一种蝙蝠蛾拟青霉菌粉的特异pcr鉴真方法
【专利摘要】本发明公开了一种蝙蝠蛾拟青霉菌粉的特异PCR鉴真方法。其技术方案是以样品的基因组DNA为模板，采用本发明设计的特异PCR引物，进行一次单管特异PCR反应，扩增冬蝙蝠蛾拟青霉的特征性持家基因，实际扩增片断为231bp，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断样品的真实性。本发明可特异性识别蝙蝠蛾拟青霉菌粉，只需DNA提取、PCR扩增和电泳检测三步即可完成对样品的真实性检测，操作简单、易于掌握、准确性高。
【专利说明】—种蝙蝠蛾拟青霉菌粉的特异PCR鉴真方法
【技术领域】
[0001]本发明属于保健食品鉴真领域，具体涉及蝙蝠蛾拟青霉菌粉的鉴真方法。
【背景技术】
[0002]蝙蝠蛾拟青霉是从冬虫夏草原草中分离得到的重要药用真菌，可产生虫草酸、虫草素、虫草多糖等多种重要的功效性成分，具有增强免疫力、缓解体力疲劳等保健功能，其有效作用已获得民间的广泛认可。
[0003]自2001年被列入中国卫生部发布的“可用于保健食品的真菌菌种名单”以来，蝙蝠蛾拟青霉作为保健食品生产原料受到广泛关注，尤其是在其发酵菌丝体的基础上已开发出多种不同类型的保健食品。据统计，2012年我国生产蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体原料3000吨，产值已达到50亿元。然而，目前尚没有专门用于蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体真假鉴别和质量控制的标准方法，产品质量难以保证，极大限制了蝙蝠蛾拟青霉产业的升级和规范发展。
[0004]因此，在蝙蝠蛾拟青霉发酵菌粉生产和流通过程中，亟需一种有效、快速、准确的鉴真方法，以实现对其品质的控制和管理。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种可用于蝙蝠蛾拟青霉菌粉鉴真的可靠方法。
[0006]为达到上述目的，本发明设计了蝙蝠蛾拟青霉性持家基因的特异PCR引物，通过一次单管PCR反应，扩增蝙蝠蛾拟青霉特征性持家基因，实际扩增片断为231bp。
[0007]用于蝙蝠蛾拟青霉菌粉鉴真`的引物序列如下:
上游引物 CICC- Pae -Fl:5’ - GAGCATGGTCTCGACTCT -3’
下游引物 CICC- Pae -Rl:5，- CGAAGGGACCAGCACGG -3，。
[0008]本发明采用的技术方案如下:
1)犾取样品基因组DNA；
2)采用上述引物在PCR仪上进行PCR扩增；
PCR扩增反应体系为 25μ?，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5μ?，2 条引物(10 μ mol/L)各 ?μ?，10 μ mol/L 的 dNTP 2μ?, 2.5U 的 Taq 酶 0.5μ?, DNA 模板 1.Ομ?, ddH20 17μ?。
[0009]PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5min，进入循环:95°C 30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环，然后72°C延伸5min。
[0010]3) PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶进行检测。
[0011]4)样品的真实性判断
在紫外灯下查看电泳条带，在231bp处有明亮条带的为蝙蝠蛾拟青霉菌粉,无条带者为伪品。
[0012]本发明经过充分的前期试验筛选和优化，得到的引物特异性强，PCR扩增条件简单，采用一次单管特异PCR反应后，通过电泳检测便可鉴别产品真伪，操作简单，成本低，准确度高，具有很好的应用前景。
[0013]
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为蝙蝠蛾拟青霉基因特异性引物设计示意图,其中有下划线的部分为扩增片段对应的核苷酸序列，有下划线的斜体部分为所设计的引物特异性结合位点。
[0015]图2为PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中的电泳图谱，1-DL2000 Marker, 2_蝙蝠蛾拟青霉菌粉，3-冬虫夏草菌粉，4-亚香棒虫草，5-蛹虫草菌粉，6-阴性对照，7- DL2000Marker。
[0016]具体实施案例
下面结合实施案例对本发明进行具体说明，实施案例是为了进一步阐述本发明，而不会给本发明造成任何限制。
[0017]实施例一:PCR引物的设计及其对样品的检测
I蝙蝠蛾拟青霉P基因特异PCR引物的设计
根据GenBank上公开登录的蝙蝠蛾拟青霉β -tubulin基因序列信息进行引物设计(见附图1)。
[0018]参考序列的GenBank登录号为:AY624217。
[0019]在18-35处设计上游引物，命名为CICC- Pae -Fl0序列为:5’_ GAGCATGGTCTCGACTCT -3，。
[0020]在233-249处设计下游引物，命名为CICC- Pae -R1。序列为:5’_ CGAAGGGACCAGCACGG -3，。
[0021]2样品的检测 2.1样品的收集
购买市售蝙蝠蛾拟青霉菌粉、冬虫夏草菌粉、亚香棒虫草、北冬虫夏草菌粉。
[0022]2.2样品基因组DNA提取
采用改良CTAB法提取基因组DNA，并使用OMEGA公司生产的DNA纯化试剂盒对其进行纯化。
[0023]2.3基因组DNA的多重PCR扩增
PCR扩增反应体系为 25μ?，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5μ?，2 条引物(10 μ mol/L)各 ?μ?，10 μ mol/L 的 dNTP 2μ?, 2.5U 的 Taq 酶 0.5μ?, DNA 模板 1.Ομ?, ddH20 17μ?。
[0024]PCR扩增的反应`条件为:95°C预变性5min，进入循环:95°C 30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环，然后72°C延伸5min。
[0025]2.4 PCR产物检测
PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，在231bp处出现明亮条带的为蝙蝠蛾拟青霉菌粉，无条带为其他样品(详见附图2)。
【权利要求】
1.一种蝙蝠蛾拟青霉菌粉的鉴真方法，其特征在于:经过一次简单的特异PCR反应检测蝙蝠蛾拟青霉特征性持家基因。
2.按照权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉菌粉鉴真方法，其特征在于:用于检测蝙蝠蛾拟青霉持家基因的特异PCR引物为:
上游引物 CICC- Pae -Fl:5’ - GAGCATGGTCTCGACTCT -3’
下游引物 CICC- Pae -Rl:5’ - CGAAGGGACCAGCACGG -3’。
3.按照权利要求2所述的蝙蝠蛾拟青霉菌粉鉴真方法，其特征在于:PCR扩增反应体系为 25μ?，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5μ?，2 条引物(10 μ mol/L)各 ?μ?，10 μ mol/L的 dNTP 2μ?, 2.5U 的 Taq 酶 0.5μ?, DNA 模板 1.Ομ?, ddH20 17μ?。
4.按照权利要求3所述的蝙蝠蛾拟青霉菌粉鉴真方法，其特征在于:所述PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5min，进入循环:95°C 30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环，然后72°C延伸5min。
5.按照权利要求3所述的蝙蝠蛾拟青霉菌粉鉴真方法，其特征在于:所述PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5min，进入循环:95°C 30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环，然后72°C延伸5min。
6.按照权利要求5所述的蝙蝠蛾拟青霉菌粉鉴真方法，其特征在于:在231bp处有电泳条带的样品为蝙蝠 蛾拟青霉菌粉。
【文档编号】C12Q1/68GK103614484SQ201310667351
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】程池, 扎西才吉, 李辉, 姚粟, 刘洋, 白飞荣 申请人:中国食品发酵工业研究院, 玉树藏族自治州三江源药业有限公司