专利名称：4种侵染番茄的双生病毒的rflp检测方法
技术领域：
本发明涉及区分4种侵染番茄的双生病毒的RFLP检测方法。
背景技术：
近几年，双生病毒对我国番茄的危害十分严重，双生病毒种类很多，目前在我国番 茄上流行的双生病毒种类有番茄黄化曲叶病毒(Tomatc^ellow Leaf Curl Virus,TYLCV), 中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato YellowLeaf Curl China Virus，TYLCCNV)、中国番木瓜曲 叶病毒(Papaya Leaf CurlChina Virus，PaLCuCNV)、台湾番茄曲叶病毒(Tomato Leaf Curl TaiwanVirus,TYLCTWV)等。病毒的检测是进行病害监测、流行学研究以及防治研究的重要 内容。双生病毒在番茄上产生的症状非常类似，从而使得通过症状来进行不同双生病毒种 类的鉴定非常困难。目前对双生病毒种的鉴定主要通过利用双生病毒DNA序列的保守序列 设计简并引物进行扩增，然后进行序列测定，最后通过序列的比对来进行种类的鉴定。这使 得鉴定工作费时费力而且很难鉴定复合侵染的现象。本发明的目的在于建立一种仅通过常规PCR及酶切反应便可将我国发生面积较 广的4种双生病毒鉴定区分的方法，旨在节省鉴定时间、降低实验成本，为鉴定工作提供方 便。本发明的方法，包括如下步骤(1)将PCR体系按照如下的程序进行PCR反应94°C变性2分钟，然后94°C变性45秒、52 °C退火45秒、72 °C延伸2分30秒，35个 循环，最后72°C延伸10分钟，获得PCR产物，4°C保存；所说的PCR体系为水溶液，组分和含量为模板 DNA20ng/L混合引物0.2umol/LIOXbuffer 2ul/LMg2+3. 5mmol/LdNTPs250umol/Lkpl 酶0.2uL/L所说的模板DNA指的是番茄DNA，制备方法如下1、取番茄嫩叶放入研钵中，加入液氮，研磨成粉末状，取40mg装入2mL的圆头离心管中。2、加入700ul CTAB提取液，剧烈摇晃，使CTAB提取液与样品充分混合均勻。(IOOmmol/L Tris-HCl(pH 8. 0)，20mmol/L EDTA,1. 4mol/L NaCl,3 % CTAB,2 % PVP,2% β-巯基乙醇)3、65°〇水浴111。4、置于4°C冰箱或室温冷却至15°C以下。5、加入700 μ 1 24 1氯仿/异戊醇，上下缓慢颠倒混勻，抽提15min至溶液呈乳浊状，保证样品和氯仿充分混合。6、12000rpm 离心 lOmin。7、取上清液于1. 5ml离心管中，加入等体积的预冷_20°C的异丙醇，轻轻上下颠倒 混勻。8、_20°C冰箱静置3h以上。9、12000rpm离心lOmin，弃上清液。用70%乙醇洗涤沉淀2次。10、吹干DNA，让乙醇挥发干净。11、加 200uL TE 65°C水浴溶解 DNA。(TE :10mmol/L Tris-Hcl 禾口 lmmol/LEDTA, PH = 8)所说的混合引物是由以下几种引物混合起来的引物混合物ITLCV引物序列SH2F 5' -gggatccacttctaaatgaa-3，SH2R 5' -tggatcccacatattgcaag-3‘ITLCCNV 引物序列YlOF :5，-gggatcctctgctcaacgag-3，YlOR 5' -aggatcccacatgcttaacg-3‘PaLCuCNV 引物序列PaF :5，-gggatcctttactgaacgag-3，PaR :5，_aggatcccacatgtttggcg_3，ITLCTWV 引物序列ZJ16F 5' -gggatccacttttaaatgat-3，ZJ16R 5' -tggatcccacattttaccga-3，IOXbuffer 为一种 PCR 反应缓冲液，为 10 50mmol/LTris-Hcl (PH8. 3 8. 8)， 可采用上海生工公司的产品；Mg2+来源于氯化镁的化合物；dNTPs为一种PCR反应必须物，其化学名称为三磷酸脱氧核苷酸，可采用上海生工 公司的产品；SspI酶可采用上海生工公司的产品；(2)酶切产物的制备将酶切体系在37°C保温1. 5h，获得及酶切产物；所说的酶切体系为水溶液，组分和含量为酶切体系为PCR 产物 0. 35uL/L,SspI 酶 0. 05uL/L,BufferO. luL/L,(3)配置2. 5%的琼脂糖凝胶，加入1 μ L ΕΒ(0. 5μ g/ml)倒入胶槽中，插入梳子， 待胶凝固后检测。分别取IOuL PCR产物和IOuL酶切产物进行检测，终结果用EB染色，采 用Bio-RAD凝胶成像系统拍照；所说的EB的化学名称为溴化乙锭，可采用市售产品，如上海生工公司的产品，染
4色方法，为现有技术，如Williamson，V. Μ.文献报道的方法；Bio-RAD凝胶成像系统为一种通用的系统，可采用Bio-RAD公司的产品；(4)结果分析TYLCV单独侵染的番茄植株可产生66bp、162bp、2561bp的片段，附 图可显示2500bp左右的一条带。TYLCCNV单独侵染的番茄植株可产生119bp、141bp、401bp、 532bp、1552bp的片段，附图
可显示1500bp左右一条带及500bp左右的两条带。PaLCuCNV单 独侵染的番茄植株可产生145bp、10Mbp、1558bp的片段，附图可显示1500bp和IOOObp左 右各一条带。TYLCTWV单独侵染的番茄植株可产生146J602bp的片段，附图可显示^OObp 左右的一条带。TYLCV与TYLCCNV复合侵染的番茄可产生66bp、119bp、141bp、162bp、401bp、 532bp、1552bp、2561bp的片段，附图可显示2500bp、1500bp左右各一条带及500bp左右处 的两条带。TYLCV与PaLCuCNV复合侵染的番茄可产生6^3ρ、l^bp、16^p、lOMbp、155^3ρ、 2561bp的片段，附图可显示2500bp、1500bp、IOOObp左右各一条带。TYLCV与TYLCTWV复合 侵染的番茄可产生66bp、146、162bp、2561bpJ602bp的片段，附图可显示^OObp左右的一 条粗亮带。TYLCCNV与PaLCuCNV复合侵染的番茄可产生119bp、141bp、14^p、401bp、53^p、 1054bpU552bpU558bp的片段，附图可显示1500bp左右的一条带，IOOObp左右的一条带及 500bp左右的两条带。TYLCCNV与TYLCTWV复合侵染的番茄可产生119bp、141bp、146、401bp、 532bp、1552bp、2602bp的片段，附图可显示^OObp、1500bp左右的各一条带及500bp左右的 两条带。PaLCuCNV 与 TYLCTWV 复合侵染的番茄可产生 l^bp、146、lOMbp、155m3pJ602bp 的片段，附图可显示2600bp、1500bp、IOOObp左右各一条带。通过以上带型的不同可以区分 除了 TYLCV和ToLCuTWV外的大部分双生病毒类型，而TYLCV和ToLCuTWV之间可以通过延 长电泳时间将2560bp左右的条带和^OObp左右的条带分离开进行鉴定。此外，这两个病 毒可以通过症状很容易区分开来，ITLCV可产生明显的黄化症状，而ToLCuTWV不产生黄化 症状，此外还可以通过。本鉴定技术有以下优点1、可以通过PCR方法区分这4种侵染番茄的双生病毒，节 省了时间，降低了实验费用。2、可鉴定这四种双生病毒间的复合侵染。
具体实施例方式利用四种双生病毒的侵染性克隆单独接种或两两混合接种4片真叶大小的番茄 苗(品种为‘2300’)，接种后20天，取番茄的嫩叶，采用Williamson，V. M文献公开的方法， 分别提取DNA，为模板DNA。番茄2300为上海农科院园艺所番茄组选育的高代自交系，为双生病毒的感病品 种。(1)将PCR体系按照如下的程序进行PCR反应94°C变性2分钟，然后94°C变性45秒、52 °C退火45秒、72 °C延伸2分30秒，35个 循环，最后72°C延伸10分钟，获得PCR产物，4°C保存；所说的PCR体系为水溶液，组分和含量为
模板DNA20ng/L
混合引物0.2umol/L
IOXbuffer2ul/L
Mg2+3. 5mmol/L
dNTPs250umol/LSspI 酶0. 2uL/L混合引物序列ITLCV引物序列SH2F :5，-gggatccacttctaaatgaa-3，SH2R :5，-tggatcccacatattgcaag-3‘ITLCCNV 引物序列YlOF :5，-gggatcctctgctcaacgag-3，YlOR 5' -aggatcccacatgcttaacg-3‘PaLCuCNV 引物序列PaF :5，-gggatcctttactgaacgag-3，PaR :5，_aggatcccacatgtttggcg_3，ITLCTWV 引物序列ZJ16F 5' -gggatccacttttaaatgat-3，ZJ16R 5' -tggatcccacattttaccga-3，(2)酶切产物的制备将酶切体系在37°C保温1. 5h，获得及酶切产物；所说的酶切体系为水溶液，组分和含量为PCR 产物 0. 35uL/L,SspI 酶 0. 05uL/L,BufferO. luL/L,(3)配置2. 5%的琼脂糖凝胶，加入1 μ L ΕΒ(0· 5μ g/ml)倒入胶槽中，插入梳子， 待胶凝固后检测。分别取IOuL PCR产物和IOuL酶切产物进行检测，终结果用EB染色，采 用Bio-RAD凝胶成像系统拍照；所说的EB的化学名称为溴化乙锭，可采用市售产品，如上海生工公司的产品，染 色方法，为现有技术，如Williamson，V. Μ.文献报道的方法；Bio-RAD凝胶成像系统为一种通用的系统，可采用Bio-RAD公司的产品；实验结果如图，不同病毒侵染组合可产生不同的酶切条带，可以根据这些条带的 差异对侵染的双生病毒种类进行推测。
权利要求
1.一种检测在我国比较流行的4种双生病毒的方法，其特征在于仅仅通过常规PCR 反应及酶切反应GspI酶)辅助以症状便可对这4种双生病毒进行区分检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于PCR反应的引物为说明书中所说明的 8条引物，反应条件为说明书中所说明的条件，酶切反应所用的酶为^pI酶。
3.根据权利要求1或2所述的双生病毒检测方法，其特征在于所用的检测方法仅对 我国目前比较流行的4种双生病毒(ITLCV，TYLCCNV, ToLCuTffV, PaLCuCNV)进行区分检测。
全文摘要
本发明提供了一种同时检测四种侵染番茄的双生病毒的RFLP方法，包括如下步骤(1)将包括可扩增四种双生病毒全长基因组的引物(SH2F/R、Y10F/R、PaF/R、ZJ16F/R)的PCR体系进行PCR反应，获得PCR产物(2)将酶切体系在37℃保温1.5h，获得酶切产物；(3)将酶切产物进行检测，终结果用EB染色，采用Bio-RAD凝胶成像系统拍照，分析结果。本发明RFLP检测双生病毒技术有以下优点1、可以利用PCR区分4种在我国非常流行的侵染番茄的双生病毒，解决了通常需要利用测序才能检测这几个病毒的问题。降低了费用，节约了时间；2、该方法还可以对这4种双生病毒复合侵染的现象进行检测。
文档编号C12Q1/68GK102108417SQ200910200620
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者万延慧, 余力, 张辉, 朱为民, 朱龙英, 杨少军, 邰翔 申请人:上海市农业科学院