专利名称：由收籽高粱生产醇和副产品的工艺的制作方法
由收籽高粱生产醇和副产品的工艺相关引用本申请要求于2008年5月四日提交的美国临时专利申请序列号61/130，187的 优先权，其整体在此引入作为参考。发明领域本发明涉及使用高粱作为原料(feedstock)从发酵中生产醇(例如乙醇)的非蒸 煮方法。该方法包括在非蒸煮工艺中使用植酸酶、具有颗粒淀粉水解活性的淀粉水解酶和 非淀粉多糖水解酶。
背景技术：
由于石油产品的短缺和高昂价格，可再生能源如生物燃料的应用越来越重要。因 此，在过去的几年中生物燃料乙醇市场以两位数的速度增长，预期这种趋势再持续至少三 至五年。使用发酵乙醇用于能源的一个问题是这种方法是耗能的，因此仍然需要提高效 率。另一个问题是随着使用发酵乙醇的增加，产生了更多的副产品，例如干酒糟加可溶物 (DDGS)。例如，在干磨工艺中1公吨玉米仁通常产生约300Kg DDGS0于是，增加乙醇生产来 满足快速增长的市场需要，也导致DDGS体积增加。尽管DDGS可以用于动物饲料配方，但是 它们通常具有较高水平的植酸，植酸减少可以消化DDGS的动物的数量，并且当被消化时增 加污染问题。许多农业作物本身就是将淀粉转化成葡萄糖以产生多种生物化学品(包括可再 生的生物燃料如乙醇)的可行候选物。虽然玉米是使用最广泛的用于生产乙醇的淀粉基发 酵原料，但是其它高淀粉含量谷物(如高粱和稻米)也开始被认为是生产乙醇的可行原料。一般而言，醇发酵工艺、特别是乙醇生产工艺包括湿磨工艺或干磨工艺。对于这 些工艺的综述，参见 Bothast 等人，2005，Appl. Microbiol. Biotechnol. 67 :19-25 和 THE ALCOHOL TEXTBOOK，第 3 版(K. A. Jacques 等人编辑)1999 Nottingham University Press, UK。一般而言，干磨包括多个基本步骤，其包括研磨、蒸煮、液化、糖化、发酵和固液分 离以生产醇和其它副产品。通常，整个谷粒例如玉米被研磨成细颗粒大小，然后在料浆槽中 与液体混合。在喷射式蒸煮器中料浆与液化酶(例如α-淀粉酶)一起历经高温，使谷物 中的淀粉水解成糊精。混合物冷却，进而用糖化酶(例如葡糖淀粉酶)处理来生产可发酵 的葡萄糖。然后在产乙醇微生物的存在下，将含有葡萄糖的醪液发酵约M 120小时。将 醪液中的固体与液相分离，获得乙醇和有用的副产品例如酒糟。最近，已经引入省去蒸煮步骤或减少在高温下处理谷粒的需要的工艺。这些工 艺有时称作非蒸煮、低温或温蒸煮，包括研磨谷粒以及将磨碎的谷粒与液体混合以形成 料浆，然后在低于颗粒淀粉糊化温度的温度，将料浆与一种或多种具有颗粒淀粉水解活 性的酶和任选地酵母混合以生产乙醇和其它副产品(USP 4，514，496、TO 03/066826 ；WO 04/081193 ；W004/106533 ；WO 04/080923 和 WO 05/069840)。
尽管这些工艺相对于先前工艺作了某些改进，但是工业需要另外的工艺改进来转 化收籽高粱(grain sorghum)，导致较高的碳转化和能效以及高醇产量。发明概述在一些实施方案中，本发明涉及由研磨的高粱生产醇的方法，所述方法包括在低 于高粱的淀粉糊化温度的温度和约3. 5至约7. 0的pH、使具有20至50% w/w干固体(ds) 含量的包含磨碎的高粱的料浆(slurry)与至少一种植酸酶、至少一种α淀粉酶(AA)、至少 一种葡糖淀粉酶(GA)、至少一种非淀粉多糖水解酶和发酵生物接触约10至约250小时，其 中所述至少一种AA和/或至少一种GA具有颗粒淀粉水解活性；和生产醇。在该实施方案 的某些方面，所述醇为乙醇；至少一种非淀粉多糖水解酶选自纤维素酶、葡糖苷酶、果 胶酶、木聚糖酶、β -葡聚糖酶、半纤维素酶或其组合。在该实施方案的某些方面，以酶混合 物的形式加入所述植酸酶、α淀粉酶、葡糖淀粉酶和非淀粉多糖水解酶。在该实施方案的 其它方面，该方法还包括使料浆与至少一种蛋白酶接触。该蛋白酶可以是酸性真菌蛋白酶。 该酸性真菌蛋白酶可以源自木霉属物种(Trichoderma sp.)。在该实施方案的另外方面，以 约Ippm至约IOppm的浓度加入该酸性真菌蛋白酶。在该实施方案的又一方面，该方法还包 括使料浆与至少第二非淀粉多糖水解酶接触。在该实施方案的另外其它方面，所述接触是 在20°C至80°C、在25°C至40°C的温度进行。在其它方面，所述接触是在55°C至77°C的温 度进行，然后在加入酵母之前降到25°C至35°C。在该实施方案的其它方面，在接触步骤中 提供的植酸酶为约0. 01至约10. OFTU/g ds,为约0. 1至约5. OFTU/g ds,为约1至约4FTU/ g ds。在该实施方案的另外其它方面，该料浆包括收籽高粱和选自玉米、小麦、黑麦、大麦、 稻或其组合的至少一种其它谷物的混合物。在一些实施方案中，本发明涉及由高粱生产乙醇的工艺，所述工艺包括获得碾碎 高粱的料浆；在低于高粱的糊化温度的温度、将所述料浆与包括植酸酶、α淀粉酶、葡糖淀 粉酶和非淀粉多糖水解酶的酶组合接触，以产生可发酵糖；和在发酵微生物的存在下、在 10°C至40°C的温度，发酵可发酵糖10小时至250小时；和产生乙醇，其中与仅使用α淀粉 酶和葡糖淀粉酶的可比方法相比，所述乙醇产量增加。在一些方面，乙醇产量将为至少8%、 至少10%、至少12%、至少14%和至少16% ν/ν。在其它方面，乙醇产量将增加至少到 至少10%。在一些方面，在45°C至65°C的温度进行所述接触步骤。在其它方面，该工艺包 括在接触步骤后降低温度。在一些实施方案中，本发明涉及由高粱生产乙醇的方法，所述方法包括在低于收 籽高粱的淀粉糊化温度的温度、将含有来自收籽高粱的颗粒淀粉的料浆与至少一种植酸 酶、至少一种α淀粉酶(AA)、至少一种葡糖淀粉酶(GA)、至少一种非淀粉多糖水解酶、至少 一种酸性真菌蛋白酶和发酵生物接触足以生产乙醇的一段时间，其中所述至少一种AA和/ 或至少一种GA为颗粒淀粉水解酶(GSHE)，其中所述非淀粉多糖水解酶选自纤维素酶、木 聚糖酶、果胶酶、β -葡糖苷酶、β -葡聚糖酶和/或半纤维素酶。发明详述本发明的方法包括使用高粱在非蒸煮发酵中联合使用非淀粉多糖水解酶和植酸 酶与颗粒淀粉水解酶(GSHE)来增加乙醇产量。使用常规工艺，来自高粱的乙醇产量通常非常低。尽管存在多种导致该低产量的因素，但是高粱中高浓度的鞣质是一种起作用的因素。 这是因为当加热时，鞣质与蛋白质、淀粉和其它分子交联，产生网状结构。交联使高粱中的 淀粉难以接近酶，导致可发酵糖的损失。因此，非蒸煮工艺的使用可以增加淀粉的可接近 性，导致更好的发酵效率，从而增加乙醇产量。该方法还具有通过将植酸水解成肌醇(酵母 的营养物)和磷酸盐(酵母和饲料动物的营养物)为酵母提供营养物和/或生长因子的优 点。这也导致发酵效率增加。本发明的方法包括在非蒸煮工艺中使高粱接触发酵生物和接触下列酶(同时地 或分开地)至少一种α淀粉酶、至少一种葡糖淀粉酶(其中所述α淀粉酶和/或葡糖淀 粉酶是颗粒淀粉水解酶(GSHE))、至少一种植酸酶和至少一种非淀粉多糖水解酶(例如，纤 维素酶、半-纤维素酶、β葡糖苷酶、β葡聚糖酶、木聚糖酶和/或果胶酶)，以生产醇。该 方法还可以包括加入第二酶，例如酸性真菌蛋白酶。该非蒸煮工艺可以在低于高粱的淀粉 糊化温度的温度进行。在一些实施方案中，该方法在有助于酵母发酵的温度进行。在一些 实施方案中，所述接触作为预处理而发生。在一些实施方案中，所述接触、发酵和/或预处 理在低于高粱中颗粒淀粉的淀粉糊化温度的温度发生。在一些实施方案中，预处理在低于 高粱中颗粒淀粉的糊化温度、但更接近于非淀粉多糖水解酶和/或用于工艺的其它酶的最 适温度的温度发生。与在未加入植酸酶和非淀粉多糖水解酶的情况下进行的实质上类似的 方法相比较，该工艺导致乙醇产量增加、发酵效率增加和/或DDGS中植酸的量减少。因此，该工艺的实施方案包括组合物和方法，其中在发酵过程中使高粱与包括至 少一种植酸酶、至少一种α淀粉酶和至少一种葡糖淀粉酶(其中所述α淀粉酶和/或葡 糖淀粉酶是颗粒淀粉水解酶)以及至少一种非淀粉多糖水解酶(例如，纤维素酶、半-纤维 素酶、木聚糖酶、β葡糖苷酶、β葡聚糖酶和/或果胶酶)的酶组合物在足以生产乙醇的温 度和一段时间内接触。该方法导致乙醇产量增加，发酵效率增加和/或DDGS中植酸的量减 少。在一些实施方案中，所述至少一种非淀粉多糖水解酶选自纤维素酶、半纤维素酶、木聚 糖酶、β葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和果胶酶。该方法还可以包括加入酸性真菌蛋白酶。在 一些实施方案中，该方法包括在约3. 5至7.0的ρΗ，在有助于发酵生物发酵的温度(例如， 28-380C )，孵育和/或发酵高粱达10至250小时。定义除非另有说明，本发明的实践涉及通常用于分子生物学、蛋白质工程、重组DNA技 术、微生物学、细胞生物学、细胞培养、转基因生物学、免疫学和蛋白质纯化的常规技术，所 有这些都是本领域的普通技术。这些技术是本领域技术人员已知的，并描述于很多教科书 和参考文献中。本文提及的所有专禾I』、专利申请、文章和出版物，无论上文和下文，都通过参 考明确并入本文。除非本文中另外定义，本文中所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域 的普通技术人员所通常理解的含义。尽管和本文中描述的那些相似或等同的任何方法和材 料可以在本发明的实践或试验中使用，但是本文描述了优选的方法和材料。因此，通过参考 说明书整体，紧接下面定义的术语将得到更全面的描述。同样，如本文所使用，单数形式的 “一个(a)”、“一种(an)”和“该(the) ”包括复数含义，除非上下文另外地明确指出。数值 范围包括定义该范围的数字。因此，例如，提及包含“化合物”的组合物时，包括两种或多种 化合物的混合物。还应理解，术语“或”通常以包括“和/或”的含义使用，除非上下文另外 地明确指出。除非另外指出，氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。可以理解，本发明并不限于所述的具体方法、方案和试剂，因为根据本领域技术人员使用它们的情形，可 以对它们进行改变。此外，本文所提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制， 可以通过参考说明书整体而拥有本发明的各个方面或实施方案。因此，通过参考说明书整 体，紧接下面定义的术语将得到更全面地定义。然而，为了促进理解本发明，下面对许多术 语进行定义。从本发明的说明书和权利要求来看，本发明的其它特征和优点将是明显的。本文所用的术语"淀粉"是指由植物的复杂多糖碳水化合物组成的、由具有式 (C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉组成的任何物质，其中χ可以是任何数。本文所用的术语"颗粒淀粉"是指生(未蒸煮)淀粉，即存在于植物材料(例如 籽粒和块茎)中的天然形式的淀粉。本文所用的术语“颗粒淀粉底物”是指含有颗粒淀粉的物质。本文所用的术语"干固体含量(DS)“是指基于干重以％计的料浆中的总固体。本文所用的术语"料浆(slurry)“是指含有不溶性固体(例如颗粒淀粉)的水性 混合物。本文所用的术语“寡糖”是指具有2至10个以糖苷键连接的单糖单元的任何化合 物。这些短链简单糖聚合物包括糊精。本文所用的术语“可溶性淀粉”是指由不溶性淀粉(例如颗粒淀粉)的水解产生 的淀粉。本文所用的术语“醪液(mash)，，是指用于生产发酵产物的液体的可发酵底物的混 合物，并且用于指从可发酵底物与一种或多种淀粉水解酶和发酵生物的最初混合到该轮发 酵完成的任何发酵阶段。本文所用的术语“糖化酶”和“淀粉水解酶”是指能转化淀粉为单糖或寡糖(例如 己糖或戊糖)的任何酶。本文所用的术语"颗粒淀粉水解(GSH)酶"和"具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的 酶"是指能水解颗粒形式的淀粉的酶。本文所用的术语“非淀粉多糖水解酶”是能够水解复杂碳水化合物聚合物例如纤 维素、半纤维素和果胶的酶。例如，纤维素酶(内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶、β葡糖苷 酶)、半纤维素酶(木聚糖酶)和果胶酶是非淀粉多糖水解酶。本文所用的术语“淀粉的水解”是指糖苷键的断裂和水分子的加入。本文所用的术语“ α -淀粉酶(例如，Ε. C. 3. 2. 1. 1)，，是指催化α _1，4_糖苷 键的水解的酶。这些酶也被描述为实现含有1，4-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖中1， 4- α -D-糖苷键的外切水解或内切水解的那些酶。本文所用的术语“糊化”是指淀粉分子通过蒸煮而溶解以形成粘稠悬液。本文所用的术语“糊化温度”是指包含淀粉的底物开始糊化时的温度。在一些实 施方案中，这是糊化开始时的最低温度。确切的糊化温度取决于具体淀粉，并且可以随例 如植物种类和环境以及生长条件等因素而变化。对于许多颗粒淀粉，初始淀粉糊化温度范 围包括例如大麦(52°C至59°C )、小麦(58°C至64°C )、黑麦(57°C至70°C )、玉米(62°C至 72°C )、高直链淀粉玉米(67°C至80°C )、稻(68°C至77°C )、高粱(68°C至77°C )、马铃薯 (58°C至 68°C)、木薯(59°C至69°C)和甘薯(58°C至 72°C)。(参见例如，J. J. Μ. Swinkels 的 STARCH CONVERSION TECHNOLOGY 中第 32-38 页，Van Beynum等人编辑(1985)Marcel DekkerInc. New York 禾口 The Alcohol Textbook 第 3 版，A Reference for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohol Industries, Jacques 等人编辑，(1999)Nottingham University Press, UK)。本文所用的术语“低于糊化温度”是指温度小于糊化温度。本文所用的术语“非蒸煮”是指不加热至高于含淀粉底物的糊化温度的温度。本文所用的术语“葡糖淀粉酶”是指淀粉葡糖苷酶类酶(例如，E. C. 3. 2. 1. 3、葡糖 淀粉酶、1，4-α -D-葡聚糖葡糖水解酶)。这些是外切作用酶，其从直链淀粉和支链淀粉分 子的非还原端释放葡糖基残基。该酶还水解α_1，6和α_1，3键，尽管是以比α_1，4键慢 得多的速率。本文所用的短语“同时糖化和发酵(SSF) ”是指一种产生终产物的工艺，其中发酵 生物例如产乙醇微生物和至少一种酶例如糖化酶在同一工艺步骤中在相同容器中组合。本文所用的术语“糖化”是指不可直接使用的多糖被酶转化为单糖或寡糖以便发 酵转化为终产物。本文所用的术语“碾磨(milling) ”是指将谷粒分解成更小的颗粒。在一些实施方 案中，该术语可与研磨(grinding)交换地使用。本文所用的术语“干磨”是指碾磨干燥的完整谷粒，其中谷粒的级分例如胚芽和麸 皮尚未被有目的地去除。本文所用的术语“液化”是指淀粉转化中的阶段，其中糊化的淀粉被水解而产生低 分子量的可溶性糊精。本文所用的术语“稀酒糟(thin-stillage) ”是指所得的发酵的液体部分，其含有 溶解的物质和悬浮的细粒，并且与发酵所产生的固体部分分离。在工业发酵工艺中再循环 的稀酒糟常常被称为“回流物(back-set)”。本文所用的术语“容器”包括但不限于槽、缸、瓶、烧瓶、袋、生物反应器及类似物。 在一些实施方案中，该术语是指适合于进行本发明所包括的糖化和/或发酵工艺的任何容ο本文所用的术语“终产物”是指从可发酵底物酶促转化的任何碳源衍生产物。在 一些优选的实施方案中，所述终产物是醇，例如乙醇。本文所用的术语“发酵生物”是指适宜用在发酵中以直接或间接产生终产物的任 何微生物或细胞。本文所用的术语“乙醇生产者”或产乙醇微生物”是指能够从单糖或寡糖生产乙醇 的发酵生物。本文所用的术语“酶促转化”通常是指通过酶作用来修饰底物。本文所用的该术 语还指通过酶的作用来修饰可发酵底物，例如含颗粒淀粉的底物。本文所用的术语“回收的”、“分离的”、“分开的”指的是化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸从与其天然相关的至少一种成分中移出。本文所用的术语“产量”是指采用本发明的方法所生产的终产物的量。在一些实 施方案中，该术语是指终产物的体积，而在其它实施方式中，该术语是指终产物的浓度。本文所用的术语“发酵效率”是指如所述(Yeast to Ethanol，1993，5，第2版， 241-287, Academic Press, Ltd.)，采用以下公式，与来自产葡萄糖底物(即实际淀粉)的理论乙醇重量相比，所生产的醇的实际重量的百分比。考虑基于干重的总淀粉含量、发酵 过程中淀粉通过酶促水解向可发酵糖的转化、以及从淀粉到葡萄糖的化学谷粒(chemicalgrain)
权利要求
1.一种由高粱生产乙醇的方法，其包括在低于高粱的淀粉糊化温度的温度和约3. 5至约7. 0的pH、将20至50% w/w干固体 (ds)含量的含高粱的料浆与至少一种植酸酶、至少一种α淀粉酶(AA)、至少一种葡糖淀粉 酶(GA)、至少一种非淀粉多糖水解酶和发酵生物接触足以生产乙醇的一段时间，约10至约 250小时，其中所述至少一种AA和/或至少一种GA为颗粒淀粉水解酶(GSHE)。
2.权利要求1的方法，其中所述至少一种非淀粉多糖水解酶选自纤维素酶、葡糖 苷酶、果胶酶、木聚糖酶、β -葡聚糖酶和/或半纤维素酶。
3.权利要求1的方法，其中至少一种植酸酶、至少一种α淀粉酶(AA)、至少一种葡糖 淀粉酶(GA)和至少一种非淀粉多糖水解酶中的至少两种以混合物形式加入。
4.权利要求1的方法，其还包括将所述料浆与至少第二非淀粉多糖水解酶接触。
5.权利要求1的方法，其还包括将所述料浆与至少一种蛋白酶接触。
6.权利要求5的方法，其中所述至少一种蛋白酶是酸性真菌蛋白酶。
7.权利要求6的方法，其中所述酸性真菌蛋白酶是木霉属酸性真菌蛋白酶。
8.权利要求6的方法，其中所述酸性真菌蛋白酶以约Ippm至约IOppm的浓度加入。
9.权利要求1的方法，其中所述低于糊化温度的温度为20°C至80°C。
10.权利要求9的方法，其中所述温度为55°C至77°C且在加入酵母之前将温度降至 25-20 °C。
11.权利要求9的方法，其中所述温度为约25°C至约40°C。
12.权利要求1的方法，其中所述AA和GA均是GSHE。
13.权利要求1的方法，其中接触步骤中提供的植酸酶的量为约0.01至约10. OFTU/gds0
14.权利要求13的方法，其中接触步骤中提供的植酸酶的量为约0.1至约5. OFTU/gds0
15.权利要求14的方法，其中接触步骤中提供的植酸酶的量为约1至约4FTU/gds.
16.权利要求1的方法，其中所述料浆含有与至少一种选自玉米、小麦、黑麦、大麦和稻 的其它颗粒淀粉底物混合的高粱。
17.权利要求1的方法，其还包括回收乙醇。
18.权利要求1的方法，其中发酵生物是酵母。
19.一种增加来自高粱的乙醇产量的工艺，其包括 获得高粱的料浆，在低于高粱的糊化温度的温度、将所述料浆与包括植酸酶、α淀粉酶、葡糖淀粉酶和非 淀粉多糖水解酶的酶组合接触以产生可发酵糖，其中所述α淀粉酶和/或所述葡糖淀粉酶 是GSHE ；禾口在发酵微生物的存在下、在10°C至40°C的温度、发酵可发酵糖10小时至250小时的时 间以生产乙醇，其中与仅使用α淀粉酶和葡糖淀粉酶的可比方法相比，乙醇产量增加。
20.权利要求19的工艺，其中所述接触和发酵是同时的，且所述温度为10°C至40°C。
21.权利要求19的工艺，其中发酵微生物是酵母。
22.权利要求19的工艺，其中所述非淀粉多糖水解酶选自纤维素酶、葡糖苷酶、果 胶酶、木聚糖酶、β -葡聚糖酶和/或半纤维素酶。
23.权利要求19的工艺，其还包括将所述料浆与至少一种蛋白酶接触。
24.权利要求23的工艺，其中所述蛋白酶是酸性真菌蛋白酶。
25.权利要求19的工艺，其中高粱与至少一种选自玉米、小麦、黑麦、大麦和稻的其它 谷物混合。
26.权利要求19的工艺，其中乙醇产量增加至少4%。
27.权利要求19的工艺，其中乙醇产量增加至少到至少10%。
28.权利要求19的工艺，其中与使用高粱的常规方法相比，所述产量增加。
29.权利要求19的工艺，其还包括在接触步骤之后且在发酵步骤之前降低温度。
30.一种由高粱生产乙醇的方法，其包括在低于高粱的淀粉糊化温度的温度、将含有颗粒淀粉的料浆与至少一种植酸酶、至少 一种α淀粉酶(AA)、至少一种葡糖淀粉酶(GA)、至少一种非淀粉多糖水解酶、至少一种酸 性真菌蛋白酶和发酵生物接触足以生产乙醇的一段时间，其中所述至少一种AA和/或至少 一种GA是颗粒淀粉水解酶(GSHE)，其中所述非淀粉多糖水解酶选自纤维素酶、木聚糖酶、 果胶酶、β -葡糖苷酶、β -葡聚糖酶和/或半纤维素酶。
31.权利要求30的方法，其中所述料浆具有20 50%w/w干固体(ds)含量。
32.权利要求31的方法，其中所述料浆具有25 35%w/w的干固体(ds)含量。
全文摘要
本发明描述了由碾碎的高粱生成醇、特别是乙醇的方法。
文档编号C12P7/06GK102046799SQ200980119811
公开日2011年5月4日 申请日期2009年5月29日 优先权日2008年5月29日
发明者G·段, H·徐, J·K·谢蒂 申请人:丹尼斯科美国公司