专利名称：：急性毒性藻红外测试中联合作用的评价方法
技术领域：
：本发明涉及对急性毒性藻红外测试中联合作用的评价方法，属生态毒理学
技术领域：
。
背景技术：
：两种和两种以上化学污染物共同作用所产生的综合生物学效应称作联合作用。环境中，多种污染物往往同时存在，多种与单一化学污染物对生物的联合作用完全不同，因此，生态毒理学研究趋势之一是加强对污染综合效应和多组分复合污染的环境效应的研究(孔繁翔.2000.《环境生物学》[M].北京高等教育出版社:13,92-93)。但是，研究这两种效应需要联合作用的评价方法，以及确立毒物联合作用类型，尚无标准方法(孔繁翔，2000《环境生物学》[M].北京高等教育出版社:13，92-93)。目前，常用的方法有毒性单位法、混合毒性指数法、相似性参数法(董玉瑛，雷炳莉,张春宝.2006.SDS与取代芳烃多元混合体系联合毒性作用研究[J].环境学,27(8):1643-1646)，过筛实验法、统计学方法、直接描述综合分析法(孔繁翔，2000《环境生物学》[M].北京高等教育出版社:13，92-93)，相加指数法(修瑞琴，许永香，傅迎春.1994.水生毒理联合效应相加指数法[J].环境化学[J]，13(13):269-271,)，等效线图模型法(朱心强，黄幸纤.1993.两种农药联合毒性评价方法的比较.毒理学杂志[1]，7(1):60-61.)。但是，这些方法均不适合藻红外测试法中联合作用的评价，而且普遍存在数据处理及结果分析较繁琐、测试周期较长等不足。因此，需要建立适合藻红外测试法的简便、快速的联合作用评价方法。目前，国内已有藻红外测试环境重金属急性毒性(郭蔚华，苏海燕,张智,王斌，游先童.2008a.藻红外辐射测试环境重金属急性毒性[J].生态环境，17(2):520-523)、藻红外测试农药残留急性毒性(郭蔚华，王翔，张智，游先童,王斌.2008b.藻红外辐射测试环境农药残留急性毒性研究[J].农业环境科学学报，27(5):2039-2042)、急性毒性藻红外测试中敏感藻的确定方法(郭蔚华，丁燕燕，张智，王翔,苏海燕.2008c.急性毒性藻红外测试中敏感藻的确定方法[J].生态毒理学报,3(6):577-583)的研究，但是，用藻红外测试法进行联合作用的研究，国内外尚无报道
发明内容针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种针对两种或两种以上化学污染物联合作用进行分析的急性毒性藻红外测试中联合作用的评价方法。本发明的目的是这样实现的急性毒性藻红外测试中联合作用的评价方法，其特征在于，包括如下步骤-1)培养敏感藻液使其对数期的叶绿素a含量达到4.0mgI/1;2)准备测试药品，将其稀释并配制成待测药液；3)测试时，取510mL的对数期的叶绿素含量为4.0mg'L"的敏感藻液，加入到测试容器中，同时分试验组和对照组；待藻液温度稳定时，再滴加上述待测药液于试验组中，滴加与待测药液同体积的蒸馏水于对照组中，立即用红外测温仪测试藻液变化温度，计算相应温差；根据联合偏差系数法分析各种待测药品组合对实验藻的联合毒性作用，并作出评价；用联合作用系数e和总均偏差系数f构建联合偏差系数法；用f=0.06调整相加作用的9=1的理论值；评价时，用联合偏差系数9i大于、等于、小于1+0.06或1-0.06，评价联合作用类型；独立作用直接用测试温差和f分析；评价方法如下9i〉l+f，即0i〉1.06协同作用；1-f《0i《l+f，即0.94《0i《1.06相加作用；ei<l-f，即0;<0.94拮抗作用；<Te〈T广f'T入独立作用；其中，毒性效应最强药品产生的温差，Te—联合作用的温差，T入一相加作用的温差，f.T入一偏差温差；所述联合作用系数e的计算式为6=17(TA+TB+TC+)式中9一混合毒物引起敏感藻响应温差的联合作用系数；T—混合毒物引起敏感藻产生的绝对平均最大温差；TA、TB、TC----混合毒物中单一毒物引起敏感藻产生的绝对平均最大温差，其中各种毒物在混合毒物中的质量比为1/n，n为混合毒物中毒物种类数。相比现有技术，本发明具有如下优点1)混合药品与单一药品引起的敏感藻红外辐射变化不同，这种不同的红外辐射变化均可被便携式红外测温仪测试，测试方法简便。2)二元药品对敏感藻作用表现出协同、相加、拮抗和独立四种联合作用类型。联合偏差系数法评价二元药品对敏感藻的联合作用可行。3)藻红外测试法完成一次测试实验用时不到60min,远远低于用光密度、细胞数、叶绿素含量、细胞干重作为测试指标进行毒性实验的实验周期24h96h。具体实施例方式下面通过确定联合作用系数计算法、总均偏差系数，构建联合偏差系数法，再用实验药品和敏感藻进行温差偏差实验，求出总均偏差系数值；最后，为便于研究，用二元药品对敏感藻的联合作用进行验证实验，验证联合偏差系数法的可行性。一、材料与方法1.1试验材料供试藻种敏感藻是指在急性毒性藻红外测试中对毒物响应的温差大、时间快、种类多、剂量低的特殊藻类。用急性毒性藻红外测试中敏感藻的确定方法(郭蔚华等，2008c急性毒性藻红外测试中敏感藻的确定方法[J].生态毒理学报,3(6):577-583)得到的四种敏感藻作为实验藻种杀菌剂的敏感藻—水华鱼腥藻U""6"e朋,os-^w^),除草剂和杀虫剂的敏感藻一纤细裸藻(五"gfew"graa'fo)，有机药品的敏感藻羊角月牙藻(5We膨&"w啤r/cwro""附),重金属的敏感藻一短线脆杆藻(Frag//",/"v&她Aar)。供试药品重金属硫酸汞(HgS04)、硝酸铅[Pb(N03)2]、氯化钡(BaCl2.2H20)、氯化铬(CrCl36H20)。有机药品甲醛(CH20)、苯酚(C6H5OH)、磺胺(NH2C6H4S02NH2)、聚丙烯酰胺([CH2CHCONH2]n)。农药除草剂一百草枯(C12H14N2C12)、盖草能(CisHuClFsNOA)、草甘膦(C3H8N05P)，杀菌剂一三唑酮(C14H16C1N302)、井冈霉素(C20H35O13N)、克菌康(C19H3408N8)，杀虫剂一杀虫单(C5H12N06S2Na'H20)、灭扫利(C22H23N03)。本药品由西南大学农药研究室提供。实验仪器设备便携式红外测温仪(型号ST60，分辨率0.rC，重量320g)，LRH-250A生化培养箱，DR/4000U分光光度计，EBA21离心机，数码显微镜。1.2实验方法测试原理敏感藻的光合磷酸化和氧化磷酸化的能量代谢系统中ATP合成和水解受到毒物干扰时，引起的藻红外辐射变化可被红外测温仪测试(郭蔚华等，2008c急性毒性藻红外测试中敏感藻的确定方法[J].生态毒理学报，3(6):577-583)。测试环境室内，自然光照，20~28°C。藻种来源中科院武汉水生所提供，按其提供的配方、方法培养藻类。测试用藻量藻液叶绿素a含量4.0mg'1/1。药品稀释①温差偏差实验，药品配成500mg'L"和1000mg'L"两种测试药液；②联合作用实验，用两种1000mg，L"的单药测试液，按l:l体积比配制两种药品含量各为500mgL"的混合测试药液。测试药液用量测试时每个标准藻液中滴加配制药液0.05mL。测试藻生长期用对毒物最敏感的对数生长期的藻液作为测试藻液。测试组设计试验设试验组、对照组，每组3个重复。测试容器直径4cm、高3cm、厚0.2cm的透明绝热塑料容器。测试方法先预培养藻类，然后进行药品稀释，准备测试仪器等物品。待藻培养到对数生长后期时进行试验。测试时，在试验组和对照组的每一容器中，同时分别滴加含有测试用藻量的测试藻液5mL,待藻液温度稳定时用红外测温仪对准液面中部测温记录，然后试验组、对照组分别滴加稀释药液、蒸馏水各0.05mL,立即测温记录，以后每1.5min测1次，直到温度变化停止时。平均响应温差计算方法平均响应温差=(试验组最大响应温度之和一对照组平均温度之和)+31.3联合作用系数计算式的确定方法两种和两种以上化学污染物共同作用所产生的综合生物学效应称作联合作用，根据生物学效应的差异，联合作用通常分为4种类型(孔繁翔，2000，《环境生物学》[M].北京高等教育出版社:13,92-93):协同作用指两种或两种以上化学污染物同时或数分钟内对机体产生的生物学作用强度远远超过它们分别单独引起的生物学作用的总和。相加作用指两种或两种以上化学污染物混合所产生的生物学作用强度等于各种化学污染物分别产生的作用强度的总和。拮抗作用指两种或两种以上化学污染物同时或数分钟内对机体产生的生物学作用强度低于它们分别单独引起的生物学作用的总和。独立作用指两种或两种以上化学污染物对生物体所产生的生物学作用强度低于它们分别单独引起的生物学作用的总和，高于其中活性最强者。根据联合作用类型的定义，根据实验表现出的敏感藻响应定量毒物的半剂量与倍剂量的半、倍温差效应(表i)，确定并用联合作用系数e来评价联合作用联合作用系数e计算式为-6=T/(TA+TB+TC+)式中9—混合毒物引起敏感藻响应温差的联合作用系数；T一混合毒物引起敏感藻产生的绝对平均最大温差；TA、TB、TC----混合毒物中单一毒物引起敏感藻产生的绝对平均最大温差，其中各种毒物在混合毒物中的质量比为1/n，ri为混合毒物中毒物种类数。9>1为协同作用；0=1为相加作用；9<1为拮抗作用；独立作用可直接分析。表1敏感藻对药品半剂量、倍剂量响应温差的实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.4总均偏差系数的确定与测试方法实评中，实测温差有一定偏差，直接用联合作用系数e分析联合作用不理想，需用温差偏差系数值调整相加作用的e理论值(0=1)，为了找出其调整范围，需进行对相加作用分析的温差偏差实验，确定特定温差偏差系数和系数值。实验中，重金属、有机药品、农药各三种，根据敏感藻响应定量毒物的半剂量与倍剂量的半、倍温差效应，每种药品按i:i比例，一分为二，分单一和相加两种方式加药，测试计算敏感藻对半剂量和倍剂量药品的响应温差，通过平均温差偏差系数算式求出九种平均温差偏差系数，再对其平均得到总平均温差偏差系数(简称总均偏差系数)，f表示，用f值调整相加作用的9理论值(eo。平均温差偏差系数计算如下平均温差偏差系数绝对值=(相加作用理论温差_平均实测温差)+相加作用理论温差。1.5联合偏差系数法验证的实验方法为便于研究，用二元药品进行实验，验证联合偏差系数法的可行性。实验中，从16种实验药品中取出2种，分别测试敏感藻响应单一药品和混合药品的温度，并用平均响应温差算法换算其响应温差。二、结果与讨论将温差偏差实验的测试分析结果整理成表2;将验证实验中重金属对短线脆杆藻联合作用的实验结果整理成表3，有机药品对羊角月牙藻联合作用的实验结果整理成表4，农药对水华鱼腥藻、纤细裸藻联合作用的实验结果整理成表5。表2温差偏差实验测试分析结果有机药品敏感藻平均温差偏差系数农药敏感藻平均温差偏差系数重金属敏感藻平均温差偏差系数磺胺羊角月牙藻"0.11灭扫利纤细裸藻4,=0.12硫酸汞短线脆杆藻fw掘2苯酚&-2=0.03草甘膦f2-2=0.16氯化铬f3.2』.01甲苯f!.3-0.02盖草能f2>0.01硝酸铅f3—3=0.04偏差系数平均值0.06总均偏差系数f值0.062.1联合偏差系数法用联合作用系数0和总均偏差系数f构建联合偏差系数法，用f=0.06(表1)调整相加作用的0理论值(9-1)。评价时，用联合偏差系数8i大于、等于、小于1+0.06或1-0.06，评价联合作用类型。独立作用直接用测试温差和f分析。评价方法如下6i〉l+f，即6;>1.06协同作用l-f《6i《l+f，即0.94《6;《1.06相加作用ei<l-f，即0;<0.94拮抗作用<Te<TA-f.T,独立作用(T^毒性效应最强药品产生的温差，Tp—联合作用的温差，Ta—相加作用的温差，f.T入一偏差温差。)2.2联合偏差系数法的验证重金属的联合作用从表2可知，用联合偏差系数法分析4种重金属6种混合对短线脆杆藻的联合作用为，3次拮抗作用(氯化钡+硝酸铅，硝酸铅+硫酸汞，硝酸铅+硫酸汞)，2次独立作用(氯化钡+硫酸汞，硝酸铅+氯化铬)，l次相加作用(氯化钡+氯化铬)。有机毒物的联合作用从表3可知，用联合偏差系数法分析4种有机药品，6种混合对羊角月牙藻的联合作用为，2次协同作用(苯酚+磺胺，甲醛+聚丙烯酰胺)，3次独立作用(苯酚+聚丙烯酰胺，甲醛+磺胺，磺胺+聚丙烯酰胺)，l次拮抗作用(苯酚+甲醛)。表3重金属对短线脆杆藻联合作用的实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>农药的联合作用从表4可知，用联合偏差系数法分析8种农药12种混合对水华鱼腥藻、纤细裸藻的联合作用为，9次拮抗作用，3次独立作用。其中，对水华鱼腥藻引起联合作用的二元毒物是，盖草能+井岗霉素引起独立作用，其余5种二元毒物引起拮抗作用；对纤细裸藻引起联合作用的二元毒物是，草甘膦+杀虫单，百草枯+三唑酮引起独立作用，其余4种二元毒物引起拮抗作用。表4有机药品对羊角月牙藻联合作用的实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.3测试周期一组验证实验从藻液加药，测试，计算，到联合作用的评价，60min内即可完成。而用光密度、细胞数、叶绿素含量、细胞干重作为测试指标进行藻类急性毒性实验，需要24h96h(孔繁翔，2000)。通过以上分析可知1)两种药品与一种药品引起的敏感藻红外辐射变化不同，两种红外辐射变化均可被便携式红外测温仪测试，测试方法简便。2)验证实验结果二元药品对敏感藻作用表现出协同、相加、拮抗和独立4种联合作用类型。研究表明，联合偏差系数法评价二元药品对敏感藻的联合作用可行。3)在藻类急性毒性实验中，藻红外测试法完成一次测试实验用时不到60min，远远低于用光密度、细胞数、叶绿素含量、细胞干重测试指标进行毒性实验的实验周期24h96h。4)尽管联合偏差系数法所采用的联合偏差系数可能还不理想，尚需要开展更大规模的实验进行调整，但不影响急性毒性藻红外测试中联合作用评价方法的可行性。表5农药对水华鱼腥藻、纤细裸藻联合作用的实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本发明中，用敏感藻和重金属、有机药品和/或农药进行实验；首先确定联合作用系数0的计算式和总均偏差系数f，用其构建联合偏差系数法，再用实验得到的^0.06调整相加作用的e理论值(9=1)，用联合偏差系数0i大于、等于、小于1+0.06或1-0.06,评价联合作用类型；最后，进行二元药品对敏感藻联合作用的验证实验，验证联合偏差系数法的可行性。验证结果4种重金属6种混合对短线脆杆藻的联合作用为，3次拮抗作用，2次独立作用，l次相加作用；4种有机药品6种混合对羊角月牙藻的联合作用为，2次协同作用，3次独立作用，l次拮抗作用；8种农药12种混合对水华鱼腥藻、纤细裸藻的联合作用为，9次拮抗作用，3次独立作用；一组验证实验从藻液加药，测试，计算，到评价,60min内完成，而用光密度、细胞数、叶绿素含量、细胞干重作为测试指标进行藻类急性毒性实验，需要24h96h。对验证结果分析可知，用所构建的联合偏差系数法评价二元药品对敏感藻的联合作用，可行、快速、简便。权利要求1、急性毒性藻红外测试中联合作用的评价方法，其特征在于，包括如下步骤1)培养敏感藻液使其对数期的叶绿素a含量达到4.0mg·L-1；2)准备测试药品，将其稀释并配制成待测药液；3)测试时，取5～10mL的对数期的叶绿素含量为4.0mg·L-1的敏感藻液，加入到测试容器中，同时分试验组和对照组；待藻液温度稳定时，再滴加上述待测药液于试验组中，滴加与待测药液同体积的蒸馏水于对照组中，立即用红外测温仪测试藻液变化温度，计算相应温差；根据联合偏差系数法分析各种待测药品组合对实验藻的联合毒性作用，并作出评价；用联合作用系数θ和总均偏差系数f构建联合偏差系数法；用f＝0.06调整相加作用的θ＝1的理论值；评价时，用联合偏差系数θi大于、等于、小于1+0.06或1-0.06，评价联合作用类型；独立作用直接用测试温差和f分析；评价方法如下θi＞1+f，即θi＞1.06协同作用；1-f≤θi≤1+f，即0.94≤θi≤1.06相加作用；θi＜1-f，即θi＜0.94拮抗作用；Tφ＜Tβ＜Tλ-f·Tλ独立作用；其中，Tφ毒性效应最强药品产生的温差，Tβ-联合作用的温差，Tλ-相加作用的温差，f·Tλ-偏差温差；所述联合作用系数θ的计算式为θ＝T/(TA+TB+TC+…)式中θ-混合毒物引起敏感藻响应温差的联合作用系数；T-混合毒物引起敏感藻产生的绝对平均最大温差；TA、TB、TC…-混合毒物中单一毒物引起敏感藻产生的绝对平均最大温差，其中各种毒物在混合毒物中的质量比为1/n，n为混合毒物中毒物种类数。2、根据权利要求l所述的急性毒性藻红外测试中联合作用的评价方法，其特征在于，所述步骤3)测试时，在试验组和对照组的每一容器中，同时分别滴加含有测试用藻量的敏感藻液5mL，待藻液温度稳定时用红外测温仪对准液面中部测温记录，然后试验组、对照组分别滴加稀释药液、蒸馏水各0.05mL,立即测温记录，以后每1.5min测l次，直到温度变化停时止；平均响应温差计算方法平均响应温差=(试验组最大响应温度之和一对照组平均温度之和)+3。3、根据权利要求l所述的急性毒性藻红外测试中联合作用的评价方法，其特征在于，所述测试药品为重金属、有机药品或农药。全文摘要急性毒性藻红外测试中联合作用的评价方法，其特征在于，用联合作用系数θ和总均偏差系数f构建联合偏差系数法(联合偏差系数用θi表示)，用f＝0.06调整相加作用的θ理论值(θ＝1)。根据联合偏差系数θi的变化进行评价，其评价方法如下θi＞1+f，即θi＞1.06为协同作用；1-f≤θi≤1+f，即0.94≤θi≤1.06为相加作用；θi＜1-f，即θi＜0.94为拮抗作用；Tφ＜Tβ＜Tλ-f·Tλ为独立作用(Tφ毒性效应最强药品产生的温差，Tβ-联合作用的温差，Tλ-相加作用的温差，f·Tλ-偏差温差)。本发明测试方法简便；二元药品对敏感藻作用表现出协同、相加、拮抗和独立4种联合作用类型；藻红外测试法完成一次测试实验用时不到60min，远远低于用光密度、细胞数、叶绿素含量、细胞干重作为测试指标进行毒性实验的实验周期24h～96h。文档编号C12Q1/02GK101613737SQ20091010446公开日2009年12月30日申请日期2009年7月28日优先权日2009年7月28日发明者伟周,健周,智张,艳林,蒋绍阶,郭蔚华,春阳申请人:重庆大学