一种快速鉴别中间型高温放线菌的特异pcr方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速鉴别中间型高温放线菌的特异PCR方法，其技术方案是以基因组DNA为模板，采用本发明设计的特异引物进行PCR反应，扩增中间型高温放线菌的特征持家基因，实际扩增片段为576bp，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，鉴别样品是否为中间型高温放线菌。本发明可快速识别中间型高温放线菌，只需DNA提取、PCR扩增和电泳检测三步即可完成鉴别，具有高效、灵敏、便捷及成本低廉等显著优点。
【专利说明】—种快速鉴别中间型高温放线菌的特异PCR方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学鉴别领域，具体涉及中间型高温放线菌的快速鉴别方法。【背景技术】
[0002]中间型高温放线菌intermedius')最早由Kurup 于 1981 年发现，属于细菌域(Eubacteria)-厚壁菌门(Firmicutes)-芽孢杆菌纲(Bacilli)-芽孢杆菌目(Bacillales)-高温放线菌科(Thermoactinomycetaceae) _高温放线菌属(Thermoactinomyces),常见于自然界的高温环境,嗜高温,能产生丰富的菌丝和内生孢子。
[0003]中间型高温放线菌可生产耐热、光稳定的亮氨酸脱氢酶和苯丙氨酸脱氢酶，在药物工业上有重要的应用价值。近年来，芝麻香型白酒酿造微生物研究中发现中间型高温放线菌为高温大曲中的优势菌种，其代谢产物对芝麻香型白酒特殊风味物质形成具有不可忽视的作用。因此，对高温大曲等高温环境中的中间型高温放线菌菌株的筛选鉴别具有重要实践意义。然而，中间型高温放线菌与其近缘种之间在形态学特征、生理生化特征及16SrRNA基因序列方面均十分接近，应用常规技术鉴别繁琐费时，无法满足中间型高温放线菌的筛选及其应用研究的要求，因此，目前亟需建立一套准确，快速的中间型高温放线菌鉴别方法，为菌种的选育及其应用研究提供技术支撑。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种可以快速鉴别中间型高温放线菌的方法。
[0005]为达到上述目的，本发明设计了中间型高温放线菌的特异PCR引物，进行特异PCR扩增反应，可扩增出中间型高温放线菌的特征持家基因，实际扩增片段为576bp。
[0006]用于鉴别中间型高温放线菌的引物序列如下:
上游引物 78F:5’ -TTGTCCACGTGGTTG`TCG-3’
下游引物 618R:5’ -TACGTCATCCCCGGTCAG-3’。
[0007]本发明采用的技术方案如下:
1)获取菌种基因组DNA；
2)采用上述引物在PCR仪上进行PCR扩增；
PCR 反应体系为 50 μ?，其中 IOXTaq reaction buffer 5.0 μ?，引物(10 μ mol/L)各1.0 μ1，10 μ mol/L 的 dNTP 4.0 μ?，2.5U 的 Taq 酶 0.6 μ?，DNA 模板 1.0 μ?,-- H2O 37.4μ?。
[0008]PCR扩增的反应条件分别为:
78F/618R:95°C预变性 5 min，进入循环:94°C变性 30s，52°C复性 30s，72°C延伸 80s，共35个循环，然后72°C延伸lOmin。
[0009]3) PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行检测。
[0010]4)中间型高温放线菌鉴别
在紫外灯下查看电泳条带，在576bp处有电泳条带的菌株为中间型高温放线菌，在576bp处均无条带为其它种。
[0011]本发明经过充分的前期试验筛选和优化，得到的引物特异性强，PCR扩增条件简单，采用简单PCR反应后，通过电泳检测便可快速鉴别高温放线菌属菌种，具有高效、便捷及成本低廉等显著优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1中间型高温放线菌的特异性引物设计示意图，其中有下划线的部分为扩增片段对应的核苷酸序列，有下划线的斜体加粗部分为所设计的引物特异性结合位点。
[0013]图2为引物78F/618R的PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中的电泳图谱，
1-T.vulgaris DSM 43016，2_Τ.vulgaris ACCC 41061,3-T.vulgaris ZM60,4-L.sacchari DSM 43356，5_L.putidus DSM44608,6-B.thuringiensis CICC 22945，7_T.1ntermedius DSM 43816,8-B.1icheniformis CICC 10101，9_L.tengchongensis CCTCC M208050,10- L.sediminis CCTCC AA 2011024,11-Blank, M-DL2000 marker? [0014]具体实施案例
下面结合实施案例对本发明进行具体说明，实施案例是为了进一步阐述本发明，而不会给本发明造成任何限制。
[0015]实施例一:特异性PCR引物的设计
根据GenBank上公开登录的中间型高温放线菌基因序列信息进行引物 设计(见附图1)。
[0016]参考序列的GenBank登录号为5没^rKThermoactinomycesintermedius,gyrBgene, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/82568126)。
[0017]在61-78处设计上游引物，命名为78F。序列为:5’ -TTGTCCACGTGGTTGTCG-3’。
[0018]在618-637处设计下游引物，命名为 618R。序列为:5’-TACGTCATCCCCGGTCAG-3’。
[0019]实施例二:弓丨物特异性验证
1.1中间型高温放线菌菌株及其近缘种菌株
普通高温放线菌(Thermoac tinomyces vulgaris DSM 43016 ),中间型高温放线菌(Thermoactinomyces intermedius DSM 43816),H 1? |if iLaceyella sacchari
DSM 43356)，恶臭莱西氏菌putidus DSM44608)购自德国微生物菌种保藏中心；苏云金芽抱杆菌Cfeci77w5.thuringiensis CICC 22945),地衣芽抱杆菌licheniformis CICC 10101)来自中国工业微生物菌种保藏管理中心-,Laceyellatengchongensis CCTCC AA 2^^,Laceyella sediminis CCTCC AA 2011024 购自中国典型培养物保藏中心；普通高温放线菌vulgaris ACCC 41061)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心；普通高温放线菌vulgaris ZM60)由CICC自行分离鉴定。
[0020]1.2菌株基因组DNA提取
采用天根生化科技(北京)有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒对菌株的基因组DNA进彳了提取。
[0021 ] I.3基因组DNA的PCR扩增
PCR 反应体系为 50 μ?，其中 IOXTaq reaction buffer 5.0 μ?，引物(10 μ mol/L)各1.0 μ?,?ο μ mol/L 的 dNTP 4.0 μ?，2.5U 的 Taq 酶 0.6 μ?，DNA 模板 1.0 μ?,-- H2O 37.4μ?。
[0022]PCR扩增的反应条件分别为:
95°C预变性5 min，进入循环:94°C变性30s，52。。复性30s，72。。延伸80s，共35个循环，然后72°C延伸lOmin。
[0023]1.4 PCR产物检测
PCR扩增产物分别在1%琼脂糖凝胶中电泳，在576bp处有电泳条带的菌株为中间型高温放线菌，在576bp处无条带为其它属菌株(详见附图2)。
【权利要求】
1.一种中间型高温放线菌的快速鉴别方法，其特征在于:经过简单的PCR反应，可以快速鉴别中间型高温放线菌。
2.按照权利要求1所述的中间型高温放线菌快速鉴别方法，其特征在于:用于鉴别中间型高温放线菌的特异引物为:
上游引物 78F:5’ -TTGTCCACGTGGTTGTCG-3’
下游引物 618R:5’ -TACGTCATCCCCGGTCAG-3’。
3.按照权利要求2所述的中间型高温放线菌快速鉴别方法，其特征在于:PCR反应体系为 50 μ?，其中 IOXTaq reaction buffer 5.0 μ?，引物(10 μ mol/L)各 1.0 μ1，10 μ mol/L 的 dNTP 4.0 μ?, 2.5U 的 Taq 酶 0.6 μ?, DNA 模板 1.0 μ?, dd H2O 37.4 μ?。
4. 按照权利要求3所述的中间型高温放线菌快速鉴别方法，其特征在于:所述PCR扩增的反应条件分别为: 78F/618R:95°C预变性 5 min，进入循环:94°C变性 30s，52°C复性 30s，72°C延伸 80s，共35个循环，然后72°C延伸lOmin。
5.按照权利要求4所述的中间型高温放线菌快速鉴别方法，其特征在于:PCR扩增产物采用1%的琼脂糖凝胶进行检测。
6.按照权利要求5所述的中间型高温放线菌快速鉴别方法，其特征在于:在576bp处有电泳条带的菌株为中间型高温放线菌。
【文档编号】C12R1/01GK103614485SQ201310667412
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】程池, 赵纪文, 姚粟, 信春晖, 李辉, 刘勇, 张明娟 申请人:中国食品发酵工业研究院, 山东扳倒井股份有限公司