;Na2Mo042H20，0.000025;CuS04，0.000016;MnS04H20，0.0022;貼03，0.0005;ZnS047H20，0.0005;GoCl26H20,0.000046;CaS04H20，0.06;FeS04，0.099;pH7.5。培养条件为温度50。C，150rpm振荡培养，培养时间约18小时。采用细菌系统鉴定方法对高^^线糖莱斯菌RHA1菌株进行鉴定。该菌的形态学特征如下白色布透明，有褶铍，表面千燥，且正反颜色不同，革兰氏阳性菌。通过电镜观察，RHA1菌株细胞呈球状，直径在800nm左右；无鞭毛，无菌毛，生长PH范围是5.0-9.0，最适PH为7.5;生长温度范围是2578。C，最适温度为50。C。实施例2:a-淀粉酶的纯化(1)超滤浓缩高微线菌離l菌株的发酵培养^f牛为、驗5(TC，pH7.5，培养时间约18小时。将发酵液离心，取上清液，利用lOKDa的超滤膜皿行超滤浓縮。(2)硫酸铵沉淀繊后液体加硫酸铵至40%的饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至60%的饱和度，离心弃上清，沉淀最后用PH7.0磷酸盐缓冲液溶解，审喊粗酶液。(3)Superdex7510/300凝胶过滤层析将获得的粗酶液离心，上清进行MI，上样于用50mM，PH7.0的磷酸盐缓冲液预平衡过的Superdex7510/300凝胶过滤层析柱，洗脱，收集酶活性部分，即为纯酶。《髓为0.4ml/min，收麟脱峰，检测蛋白浓度及酶活性部分，用10KDa的浓縮管于4'C离心收集浓缩，即为纯酶，冷冻保存。将l缩的样品进行SDS-PBGE电泳分析，得到单一条带，表明纯化的ci-淀粉酶已经达到电泳纯，分子量为11.9649KDa。a-淀粉酶活性的测定采用碘-淀粉比色法(周景详等.蛋白酶和淀粉酶活性检测.中国饲料，2001，23(11))。淀粉酶活性定义为100ml酶液在55。C和底物淀粉作用30min，水解产生10mg淀粉为1个淀粉酶活性单位。a-淀粉酶纯度的检测采用SDS-PBGE垂直凝胶电泳(LaemmliUK，1970)。蛋白质含量的测定采用Bradford检测法(MarionM.Bradford,1976)。实施例3:a-淀粉酶的特性①最适酶活皿将酶液加到磷酸盐缓冲液(50raM磷酸盐缓冲液，PH7.0)中，以可溶性淀粉作为底物，在底物浓度为1%的条件下，测定RHA1菌株所产淀粉酶在28-98"C范围内不同温度下的酶活。结果如图l所示，表明该a-淀粉酶的最适酶活温度为37'C。②热稳定性将酶液加到磷酸盐缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，PH7.0)中，并在不同温度的恒温水浴中保温，在不同的时间(0-90min，取样间隔为15min)取样，然后按照标准的酶活测定方法测定酶活。温度对酶稳定性的影响表示为在一定时间后乘除酶活所占原来酶活的百分比，该淀粉酶在98。C保温45min后还具有14.6W的活力，表明该淀粉酶具有较好的热稳定性。③最适PH用PH3.0至PHll.0的不同的缓冲液稀释酶液，分别加入相应PH的1%的可溶性淀粉，在55。C下测定酶活力，结果如图2所示，表明RHA1菌株所产的ct-淀粉酶在PH6.0时酶活最高。④对金属离子的依赖性将加有金属离子的稀释酶液在55r中保温10h后，定量测出剩余酶活，与对照相比，求出相对酶活力，结果如表1所示，表明Na+、Ca2+、Mg2+对酶有一定的激活作用，尤其Mg2+对酶具有较强的激活作用+。而Ccf、Ni2+、K+、齔2+对酶有一定的抑帝舴用，其余离子Zn2+、Fe2+、Fe3+、、Cu2+、Ni2+'等对酶有较强的抑制作用(见表l)。表lRHAl菌株产生的a-淀粉酶的酶活力受不同金属离子的影响,<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>⑤底物专一性研究将纯酶与浓度为0.5%的各种底物在55'C下反应10min之后，测定0D660吸光值。结果如表2所示，表明该酶对底物可溶性淀粉具有最好的催化作用，对于支链淀粉底物的催化作用次之，而对于支链淀粉底物的催化作用最弱(见表2)。表2RHA1菌株产生的a-淀粉酶对不同底物的特异性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1、一种高温放线糖莱斯菌(Laceyellasacchari)RHA1菌株，保藏号为CGMCCNo.2639，其具有产生α-淀粉酶的能力。2、权利要求1所述的高温放线糖莱斯菌RHA1菌株，其特征在于菌株菌落形态为白髓明，有褶铍，表面千燥，且正反颜色不同，球状、革兰氏阳性菌，无鞭毛，无菌毛，在液体培养时产生大量的菌丝体。3、从高M^文线糖莱斯菌RHA1菌株中获得的a-淀粉酶。4、权利要求3所述的a-淀粉酶，其酶学性质为最适反应温度为37'C，在28°C-85。C较宽范围内有较高催化活性；最适PH为6，在PH5.0-9.0下，有较高酶活；淀粉酶的分子量为11.9KDa,为一单体蛋白。5、权利要求3所述的a-淀粉酶的纯化方法，包括超熗鹏、硫酸铵沉淀、Superdex7510/300凝胶过滤层析。6、如权利要求5所述的纯化方法，其特征在于高謙线菌腿l菌株的发酵培养条件为温度50。C，PH7.5，培养时间16-18小时，将发酵液离心，取上清液，用腸a的超滤膜包进行超麟縮。7、如权利要求5所述的纯化方法，其特征在于硫酸铵沉淀是指高温放线菌RHA1Wl后液体加硫酸铵至40%的饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至60%的饱和度，离心弃上清，沉淀最后用PH7.0的磷酸金缓冲液溶解，制成粗酶液。8、如权利要求5所述的纯化方法，其特征在于Superdex7510/300凝胶过滤层析是将获得的粗酶液离心，上清进行游宿，上样于用50mM，PH7.0的磷酸盐缓冲液预平衡过的Superdex7510/300凝胶过滤层析柱，洗脱，收集酶活性部分，即为a-淀粉酶纯酶。全文摘要本发明公开了一种耐热性高温放线糖莱斯菌(Laceyellasacchari)RHA1菌株产高温α-淀粉酶及其纯化方法。高温放线糖莱斯菌RHA1菌株菌落形态为白色透明，有褶皱，表面干燥，且正反颜色不同，球状、糖莱斯革兰氏阳性菌，无鞭毛，无菌毛，在液体培养时产生大量的菌丝体。高温放线糖莱斯菌RHA1所产淀粉酶的制备方法为将发酵上清液经1KDa的超滤膜包进行超滤浓缩、硫酸铵沉淀获得粗酶液，经Superdex7510/300凝胶过滤，得到纯的耐热性α-淀粉酶。本发明获得的α-淀粉酶，分子量只有11.9KDa，为一单体蛋白，为目前报道的分子量最小的淀粉酶。其水解直链淀粉和可溶性淀粉的产物为麦芽糖和麦芽三糖，此酶作用温度范围广，能耐受高温，在食品加工、医药、洗涤剂等方面具有应用价值。文档编号C12N1/20GK101619301SQ200910094648公开日2010年1月6日申请日期2009年6月25日优先权日2009年6月25日发明者井申荣,季秀玲,李秋鹏,林连兵,伟洪,熊学权,陆月情,波陈,魏云林申请人:昆明理工大学