专利名称：：嗜热短小芽孢杆菌株Tamy12及其产高温淀粉酶的制作方法
技术领域：
：本发明属应用微生物领域。具体地，涉及一种短小芽孢杆菌(泡cj77^p，j7os)Tamyl2菌株，以及从中产生获得的高温淀粉酶。
背景技术：
：嗜极微生物(Extremophiles)这个词是由MacElroy于1974年提出来的，是指在一般生物无法生存的极端环境中(高温、寒冷、强酸、强碱、高盐、高压、高辐射等)能够正常生存的微生物群体的统称。主要包括嗜酸微生物、嗜碱微生物、嗜盐微生物、海洋微生物、嗜压微生物、嗜冷微生物、嗜热微生物等。嗜热微生物，是一类生活在高温环境中的微生物，如火山口及其周围区域、温泉、工厂高温废水排放区等。来源于嗜热微生物的极端酶，在极端环境下有着与普通酶有不同的活力和稳定性。嗜热酶具有酶制剂的制备成本低，动力学反应快，对反应冷却系统要求标准低，减少能耗，提高了产物纯度等优点，因此在众多领域蕴藏一定的应用潜力。淀粉酶是目前应用最多的一种酶，它在淀粉工业中具有最广泛的应用，能水解和消化淀粉。a-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，是内切型淀粉酶，它作用于淀粉时是从分子内部任意切开a-l，4键，使淀粉分子鹏隨，失去粘性和碘的呈色反应，同时使水解物的还原力增加。在以直链te粉为底物时，反应一般分为二步进行，它首先任意切开a-l，4键，使直链淀粉fflil水解生成麦芽糖、麦芽三糖和较大分子的寡糖，然后再将麦芽三糖和寡糖缓優水解成麦芽糖和葡萄糖。第二步，a-淀粉酶作用于支链淀粉时，它可以任意水飾-1，4OT键，但不能切开分支点的a-l，6键，也不能7jC解分支点附近的a-l，4OT键，而是可以越过a-l，6键而切开内部的a-1,4键，因此水解产物除麦芽糖、葡萄糖外，还含有一系列的a-极限糊精。由于淀粉酶在液化、糖化过禾呈中一般要在高》显下使淀粉糊化，因此淀粉的转化需要热稳定的淀粉酶(heat-stableamylase)。耐热性a-淀粉酶具有良好的热稳定性，在:oik生产中有着广泛的应用前景。对高温淀粉酶进行筛选，并对其生物学特l^a行分析，将为今后高温淀粉^^适应性机制研究及M工农^i:的应用研究樹共依据。迄今，现有技术中没有短小^包杆菌(泡"7^sp鹏j'7ossp.)Tamyl2菌株的报道，也没有由其产生的高温淀粉酶的J随。
发明内容本发明旨在掛共一种能在高温下产生具皿高酶活性的高温淀粉株，即短小芽孢杆菌(泡w77os印.)Tamyl2菌株，由其产生获得的高温淀粉酶，其制备方法。为了实现本发明的战目的，本发明掛共了如下的技术方案一种短小芽包杆菌(fec/Lws/mm7〃s)Tamyl2菌株，菌种保藏号CGMCCNo.2641，其具有产生高温淀粉酶的能力。短小芽孢杆菌(泡w72"sp鹏j7os)Tamyl2菌株菌落白色，表面干燥，边缘圆整；细胞为短杆^^^包，革兰氏阳性菌，生长pH范围是5.0-9.0，驗pH为7.5;,范围是38-70"，；ft^生长,为55。C。本发明还Hf共了从短小魏杆菌(泡ci"〃spi^7〃s)Tamyl2菌株中获得的高温淀粉酶。高温淀粉酶的酶学性质为粗酶液可以将可溶性淀粉分解为葡萄糖、麦芽糖及3到6个葡萄糖基的寡糖，最适pH为5，反应温度为45-80'C。本发明突变体短小^&杆菌(泡cj7Aap鹏j'7os)Tamyl2菌株B^5于2008年8月26日妇匕京中国微生物菌种f贜管理委员会普通微生物中心臓，菌种《繊号为:CGMCCNo.2641。该菌株分离于腾冲热海。菌株筛选固体培养基为(g/L):(NH4)2S04，1.3;蛋白胨，1;可溶性淀粉，10;KH2P04，0.276;MgS047恥，0.25;酵母提取物，1;Na2Mo042H20，0.000025;CuS04，0.000016;MnS04H20，0.0022;貼03，0.0005;ZnS04*7H20，0.0005;CoCl26H20，0.000046;CaS04H20，0.06;FeS04，0.099;劍旨，20;pH7.5。.短小芽孢杆菌(^&cj77mpi^7〃ssp.)Tamyl2菌株菌落白色，表面T^喿，边缘圆整；细胞为短杆状产^包，革兰氏阳性菌，生长pH范围是5.0-9.0，驗pH为7.5;温度范围是38-70。C，；SiS生长温度为55。C。经形态学和生理生化特征鉴定，结合16SrRNA基因序列分析，将分离的嗜热菌鉴定为短小芽孢杆菌属的一个菌株，命名为fecj'"asp鹏j7yssp.Tamyl2。短小^包杆菌(万a"7J〃s;i^7"ssp.)Tamyl2菌株所产高温淀粉酶具有以下酶学鹏1、驗反应驢为8(TC左右，在45-8(TC范围内均WW的活性，且在98'C下{，有3W。左右的活性。2、Tamyl2粗酶液皿反应pH为5。3、Tamyl2的粗酶液中淀粉酶可以将可溶性淀粉分解为葡萄糖、麦芽糖及3到6个葡萄糖基的寡糖；图1为Tamyl2菌株产生的高温淀粉酶Native-PAGE电泳活性^fe结果，其中1:Tamyl2菌株所产粗酶液考马斯R250^结果；2:Tamyl2菌株所产粗酶液淀粉活性染色结果；图2为Tamy12菌株产生的高温淀粉酶水解可溶性淀粉的产物TLC薄层层析结果，图中l:葡萄瞎，4:菌株Tamyl2粗酶液消化的可溶性淀粉，5:未消化的可溶性淀粉，6:麦芽糖；图3为Tamyl2菌株产生的高温淀粉^催化pH曲线；图4为Tamyl2菌株产生的高温淀粉^M3g催化温度曲线。具体实施方式短小鄉杆菌(泡"77osp鹏j7ossp.)Tamyl2菌株的分离筛鉴定Tamyl2菌株，分离自云南省腾冲热海。腾冲*的泥土在菌株筛选液体培养基中55°C，短时间摇瓶培养，涂布在菌株筛选固体培养基上，55。C培养l2天，挑出菌株点种于菌株筛选固体培养基上，55"C培养34天后石I^^，观察透明圈大小，筛选出产淀粉酶的Tamyl2菌株。菌株筛选液体培养基为(g/L):(肌)2504，1.3;蛋白胨，1;KHm，0.276;MgS047H20，0.25;酵母提取物，1;Na賊2肌0.000025;CuS04，0.000016;MnS04'H20,0.0022;,3，0.0005;ZnS047H20，0.0005;CoCl2*6H20,0.000046;CaS04H20，0.06;FeS04，0.099;pH7.5。菌株筛选固体培养基为(g/L):(NH4)2S04，1.3;蛋白胨，1;可溶性淀粉，10;KHPOo0.276;MgS04*7H20，0.25;酵母提取物，1;Na2Mo042H20，0.000025;CuS04，0.000016;MnS04H20，0.0022;朋03，0.0005;ZnS047Hz0，0.0005;CoCl26H20，0.000046;CaS04'肌0.06;FeS04，0.099;劍旨，20;pH7.5。翻细菌系统鉴定方法对(肠'勵，7tASsp.)Tamyl2菌微行鉴定。该菌的形态学特征如下離为白色，表面千燥，i^彖圆整；细胞为短杆状，革兰氏阳性菌；纟鹏范围是38-70°C，顧生长驗为55。C。乡姚态学和生理生化特征鉴定，结合16SrRNA基因序列分析，将分离的高温细菌鉴定为短小新包杆菌种的一个菌株，定名为泡c!72〃sp画7"ssp.Tamyl2。将实施例1的短小^包杆菌(泡"7〗os/鹏W〃ssp.)Tamyl2菌株接种于50ml菌株f繊液体培养基中，55。C摇^i咅养24h。按1:10的比例接种至500ml菌株筛选液体培养基中，55。C摇^J:咅养4天。发M于4。C，6500ipm离心10min，收穀酵上清液，再用滤應抽滤两次。用10，000丽C0月i^[彌滤^i至50ml，4。C皿浓縮液。鄉例3:实施例2鄉液的Native-PAGE:①Native-PAGE:不连续电泳中，分离胶浓度为12%(分离胶中加A^冬浓度为0.1%的淀粉溶液)，浓縮胶浓度为5%。电泳条件加样15ul后，电压调为130V，在4。C下进行，电泳时间为3h。②电泳结束后，将一半繊浸泡在3(Mris-Tcl缓冲液中，55。C温育6h，用石赚染色。根据碘-淀粉显色的性质，被淀粉酶水解后的周围会有明显的水解圈产生。⑩嫩她、脱色将另一书MS行她、脱色。其步骤为"嫩交置于塑料盒中，加入考马斯離R250鹏液(浸没繊)，在脱色摇床上她30min。b.倒去考马斯亮蓝R250染液，用去离子7jC漂^先M^，然后加入100ml脱色液(25ml甲醇，10ml冰乙働Q水定容至100ml)，在脱色摇床上她30min，倒去脱色液，識加入新的脱色液，脱舰液。c.当嫩交上的蛋白絲清晰，基本无底色时，停止脱色，倒去脱色液，用去离子水漂洗繊。结果如图1所示，表明粗酶液中某蛋白有淀粉酶活性。鄉例4:实施例2舰可溶性淀粉的水解鹏(1))!^^G板115。C烘箱活化30min(2)点样取赚微，鄉臓边1.5cm水平线上间隔均匀的点样，其中分别点上Marker(含有葡纖、麦芽糖和麦芽三糖)、纟S116h水解1%可溶性淀粉的样品消化液，点样点用吹Mt几吹干。(3)展层层丰舰内倒入深度为lcm左右的願剂(正丁醇、冰乙酸、水，5:3:2，V/V/V)，将薄层^^A层丰aiit行展层，当展层齐顿沿离ft^顶端l-2cm时，将薄板取出，凉干，进行二離层。二離层后将薄板方JCA65。C烘箱30min。(4)显色喷洒显色剂(4g二苯胺，4ml苯胺及20ml85%§|酸溶于200ml丙酮)，然后于85'C烘箱中烘烤10"20min。结果如图2所示，表明(泡cj'W"sp鹏j7〃ssp.)Tamyl2菌株产生淀粉酶。实施例2繊液特性实施例2鄉液中淀粉酶活性的测定酶活力测定方法为DNS测还原糖的方法进行淀粉酶活性测定(RickW，1974)。高温淀粉酶的水解活力单位定义为在一定鹏下，,中水解可溶性淀粉产生1Pg葡^^糖所需的酶量。蛋白i^浓度的测定采用LOWRY法进行测定(LOWRY.0H，1951)。①实施例2MIM中淀粉酶的皿酶活pH。配制0.1M^fM"Na2HP04缓冲液(pH3、4);0.1M醋酸缓冲液(pH5、6);0.1MTris-HC1缓冲液(pH7、8);0.1Mglycine-NaOH缓冲液(pH9、10)。分别加A^冬浓度为1%的可^^性淀粉。取不同pH的，缓冲液50u1，分别加入50u1发酵液，用，DNSt妹iff介酶在不同pH^f牛下的活性。结果如图3所示，表明该淀粉KS^酶活pH为5.②实施例2^^液中淀粉酶的皿反应，。取50ul繊发^^和50ul淀粉底物缓冲液，分别方妇IJ13。C、28°C、37°C、45°C、55°C、65°C、80°C、98。C温育30min，用，DNS^^iff介酶在不同^Jt^(牛下的活性。结果如图4所示，表明该^I反应温度为8(TC左右。权利要求1、一种短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Tamy12菌株，菌种保藏号CGMCCNo.2641，其具有产生高温淀粉酶的能力。2、权利要求1所述的Tamyl2菌株，其特征在于菌株菌落白色，表面干燥，边缘圆整；细胞为短杆状产芽孢，革兰氏阳性菌，生长pH范围是5.0-9.0，最适pH为7.5;》显度范围是38-7(TC,最适生长温度为55。C。3、一种从权利要求1短小芽孢杆菌(^3cW^/s/湖j7"s)Tamyl2菌株中获得的高温淀粉酶。4、权利要求3的从短小芽孢杆菌(泡ci""spi^7"s)Tamyl2菌株中获得的高温淀粉酶，其酶学性质为粗酶液可以将可溶性淀粉分解为葡萄糖、麦芽糖及3到6个葡萄糖基的寡糖，最适pH为5，反应温度为45-80°C。全文摘要本发明公开了一种短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)新菌株Tamy12，以及利用此菌株发酵得到的高温淀粉酶，及其制备方法。Tamy12菌株菌落为白色，表面干燥，边缘圆整；细胞为短杆状，革兰氏阳性菌，温度范围是38-70℃。Native-PAGE分析表明Tamy12发酵获得的粗酶液中含有淀粉酶，可以将可溶性淀粉分解为葡萄糖、麦芽糖及3到6个葡萄糖基的寡糖。本发明涉及的高温淀粉酶作用温度较高、具有较宽的pH适应范围，应用于食品酿造工业、环境保护、能源利用、医药工业等领域蕴藏一定的应用潜力。文档编号C12N9/28GK101608169SQ200910094649公开日2009年12月23日申请日期2009年6月25日优先权日2009年6月25日发明者井申荣,季秀玲,李秋鹏,林连兵,伟洪,熊学权,陆月情,波陈,魏云林申请人:昆明理工大学