专利名称：改良的dna银氨染色法以及检测dna的方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体而言，本发明涉及在聚丙烯酰胺凝胶上对 DNA染色的方法，其在检测灵敏性和操作方便程度上带来了综合性能的改善。另外，本 发明还涉及检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。
背景技术：
当前，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离DNA并使DNA条带显色(可视化)，已经 成为生物检测中最常用的方法之一了。其中，使在聚丙烯酰胺凝胶上的DNA条可视化可 以采用荧光染料、可视有机染料和银等。可视有机染料，如亚甲蓝[1]、亮甲酚蓝[2]、 结晶紫[3]、和尼罗河蓝[4，5]等，其灵敏性低而且操作耗时。荧光染料，如溴化乙锭 (EB)、SYBRgreen^和SYBR gold，其能够插入DNA链中，因而检测效果不错，但是其 需要配备专门的荧光检测仪器，而且会对实验操作人员产生致突变效果，因而极大地限 制了它们的使用[6-8]。而银染技术已经在广泛应用于对聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离的蛋 白质的检测[16]，也有报道银染[9-11]能用于核酸[17]和脂多糖[18]的染色。银染技术技术根据用含银离子的溶液浸渗中所用的试剂而分成两大类。一类被 称为银氨染色法，其使用银-氨溶液来浸渗凝胶，并用含甲醛的酸性溶液来显色，但是 其灵敏性低而且操作过程费时[12]；另一类用酸性银离子溶液染色，其中凝胶浸渗在pH 为弱酸性的硝酸银中，然后在碱性条件下用甲醛还原，然而其在进行DNA检测时，要么 染色灵敏度高但操作过程比较复杂[19]，要么操作过程较简单但灵敏度不高[20-22]。为此，本发明人经过长期实践研究，令人惊讶地在银氨染色法的基础上发明 了一种改良的DNA染色法，其省略了固定和敏化的步骤从而降低操作繁琐程度并减 少操作耗时，而且能提高检测灵敏性，仅仅在约40分钟的操作时间内就能检测到皮克 (picogram)级的DNA条带(可达1.5pg)。另夕卜，本发明人还发明了基于改良的DNA染 色法的检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。
发明内容
本发明的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色的方法，其在检测灵敏 性和操作方便程度上带来了综合性能的改善。另外，本发明的目的还在于提供检测DNA 的方法以及用于这些方法的试剂盒等。具体而言，在第一方面，本发明的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染 色的方法，其为银氨染色法，其特征在于，所述方法不包括固定和敏化的步骤。本发明 第一方面的方法通常在聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA后使用，对聚丙烯酰胺凝胶上的 DNA条带进行染色，尽管不优选，但是该方法也可以在用其他方式使DNA包裹在聚丙 烯酰胺凝胶中之后使用。在本文中，银氨染色法本身为现有技术[12]，其依次包括洗涤 步骤、敏化步骤、洗涤步骤、浸渗步骤、洗涤步骤、显色步骤和终止显色反应步骤。其 中，浸渗步骤是用含银离子和氨的碱性溶液浸泡聚丙烯酰胺凝胶。由于本发明相对于现 有技术(包括酸性银离子溶液染色法等，其中有固定步骤)，省略了固定和敏化的步骤，因而大大缩短了操作时间，简化了操作步骤，也避免使用了在固定和敏化步骤中所需的 戊二醛、苯磺酸等对操作人员有害的试剂。优选在本发明的第一方面，所述方法依次包 括第一次洗涤步骤、浸渗步骤、第二次洗涤步骤、显色步骤和终止显色反应步骤。这 样，该方法在达到上述优点后还保留了现有银氨染色法的检测灵敏度。在本文中，“依次”指的是所针对的步骤按其所出现的顺序执行，不能与其他 步骤交换执行的顺序。优选在本发明的第一方面，所述方法依次由第一次洗涤步骤、浸 渗步骤、第二次洗涤步骤、显色步骤和终止显色反应步骤组成。在本文中，“第一次”与“第二次”用于区别洗涤步骤在操作流程上的次序， 并不构成对洗涤步骤本身执行过程的限制。在本文中，“洗涤”指的是用溶剂清洗聚 丙烯酰胺凝胶，用以洗去上一步骤残留在聚丙烯酰胺凝胶上的试剂。其中，优选溶剂是 水、生理盐水或缓冲液，如Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液等，最优选是去离子水。优选 在本发明的第一方面，所述方法中第一次洗涤步骤是用水洗涤聚丙烯酰胺凝胶。本发明 人研究发现，第一次洗涤对于最终染色效果有显著的提升，是必须的，但是洗涤时间可 以不必过长。因此优选其中，洗涤时间大于等于3 分钟，更优选为5-30分钟，最优选为 10分钟。另外也优选其中，洗涤次数为一次。其中这样最优选的方式大大节约了操作时 间。在本文中，“浸渗”指的是用含银离子和氨的碱性溶液浸泡聚丙烯酰胺凝胶， 用以使银离子渗入聚丙烯酰胺凝胶中并结合到凝胶中的DNA上。其中，碱优选是强 碱，如氢氧化钠或氢氧化钾。优选在本发明的第一方面，所述方法中浸渗步骤是用含硝 酸银、氢氧化钠和氨的溶液浸渗聚丙烯酰胺凝胶。本发明人研究发现，浸渗的时间以及 溶液中各组分的含量对于最终染色效果有显著的影响。因此为了进一步提高染色效果， 提高检测灵敏度并节约操作时间，优选浸渗时间为5-60分钟，更优选为8-30分钟，最 优选为10分钟；优选硝酸银的浓度为0.05%-0.4%，更优选为0.1%-0.3%，最优选为 0.2% ；由于经研究发现，溶液的pH显著能够显著影响银离子扩散入凝胶中，pH值越 大，扩散速度越快，而溶液的pH基本依赖于氢氧化钠的浓度，因此优选氢氧化钠的浓度 为0.2%-0.5%，更优选为0.3%-0.45%，最优选为0.4%，其中氢氧化钠可以等同于能 产生相同pH的其它强碱；和/或，由于经研究发现，溶液的氨能溶解溶液中产生的氢氧 化银，避免沉淀，因此优选氨的浓度为0.6%-0.9%，更优选为0.65%-0.8%，最优选为 0.7%。另外，在本文中如未特别指出，所述“溶液”均为水溶液，即溶剂为水，优选 明示出其中所含的溶质为所述溶液中的全部溶质；也优选对于液体溶质来说，其百分比 浓度指的是体积百分比浓度，而对于固体溶质来说，其百分比浓度指的是质量百分比浓 度。优选在本发明的第一方面，所述方法中第二次洗涤步骤是用水洗涤聚丙烯酰胺 凝胶。其中，优选洗涤时间为1-5分钟，最优选洗涤时间为2分钟；也优选洗涤次数为 一次；，也优选其中的水是去离子水。在本文中，“显色”指的是用含还原剂的酸性溶液浸泡聚丙烯酰胺凝胶，用 以使渗入聚丙烯酰胺凝胶中DNA上的银离子还原成银，从而显现出可观察的颜色。其 中，还原剂通常是甲醛，而酸为弱酸，优选是柠檬酸。优选在本发明的第一方面，所 述方法中显色步骤是用含柠檬酸和甲醛的溶液浸聚丙烯酰胺凝胶。本发明人研究发现，溶液中各组分的含量对于最终染色效果有显著的影响，尤其是甲醛等还原剂的还 原作用(还原反应的速度)受由酸决定的溶液pH影响。因此，优选柠檬酸的浓度为 0.0025% -0.0125%,更优选为0.005%-0.0125%，最优选为0.01%，其中柠檬酸可以等 同于能产生相同pH的其它弱酸；和/或，甲醛的浓度分别为0.025%-0.1%，更优选为 0.04% -0.06%,最优选为0.05%。显色的时间由颜色显现的时间所决定，优选为5-7分钟。在本文中，“终止显色反应”指的是使聚丙烯酰胺凝胶浸泡于显色反应终止溶 液中，用以终止前述的显色。通常，显色反应终止溶液为含乙酸的水溶液。优选在本发 明的第一方面，所述方法中终止显色反应步骤是用乙酸溶液浸聚丙烯酰胺凝胶。其中， 优选乙酸溶液为-8%的乙酸溶液，最优选为5%的乙酸溶液；优选终止显色反应步骤 中浸的时间为1-30分钟，优选为1.5-10分钟，最优选为2分钟。在第二方面，本发明的目的在于提供用于本发明第一方面所述方法的试剂盒， 其包括分装的浸渗溶液、显色溶液和显色反应终止溶液，其中浸渗溶液是含银离子和氨 的碱性溶液，显色溶液是含还原剂的酸性溶液，显色反应终止溶液是含乙酸的水溶液。 优选所述试剂盒包括分装的含硝酸银、氢氧化钠和氨的浸渗溶液、含柠檬酸和甲醛的显 色溶液、和乙酸溶液。更优选所述试剂盒中各溶液中溶质的含量如本发明第一方面所优 选的那样。尽管不优选，但是所述试剂盒还可以包括分装的水，如去离子水。在本文中，试剂盒具有本领域技术人员所能理解的含义，在本文中，其包括分 开的容器，分别包装(即，分装)不同的溶液。这样，不同的溶液之间不会发生混合。 其中，容器是任何能够保存其所储存的溶液的容器，如玻璃瓶、塑料罐等，优选是能够 长期保存其所储存的溶液的容器。另外，优选本发明第二方面的试剂盒还包括记载有本 发明第一方面所述方法的说明书。说明书可以是独立的，如纸质说明书，其被放入试剂 盒中；说明书也可以是直接印刷在试剂盒上的，如可以印刷在试剂盒中的一个或多个容 器上。在第三方面，本发明的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝胶上检测DNA的方法，其 包括在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后进行本发明第一方面所述的方法。聚丙烯酰胺 凝胶电泳是本领域常规的技术，其方法步骤及使用的试剂、设备可参见《分子克隆实验 指南》(科学出版社，2002)等书籍或实验手册，也有许多已经商品化了。本发明人经 过实践研究发现，尽管DNA在不同厚度(如，0.75、1.0、或1.5mm)的聚丙烯酰胺凝胶 都能分离，并且都能用本发明第一方面所述的方法染色，但是1.5mm厚的聚丙烯酰胺凝 胶已经开始不能得到DNA条带和背景之间的很好的对比度，因而降低了检测灵敏度； 而0.75和1.0mm厚的聚丙烯酰胺凝胶的表现都良好。因此，优选在本发明的第三方面 的方法中，所述聚丙烯酰胺凝胶的厚度为0.5-1.5mm，更优选为0.6-1.3mm，最优选为 0.75-1.0mm,如 0.75mm 或 1.0mm。在第四方面，本发明的目的在于提供用于本发明第三方面所述方法的试剂盒， 其包括分装的聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂和本发明第二方面的试剂盒中所包括的溶剂。 艮口，所述试剂盒包括分装的聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂、浸渗溶液、显色溶液和显色反应 终止溶液，其中浸渗溶液是含银离子和氨的碱性溶液，显色溶液是含还原剂的酸性溶 液，显色反应终止溶液是含乙酸的水溶液。聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂是本领域技术人员所熟知的，其可以通过商业渠道容易地购买。优选所述试剂盒包括分装的聚丙烯酰胺凝 胶电泳试剂、含硝酸银、氢氧化钠和氨的浸渗溶液、含柠檬酸和甲醛的显色溶液、和乙 酸溶液。更优选所述试剂盒中浸渗溶液、显色溶液、和/或乙酸溶液中溶质的含量如本 发明第一方面所优选的那样。尽管不优选，但是所述试剂盒还可以包括分装的水，如去 离子水。另外，优选本发明第四方面的试剂盒还包括记载有本发明第三方面所述方法的 说明书。说明书可以是独立的，如纸质说明书，其被放入试剂盒中；说明书也可以是直 接印刷在试剂盒上的，如可以印刷在试剂盒中的一个或多个容器上。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，尤其是权利要求书和说明书中位于括 号内的附图标记仅仅是为了方便阅读时的理解，并不构成对本发明范围的限制。显然本 领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修 正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这 些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像 它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。
以下附图中的凝胶照片中，OX174DNA/HaeIII分子量标记每个条带的上样 量均为泳道1，800pg ；泳道2，400pg ；泳道3，200pg ；泳道4，IOOpg ；泳道5， 50pg ；泳道 6，25pg ；泳道 7，12.5pg ；泳道 8，6.2pg ；泳道 9，3.Ipg ；泳道 10， 1.5pg。图1显示了电泳后用水洗涤的时间长短不同所得的对染色的染色照片，其中， (A) Omin. (B) IOmin. (C) 30min. (D)洗涤过夜。图2显示了本发明改良的DNA银氨染色法与其他3种比较例的方法的染色 照片，其中，(A)本发明改良的DNA银氨染色法，(B)现有的银氨染色法，(C)GE Healthcare的商品化的银氨染色法，(D)现有的酸性银离子溶液染色法。图3显示了显示了对2中各凝胶泳道2的扫描图谱的强度比较(通过软件Multi Gauge software of Science Lab 2006生成)，各图中的a曲线代表的是本发明改良的DNA银 氨染色法所得的强度扫描谱，b曲线代表的是现有的银氨染色法所得的强度扫描谱，c曲 线代表的是GE Healthcare的商品化的银氨染色法所得的强度扫描谱，d曲线代表的是现有 的酸性银离子溶液染色法所得的强度扫描谱，其中图A为a曲线与b曲线的比较图，图B 为a曲线与c曲线的比较图，图C为a曲线与d曲线的比较图。
具体实施例方式以下通过具体的实施例进行说明，其中未特别详细说明的材料、步骤均为本领 域技术人员所熟知的，如可参见《分子克隆实验指南》(科学出版社，2002)等书籍或实
验手册。1，实验材料丙烯酰胺、甲基双丙烯酰胺(Bis)、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵 (APS)、Tris> 和硼酸购自 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St.Louis，MO,美国)。ΦΧ174DNA/Haelll 分子量标记(Cat # G1761)购自 Promega Corporation (Madison, WI,美国)。 DNA银染试剂盒(Cat #70-5006-88)购自GE Healthcare (Uppsala,瑞典)。其他化学产物
均通过市售渠道购买。 2，电泳和图像分析根据常规的聚丙烯酰胺电泳法进行，简要过程如下用TBE缓冲液 (89mM TB, 2mM EDTA, pH 8.3)溶解丙烯酰胺并聚合成8 %聚丙烯酰胺凝胶 (80mmX IOOmmX0.75mm),其中，丙烯酰胺与 Bis 的用量比为 29 1。 ΦXl74 DNA/ HaeIII 分子量标记用 Tris-EDTA (TE)缓冲液(IOmM EDTA, IOOmM Tris-Cl, pH 8.0) 稀释成各个浓度并上样到凝胶的各个泳道上使得每个泳道的ΦΧ174 DNA/Haelll分 子量标记的上样量分别为 800，400，200，100，50，25，12.5，6.2，3.1 和 1.5pg。用 Miniprotean III dual slab cells (BioRad, Hercules, CA,美国)禾Π PAC 300 (BioRad)以 20mA/凝胶的参数进行电泳。电泳完成后的凝胶分别用以下染色法进行染色并观察显色 结果。利用扫描仪(EpsonPerfection V700 Photo，美国)定量观察DNA条带的显色结果， 并用软件 Multi Gauge software of Science Lab 2006 (FUJIFILM Corporation,日本)来计算 机分析图象。3，本发明改良的DNA银氨染色法的实施例电泳后，使用多个凝胶进行以下实验条件变化的一系列实验凝胶在IOOmL去 离子水中洗涤，洗涤时间分别为O分钟(不洗涤)、10分钟、30分钟和洗涤过夜。然 后，凝胶在50mL含硝酸银、氢氧化钠和氨的溶液中分别浸渗5至60分钟，其中硝酸 银的浓度分别为0.05% -0.4%,氢氧化钠的浓度分别为0.2% -0.5%,氨的浓度分别为 0.6%-0.9%。然后取出凝胶，在IOOmL去离子水中洗涤2分钟。然后取出凝胶，浸入 50mL含柠檬酸和甲醛的溶液显色，其中柠檬酸的浓度分别为0.0025%-0.0125%，甲醛 的浓度分别为0.025%-0.1%。待颜色显现并稳定后(需要5-7分钟)取出凝胶并浸入 50mL5%乙酸(HAc)溶液终止显色反应。这一系列实验的结果比较如下(1)电泳后洗涤时间对染色的影响电泳中的物质，如Tris、EDTA、硼酸等，可能会干扰银离子与DNA形成复合 物，使得背景相对DNA条带过浓。因此，不同的洗涤时间会对最终的显色效果有着不同 的影响。通过结果发现，如图1所示，凝胶在去离子水中洗涤10分钟已经足以能够产生 良好的显色结果，长的洗涤时间不能显著提升显色效果，而不洗涤则使检测的灵敏度大 为降低。(2)浸渗溶液中各组分含量对染色的影响浸渗溶液中以0.05% -0.4%硝酸银的浓度分别进行浸渗，综合检测灵敏度、图 像对比度以及背景的清晰程度，发现0.2%的硝酸银浓度是最佳的。更高浓度的硝酸银将 导致背景更浓从而降低对比度，而更低浓度的硝酸银将导致灵敏度降低。在含0.2%硝酸银的浸渗溶液中以0.2% -0.5%氢氧化钠的浓度分别进行浸渗10 分钟，发现0.4%的氢氧化钠浓度是最佳的。更低浓度的氢氧化钠将导致灵敏度降低，而 更高浓度的氢氧化钠将增加对背景的染色深度并使凝胶边缘产生染色条带(edge-artefacts stain) ο
在含0.2%硝酸银和0.4%氢氧化钠的浸渗溶液中以0.6% _0.9%氨的浓度分别进 行浸渗，发现0.7%的氨浓度是最佳的。更低浓度的氨将不能完全溶解产生的氢氧化银， 造成氢氧化银颗粒沉淀而造成浪费，而更高浓度的氨将过多消耗还原步骤中的甲醛从而 造成还原效率低和灵敏度低。(3)浸渗时间对染色的影响浸渗时间分别为5至60分钟，结果发现DNA条带的显色强度在浸渗10分钟的 情况下就能够达到最大强度，再延长浸渗时间并没有改变结果，而少于10分钟则不足以 达到最大的强度从而无法达到最大的灵敏度。(4)显色溶液中各组分含量对染色的影响显色溶液中分别以0.0025% -0.0125%的柠檬酸浓度以及0.025% -0.1%的甲醛 浓度进行显色，综合考虑还原速度、背景深度和灵敏度，发现0.01%的柠檬酸浓度和 0.05%的甲醛浓度是最佳的。更低浓度的柠檬酸将 造成显色时间短而不容易控制，背景 颜色深；更高浓度的柠檬酸将造成显色速度慢而灵敏度降低。4，比较例1 现有的银氨染色法根据Fnmk等[12]的论文进行染色。基本过程如下电泳后凝胶用IOOmL去 离子水洗涤3次，每次20分钟，然后浸入IOOmL 12%戊二醛溶液敏化30分钟，接着用 IOOmL去离子水洗涤2次，然后浸在去离子水中1小时。此后，用含IOOmL含0.4%硝 酸银、0.2%氢氧化钠和氨的溶液浸渗30分钟，然后用IOOmL去离子水洗涤3次，每 次10分钟。最后，凝胶在50mL含0.005%柠檬酸和0.05%甲醛的溶液中显色。待颜色 显现并稳定后(需要5分钟)取出凝胶并浸入50mL5%乙酸(HAc)溶液终止显色反应。5，比较例2 GEHealthcare的商品化的银氨染色法根据GE Healthcare的DNA银染试剂盒(Cat # 70-5006-88)的厂商说明书进行， 基本过程如下电泳后凝胶浸入125mL含24%乙醇和0.6%苯磺酸(BSA)的溶液中固 定30分钟，然后在125mL含0.2%硝酸银和0.07% BSA的溶液中浸渗30分钟，然后 在125mL去离子水中洗涤1分钟。然后凝胶浸入125mL含2.5%碳酸钠、0.1%甲醛和 0.002%硫代硫酸钠的溶液中显色6分钟。然后，凝胶浸入含l%HAc、5%乙酸钠和10% 甘油的溶液中终止显色反应。6，比较例3 现有的酸性银离子溶液染色法根据Bnmt等[23]的论文进行染色。基本过程如下电泳后凝胶在IOOmL的5% HAc溶液中固定10分钟，然后在IOOmL去离子水中洗涤3次，每次2分钟。此后，将 凝胶浸渗在IOOmL含0.1 %硝酸银的溶液中20分钟，然后用IOOmL去离子水冲洗5_10秒 以去除凝胶表面的硝酸银溶液。然后，将凝胶浸入预冷(8°C)的含3%碳酸钠，0.0002% 硫代硫酸钠和0.51 %甲醛的溶液中显色10分钟。最后，浸在预冷(8°C )的7.5% HAc溶 液中5-10分钟以终止显色反应。7，结果比较以上4种方法的过程比较如表1所示，用本发明改良的DNA银氨染色法省略了 固定和敏化的步骤，其不但错作步骤简单，而且能够在约35分钟的时间内完成，远远小 于其他方法。本发明改良的DNA银氨染色法能够显示出低至1.5pg的DNA条带，在灵 敏度上优于GE Healthcare的商品化的银氨染色法和现有的银氨染色法，后两者只能分别显示出20和IOOpg的DNA条带(参见图2和图3A、3B)。对于分子量标记中较长链的DNA(603 1353bp)来说，本发明改良的DNA银氨染色法和现有的酸性银离子溶液染色 法所显示出的图象强度相当；而对于链较短的DNA(<310bp)来说，本发明改良的DNA 银氨染色法比现有的酸性银离子溶液染色法灵敏度更高(参见参见图2和图3C)。另外，从成本上来比较，GE Healthcare的商品化的银氨染色法的试剂盒需要花 费16美元，而本发明改良的DNA银氨染色法中试剂花费仅6美元，而且如果大规模采购 可以进一步降低成本。从安全性上来考量，本发明改良的DNA银氨染色法避免使用了戊二醛和BSA这 两种有毒物质，对操作人员的健康威胁小得多，更适于在实验室推广。表1.4种方法的过程比较表
权利要求
1.在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色的方法，其为银氨染色法，其特征在于，所述方 法不包括固定和敏化的步骤。
2.权利要求1所述的方法，其依次包括第一次洗涤步骤、浸渗步骤、第二次洗涤步 骤、显色步骤和终止显色反应步骤。
3.权利要求2所述的方法，其中第一次洗涤步骤是用水洗涤聚丙烯酰胺凝胶，优选洗 涤时间大于等于3分钟，更优选为5-30分钟，最优选为10分钟。
4.权利要求2所述的方法，其中浸渗步骤是用含硝酸银、氢氧化钠和氨的溶液浸渗 聚丙烯酰胺凝胶，优选浸渗时间为5-60分钟，更优选为8-30分钟，最优选为10分钟； 优选硝酸银的浓度为0.05%-0.4%，更优选为0.1%-0.3%，最优选为0.2%;优选氢氧 化钠的浓度为0.2%-0.5%，更优选为0.3%-0.45%，最优选为 0.4% ；优选氨的浓度为 0.6% -0.9%,更优选为 0.65%-0.8%，最优选为 0.7%。
5.权利要求2所述的方法，其中第二次洗涤步骤是用水洗涤聚丙烯酰胺凝胶。
6.权利要求2所述的方法，其中显色步骤是用含柠檬酸和甲醛的溶液浸聚丙烯酰胺 凝胶，优选柠檬酸的浓度为0.0025%-0.0125%，更优选为0.005%-0.0125%，最优选为 0.01% ；甲醛的浓度分别为0.025%-0.1%，更优选为0.04%-0.06%，最优选为0.05%。
7.权利要求2所述的方法，其中终止显色反应步骤是用乙酸溶液浸聚丙烯酰胺凝胶。
8.用于权利要求1-7之任一所述方法的试剂盒，其包括分装的含硝酸银、氢氧化钠和 氨的浸渗溶液、含柠檬酸和甲醛的显色溶液、和乙酸溶液。
9.在聚丙烯酰胺凝胶上检测DNA的方法，其包括在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然 后进行权利要求1-7之任一所述方法。
10.用于权利要求9所述方法的试剂盒，其包括分装的聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂、含 硝酸银、氢氧化钠和氨的浸渗溶液、含柠檬酸和甲醛的显色溶液、和乙酸溶液。
全文摘要
本发明涉及在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色的方法，其为银氨染色法，依次包括第一次洗涤步骤、浸渗步骤、第二次洗涤步骤、显色步骤和终止显色反应步骤，而不包括固定和敏化的步骤。另外，本发明还涉及在聚丙烯酰胺凝胶上检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102021231SQ20091017088
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月12日 优先权日2009年9月12日
发明者丛维涛, 何宏章, 初彦辉, 张弛, 李校堃, 金利泰, 金艳, 马吉胜 申请人:温州医学院