转基因糖用甜菜植物的制作方法

专利名称：转基因糖用甜菜植物的制作方法
转基因糖用甜菜植物一般而言，本发明涉及植物分子生物学、植物转化、和植物育种领域。更具体而言， 本发明涉及具有延迟抽苔的表型的转基因糖用甜菜植物。本发明进一步涉及多核苷酸标志 物，其在糖用甜菜基因组内与抽苔基因或B基因紧密连锁或驻留(residing)于抽苔基因或 B基因内，而且可以用于区分一年生与二年生基因型或展现出二年生基因型的糖用甜菜植 株的植物分组内的不同单元型(haplotypes)。栽培的糖用甜菜(Beta vulgaris ssp. vulgaris L.)是一种二年生植物，其在第 一年形成贮藏根和莲座叶。在一段时间的低温后开始枝条延长(抽苔)和花形成。比较而 言，一年生甜菜(B. vulgaris ssp. maritime)属的许多野生甜菜显示一年生生长习性，这是 由于B基因座处存在抽苔基因B，其位于染色体II的中央区。抽苔基因(B基因)负责决定 糖用甜菜中的一年生习性。认为甜菜物种中的一年生是单基因的且显性的性状。与携带b 等位基因的二年生植物相反，携带显性B等位基因的植物能够以不依赖于春化的方式自幼 年期转变成生殖期，所述二年生植物强制性需要春化进行抽苔，随后发生开花。基因座B的 显性等位基因在野生甜菜中是丰富的，而且在长日照下引起抽苔，无需对于携带隐性等位 基因的二年生栽培种而言通常至关重要的冷(低温，cold)要求(Abe等，1997)。抽苔(茎延长)(stem elongation)是营养性向生殖性生长转换中明显可见的第 “步 。传统上，二年生栽培的糖用甜菜在春季种植并在秋季收获。然而，预期通过在秋季 播种并在冬季里栽培来延长生长期本质上提高产率，而且会容许延长糖用甜菜加工活动， 解决糖工业的一项需求。然而，在中部欧洲在冬季里栽培目前的糖用甜菜(即作为冬季作 物)目前是不可能，这是因为春化(通过暴露于冬季期间的寒冷温度诱导的)会导致抽苔 和产率损失。如此，高度想要开发非抽苔冬季甜菜，其中修饰春化响应以赋予冷诱导后对抽 苔的抗性或抽苔的显著延迟。由于B基因在糖用甜菜的春化响应中发挥关键作用，它代表 用于通过调控春化响应来工程化改造抽苔抗性的有希望的候选。此外，在栽培的糖用甜菜中，抽苔是不想要的现象，因为它导致产率显著降低而 且引起收获和提取糖期间的问题。糖用甜菜的商业性种子生产常常在生长有一年生杂生 (weed)甜菜的地区进行，它们能在种子生产中引起花粉污染，导致商业性种子中有一年生 植物。这是客户不能接受的。为了鉴定一年生植物的污染，在收获种子后立即在没有野生 型一年生甜菜生长的地区种植各批次的商业性种子。不对植物春化，而且通过抽苔者的存 在来鉴定污染。非常希望用基于标志物的筛选测定法来替代此测试，因为能更早地得到结 果，这会导致种子加工中成本节约。基于标志物的方法还能有利地用于糖用甜菜育种，例如用于加快育种过程， 或用于引入来自野生海甜菜的新变异。由于B等位基因的不完全渗透(incomplete penetration)及其环境依赖性，还需要紧密连锁的分子标志物来筛选它在育种系中的存 在。对于所有这些情况，重要的是要有与B基因紧密连锁的能够精确鉴定一年生植物或二 年生植物的标志物。出于上述原因，需要转基因手段来调控糖用甜菜的春化响应，而且还需要标志物辅助手段来在种子生产中和糖用甜菜育种中区分B基因的一年生和二年生等位基因。本发明现在提供了解决上述需要的此类转基因手段以及标志物辅助手段。发明概述本发明涉及核酸序列，其与如下的核酸序列具有至少70%的序列同一性，所述核 酸序列选自如SEQ ID NO :1、4、5、6、7、8、9、10、53或讨之任一项中所列的核酸序列的组， 涉及核酸序列，其包含如下核酸序列的至少15个连续核苷酸，所述核酸序列选自如SEQ ID NO :1、4、5、6、7、8、9、10、53或讨之任一项中所列的核酸序列的组，涉及所述核酸序列；涉及 所述一个(to said one)，或者涉及核酸序列，其在严格条件下与如下的核酸序列杂交，所 述核酸序列选自如SEQ ID NO :1、4、5、6、7、8、9、10、53或讨之任一项中所列的核酸序列的 组。在一个优选的实施方案中，上文所描述的本发明的核酸序列是分离的核酸。关于 同源性，本发明应当同样地涵盖所有个别数值(它们落入以至少70%开始的范围中，如上 文所提及的，即 71%,72%,73%,74%,75%,. · · ,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%, 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)。优选地，本发 明的核酸序列的长度包含选自下组的核酸序列的至少15、20、25、30、35、40、45、或至少50 个连续的核苷酸如SEQ ID NO :1、4、5、6、7、8、9、10、53、或讨之任一项中所列的核酸序列。 要理解的是，术语“至少χ个核苷酸”涵盖具有以χ开始的任何数值及以上的核酸分子。例 如，术语“至少15个核苷酸”意图涵盖具有15、16、17、18、19、20、和更多个核苷酸的核酸分 子。在一个进一步优选的实施方案中，上文所描述的本发明的核酸序列在严格条件下，更优 选地在高度严格条件下与选自下组的核酸序列杂交如SEQ ID N0:l、4、5、6、7、8、9、10、53、 或M之任一项中所列的核酸序列。在此方面的一个别的实施方案中，核酸分子包含选自下组的核苷酸序列及其互补 物SEQ ID而1、4、5、6、7、8、9、10、53、或讨。在另一个优选的实施方案中，上文所描述的 本发明的核酸序列包含如SEQ ID NO :8中所描述的核酸序列，其中所述序列包含一处或多 处核酸替代、缺失、或添加，如表7-1和表7-2中所显示的，其中表7-1和表7-2中显示的多 态性分别代表SEQID NO 8中所描述的序列的18种一年生和2种二年生等位基因。表7_1 和表7-2也显示为

图10和图11。依照另一方面，本发明进一步提供了由上文所描述的本发明的核酸序列编码的多 肽。在一个优选的实施方案中，上文所描述的本发明的多肽具有选自下组的氨基酸序列如 SEQ ID NO 11或12中所描述的氨基酸序列。本发明进一步涉及B基因特别地BvPRR7基因在用于生成显现出非抽苔表型的植 物的转基因方法中的用途。具体地，本发明涉及包含表达盒的嵌合构建体，所述表达盒包含 在调节元件控制下，优选地在植物中有功能的调节元件控制下的如上文所描述的本发明的 核酸序列。在本发明的一个实施方案中，如上文所描述的嵌合构建体可以进一步含有选择标 志基因，其容许在选择方法(selection procedure)中区分经转化的和未转化的植物材料。在一个实施方案中，本发明的嵌合构建体包含负选择标志，特别地编码对植物毒 性化合物诸如抗生素或除草剂的抗性的选择标志。在另一个实施方案中，本发明的嵌合构 建体包含正向选择标志，特别地编码给经转化的植物提供超过非转化植物的选择优势，特别地营养优势的酶的选择标志诸如例如磷酸甘露糖异构酶基因或木糖异构酶基因。在一个优选的实施方案中，提供了本发明的嵌合构建体以转基因下调BvPRR7基 因表达，特别地经由反义或RNAi办法来进行。在此上下文中，术语“下调”或“抑制”想要指 与相同条件下非转化的植物中的基因表达相比BvPPR7基因的表达水平的任何降低。这包 括基因“沉默”，使得可以检测不到基因表达。在另一个优选的实施方案中，用于转基因下调 BvPRR7基因表达的本发明的嵌合构建体包含编码dsRNA的核酸分子，所述dsRNA能够靶向 通过转录编码B基因蛋白，优选地BvPRR7蛋白的DNA序列生成的mRNA以进行降解。在另 一个优选的实施方案中，上文所描述的本发明的嵌合构建体包含编码所述dsRNA的核酸分 子，其中所述核酸分子具有至少21个核苷酸的长度，而且与所述BvPRR7基因的编码序列的 至少一部分基本上相同。BvPRR7基因的所述编码序列优选是上文所描述的本发明的核酸序 列。更优选地，BvPRR7基因的所述编码序列是具有本发明中如列为SEQ ID NO :1、4、5、6、9、 10、53、或M的序列的核酸分子。“基本上相同的”指能够在严格条件下彼此杂交的两种核 酸分子。一般地，在dsRNA的整个长度里不要求dsRNA与BvPRR7基因的编码序列或其部分 之间的同一性或同源性。足够的是如果至少21个核苷酸的区段具有同一性，但是优选地， 选择编码在超过21个核苷酸的区段里与靶RNA分子具有同源性的dsRNA的核酸序列。优 选地，上文所描述的本发明的嵌合构建体包含编码dsRNA且具有超过21个核苷酸，更优选 超过50、100、250、500、600、750、1000或更多个核苷酸的长度的核酸分子。在一个优选的实施方案中，编码本发明嵌合构建体中包含的dsRNA的核酸分子具 有在组成型启动子，优选地来自拟南芥的启动子的控制下的如SEQ ID NO :1中所描述 的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明的嵌合构建体进一步包含来自马铃薯^LSl 基因的第二内含子的序列(Eckes等，1986 ；Vancanneyt等，1990)。在一个优选的实施方案 中，本发明的嵌合构建体包含靶向BvPRR7的反向重复，其由如SEQ ID NO :1中所描述的核 苷酸序列组成，以由来自马铃薯的StLSl基因第二内含子分开的反义和有义两种取向克隆 在Ubi3启动子(Norris等，1993)与Nos终止子之间。在本发明的一个实施方案中，提供了转化载体和/或表达载体，特别地植物转化 载体和/或表达载体，其包含如上文所描述的本发明的嵌合构建体。在一个别的实施方案 中，植物表达载体是RNAi表达载体，其包含上文所描述的本发明的嵌合构建体。在一个更 优选的实施方案中，RNAi表达载体包含图11中所显示的本发明的嵌合构建体。在本发明的一个别的方面，提供了一种植物细胞，其包含依照本发明的和如上文 所描述的嵌合构建体或载体分子(例如转化载体或表达载体)。在一个优选的实施方案中， 所述包含本发明的嵌合构建体或载体分子的植物细胞是糖用甜菜植物的植物细胞。进一步提供了具有延迟抽苔的表型的转基因植物特别地糖用甜菜植物或其细胞、 组织或种子，各包含本发明的植物细胞和/或依照本发明的嵌合构建体和/或如上文所描 述的本发明的的核酸序列，其中所述转基因植物表达所述dsRNA，从而延迟特别地抑制抽 苔，并且所述植物展现出延迟抽苔的表型优选地非抽苔表型。“抽苔的延迟”应当理解为调 控糖用甜菜植物的天然抽苔反应。在抽苔期间，植物春化(即暴露于冷温度)后作为第一步 并且在从营养性转变成生殖性生长过程中茎伸长，最终导致花形成。抽苔反应的延迟想要 指与正常的植物相比较晚开始的茎伸长；那些植物展现出延迟抽苔的表型。抽苔反应可以 延迟几天(即5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)和多至数周(即2、3、4周)或数月(即1、2、3、5、或6个月)。在一个优选的实施方案中，完全抑制抽苔响应；此类植物在春化后未 开始抽苔，而且展现出非抽苔表型。在一个进一步优选的实施方案中，本发明提供了转基因 植物特别地糖用甜菜植物，其是自本发明的和上文所描述的细胞、组织或种子生成的。在另一方面，本发明提供了一种用于生成杂种种子的方法，可以自所述杂种种子 种植具有受调控的抽苔的表型的植物特别地糖用甜菜植物。优选地，所述方法(a)提供具 有受调控的抽苔的表型的植物系特别地糖用甜菜系特别地本发明的和如上文所描述的转 基因糖用甜菜植物作为第一亲本系，(b)提供具有不同基因型的第二植物系，特别是糖用甜 菜系作为第二亲本系；其中步骤a)或步骤b)的所述亲本系之一是雄性不育CMS系，且其中 另一亲本系是雄性能育，并(c)容许所述雄性能育亲本系的植物传粉给第二雄性不育亲本 系的花，让所述种子形成，并收获所述杂种种子；其中收获的杂种种子是具有延迟抽苔的表 型的杂种植物特别地糖用甜菜杂种植物的种子。在一个优选的实施方案中，两种亲本系都 是糖用甜菜植物系，其中至少一种糖用甜菜亲本系是本发明的转基因糖用甜菜系。至少一 种具有受调控的抽苔的表型的糖用甜菜亲本系也可以优选是没有任何转基因的植物，然后 其通过遗传操作的其它方法获得，如下文所描述的。在此方面的一个实施方案中，步骤(a) 中提供的糖用甜菜亲本系是雄性不育CMS近交糖用甜菜系，其包含一种或多种本发明的核 酸序列或其片段，而步骤(b)中提供的第二糖亲本系是雄性能育近交糖用甜菜系。在另一 个优选的实施方案中，步骤(a)中提供的糖用甜菜亲本系是雄性能育糖用甜菜植物，其包 含一种或多种本发明的核酸序列或其片段，而步骤(b)中提供的第二糖亲本系是雄性不育 CMS近交糖用甜菜系。本发明的别的方面涉及展现出延迟抽苔的表型的植物特别地糖用甜菜植物的杂 种种子。在本发明的又一方面，所述杂种种子是通过本发明的和如上文所描述的方法生成 的。在一个进一步优选的实施方案中，具有延迟抽苔的表型的杂种植物特别地杂种糖用甜 菜植物是通过种植上文所描述的本发明的杂种种子生成的。本发明的进一步优选的实施方 案涉及选自下组的植物部分种子、胚、小孢子、合子、原生质体、细胞、胚珠、花粉、直根、子 叶、提取物或生物学样品，它们衍生自本发明的转基因糖用甜菜植物(taproots)或其种子 或者衍生自本发明的杂种植物或其种子，如上文所描述的。本发明的另一方面涉及本发明的核酸序列或其片段用于转化植物细胞特别地糖 用甜菜植物细胞的用途。用本发明的核酸序列或其片段转化植物细胞特别地糖用甜菜植物 细胞的目的是调控植物的抽苔习性，如上文所描述的。此方面的另一个实施方案涉及转化 植物细胞特别地糖用甜菜植物细胞的方法，其中该方法包括使用本发明的核酸序列或本发 明的嵌合构建体或本发明的和如上文所描述的载体。在另一方面，本发明提供了本发明的转基因植物、本发明的杂种植物、或本发明的 和如上文所描述的植物部分在选自下组的方法中的用途糖生产的方法、需氧发酵的方法 和厌氧发酵的方法。优选地，在生产糖的方法中使用本发明的转基因植物、本发明的杂种植 物、或本发明的和如上文所描述的植物部分。另一方面涉及一种用于生产糖的方法，其中加 工本发明的和如上文所描述的糖用甜菜植物、或其细胞或组织以生产糖。本发明进一步提 供了自本发明的和如上文所描述的糖用甜菜植物、或其细胞或组织生产的糖。在别的方面，本发明涉及基于核酸序列开发的多核苷酸标志物，所述核酸序列可 获自糖用甜菜中显示与抽苔基因(B基因)相关表型完美共分离的基因组DNA区，且其中所述标志物容许区分一年生与二年生基因型或展现出二年生或一年生表型的糖用甜菜植物 的植物分组内的不同单元型。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸标志物具有可 获自本发明的和如上文所描述的一种或多种核酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本 发明的多核苷酸标志物进一步包含一个或多个多态性，特别是基于SNP、SSR、或至少一个核 苷酸的缺失或插入的多态性，但是特别是基于SNP的多态性，该多态性诊断B基因座处的B 等位基因。优选地，所述多核苷酸标志物能够检测本文中列为SEQ ID NO :8的所述基因组 序列的不同等位基因中存在的和表7-1 (图10中进一步描绘的)和表7-2 (图10中进一步 描绘的)中所显示的多种SNP的至少一种，其中所述多核苷酸标志物能够区分不同等位基 因，特别地区分一年生和二年生糖用甜菜系。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸 标志物能够检测至少一种选自下组的SNP，该组包括列为SEQ ID NO :8的序列的位置#2对、 #351、#615、#897、#1082、#1841、#1915、#2334、#11592、#12316、#12490、或 #12544 处的和 如表7-1(图10中进一步描绘的)和表7-2(图11中进一步描绘的)中所显示的SNP。本 发明的别的方面涉及一组多核苷酸标志物，其包含本发明的和上文所描述的众多多核苷酸 标志物。在此上下文中，术语“众多”指一组超过一个的多核苷酸标志物，其优选地由两种、 三种或更多种标志物组成。本发明的另一方面涉及引物对，其由正向引物和反向引物组成，所述引物能够与 糖用甜菜基因组DNA中显示与抽苔基因(B基因)完美共分离的基因组区域内的核苷酸序 列退火。在一个优选的实施方案中，本发明的引物对与本发明的和如上文所描述的核酸序 列退火，并扩增本发明的多核苷酸，优选多核苷酸标志物，或其信息部分，其中所述多核苷 酸包含一个或多个多态性，特别地一处或多处诊断B基因座处的B等位基因且容许区分一 年生和二年生基因型的多态性。在一个优选的实施方案中，本发明的引物对选自下组(a) 与BvPPR7的第三内含子内如SEQ ID NO :6中所描述的核苷酸序列退火的引物对，其自包含 多态性特别地包含位置#87处的C/T SNP和/或位置#160处的C/T SNP和/或位置#406 处的A/G SNP的多态性的所述区域扩增信息片段；或(b)弓丨物对，其与列为SEQ ID NO 8 的核酸序列退火，并自包含多态性的所述序列扩增信息片段，所述多态性选自基于所述序 列的不同等位基因中存在的SNP的多态性，如表7-1 (图10中进一步描绘的)和表7-2 (图 11中进一步描绘的)中所显示的。在一个进一步优选的实施方案中，本发明的引物对包含 (a)如SEQ ID NO 49中所描述的正向引物PRR7(T6)_F和如SEQ ID NO 50中所描述的反 向引物PRR7(T6)-R，用于扩增包含SNP#2334的片段；或(b)如SEQID NO 13中所描述的 正向引物PRR7 (T1) -F和如SEQ ID NO 14中所描述的反向引物PRR7 (T1) -R，用于扩增包含 SNP#160的片段；或(c)用于扩增片段的如SEQ ID NO :55中所描述的正向引物lr22 (Tl)-F 和如SEQ ID NO :56中所描述的反向引物lr22(Tl)-R和如SEQ ID NO :57中所描述的探针分 子lr22 (Tl) -VIC,作为用作为第一荧光染料的VIC标记的第一探针分子，和如SEQ ID NO 58中所描述的探针分子lr22 (Tl)-FAM，作为用作为第二荧光染料的FAM标记的第二探针分 子。在一个实施方案中，本发明涉及一种或多种探针分子和/或涉及一种或多种引 物，特别地一种或多种引物对，但是特别地一种或多种由正向引物和反向引物组成的引物 对，所述引物能够与可获自糖用甜菜中显示与抽苔基因(B基因)有关的表型完美共分离的 基因组DNA区域的核酸序列退火，且其中所述标志物容许区分一年生与二年生基因型或展现出二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。在一个实施方案中，本发明涉及一组探针多核苷酸，其包含与包含多态性位点的 依照本发明的和如上文中所描述的信息多核苷酸片段内的亚区互补的至少两种不同探针 分子，并扩增在交叠的区域中仅相差一个或两个碱基错配的部分交叠片段，其中第一探针， 特别地用第一荧光染料，更特别用第一荧光染料和猝灭剂标记的探针代表一种等位基因， 而第二探针，特别地用第二荧光染料(其与第一染料不相同)，更特别地用第二荧光染料和 猝灭剂标记的探针代表另一等位基因。可以在用于鉴定糖用甜菜植物中与一年生(armuality)有关的等位基因的缺失 或存在的等位区分测定法中使用本发明的上述多核苷酸标志物、本发明的一组多核苷酸标 志物或本发明的引物对。在本发明的另一方面，提供了用于鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因 的缺失或存在的等位区分测定法，其容许区分一年生和二年生植物。在一个优选的实施方 案中，在此测定法中使用本发明的多核苷酸标志物、本发明的一组多核苷酸标志物、或本发 明的引物对。在一个进一步优选的实施方案中，本发明的等位区分测定法包括下列步骤(a) 自要分析的糖用甜菜植物获得基因组DNA的样品，(b)使用本发明的引物对自所述样品或 基因组DNA扩增片段，并(c)比较所扩增的片段与已知与二年生表型有关但与一年生表型 无关的等位序列。在此测定法中，比较步骤(c)的扩增片段的序列与已知与二年生表型有 关的等位基因的序列。若序列与二年生等位基因的序列不同，则这指明一年生等位基因 (即一年生植物)的存在。在另一个优选的实施方案中，用包含对一年生等位基因特异性的 序列的经第一荧光标记的探针分子探查本发明等位区分测定法的步骤c)中获得的扩增片 段。若第一探针的染料荧光在反应过程中升高，则这指明一年生等位基因的存在。在一个优选的实施方案中，本发明的测定法采用(a)用于扩增包含SNP#2334的片 段的如SEQ ID NO :49中所描述的正向引物raR7(T6)-F和如SEQID NO :50中所描述的反向 引物PRR7(T6)-R和如SEQ ID NO :51中所描述的探针分子PRR7 (T6)-VIC作为用作为第一荧 光染料的VIC标记的第一探针分子和如SEQ ID NO 52中所描述的探针分子PRR7 (T6) -FAM 作为用作为第二荧光染料的FAM标记的第二探针分子；或(b)用于扩增包含SNP#160的 片段的如SEQ ID NO 13中所描述的正向引物PRR7 (Tl)-F和如SEQ ID NO :14中所描述 的反向引物PRR7 (Tl)-R和如SEQ ID NO :15中所描述的探针分子PRR7 (Tl)-VIC作为用 作为第一荧光染料的VIC标记的第一探针分子和如SEQ ID NO :16中所描述的探针分子 PRR7 (Tl)-FAM作为用作为第二荧光染料的FAM标记的第二探针分子；或(c)用于扩增片段 的如SEQ ID NO 55中所描述的正向引物lr22(Tl)_F和如SEQ ID NO 56中所描述的反向 引物lr22(Tl)-R和如SEQ ID NO :57中所描述的探针分子lr22 (Tl)-VIC作为用作为第一荧 光染料的VIC标记的第一探针分子和如SEQ ID N0:58中所描述的探针分子lr22(Tl)-FAM 作为用作为第二荧光染料的FAM标记的第二探针分子。在一个实施方案中，本发明涉及一种在商业种子中鉴定一年生污染物的方法，其 使用依照本发明的和如上文所描述的基于标志物的等位区分测定法来进行。附图简述MM
图1 不同物种间的REC域和糖用甜菜EST CV301305的推定REC域的氨基酸 序列比较。相同的氨基酸以黑色标示；保守的氨基酸以灰色标示；弱相似的氨基酸以 浅灰色标示；而不相似的氨基酸以白色标示。Bb，支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica) ；Bs，才古草芽子包杆菌(Bacillus subtilis) ；Bv，舌甘菜(Beta vulgaris)； Ec，大肠埃希氏菌/大肠杆菌(Escherichia coli) ；Kp，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) ；Pa，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) ；Re，荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus) ；Sc,天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor) ；Sf,弗氏志贺氏菌 (Shigella flexneri) ；St,鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。图2 拟南芥PRR7蛋白质与来自糖用甜菜EST CV301305的预测部分蛋白质的氨 基酸序列比较。相同的氨基酸以黑色标示；相似的氨基酸以灰色标示；而不相似的氨基酸 以白色标示。图3 拟南芥PRR7基因与糖用甜菜EST CV301305之间的基因组和mRNA序列的序 列比对。拟南芥与甜菜之间保守的核苷酸以灰色标示。内含子以长划串代表。图4 糖用甜菜染色体II的遗传学图。染色体右边给出了标志物名称，左边标示 了累积遗传距离。图5 :BvPRR7基因的基因结构的示意图，显示了推定的外显子和内含子。由EST CV301305覆盖的区域以黑色箭头显示了。图6 拟南芥PRR基因家族成员和BvPRR7蛋白质的氨基酸序列比较。相同的氨基 酸以黑色标示；保守的氨基酸以灰色标示；弱相似的氨基酸以浅灰色标示；而不相似的氨 基酸以白色标示。图7 :BvPRR7与来自其它开花植物的相关蛋白质之间的系统发生关系，其通过使 用Neighbor-Joining方法(&iitou和Nei，1987)基于对来自数种植物物种的PRR基因家 族中的多种成员(包括来自糖用甜菜、拟南芥(Arabidopsisthaliana) (T0C1, NP_200946 ； PRR3, NP_568919 ；PRR5, NP_568446 ；PRR7, NP_568107 ；和 PRR9，NP_566085)、稻(Oryza sativa)(PRR37, Q0D3B6),大麦(Hordeum vulgare)(PPD-H1， AAY17586)和普通小麦 (Triticum aestivum) (PPD-D1，ABL09477)的PRR7同系物)的系统发生分析得到。采用 自1000个复制品推导出的自展共有树来代表所分析的分类单位的进化史O^elsenstein， 1985)。折叠与在少于50%的自展复制品中再现的分区对应的分支。在分支的后面显示了 复制树(replicate tree)的百分比，其中相关的分类单位在自展(bootstrap)测试(1000 个复制品)中簇集到一起。该树是按比例绘制的，分支长度的单位与用于推导系统发生树 的进化距离的相同。进化距离是使用Poisson矫正法(Zuckerkandl和Pauling，1965)计 算的，单位为每个位点的氨基酸替代数目。自数据集消除所有含有缺口和缺失数据的位置 (完全缺失选项)。最终的数据集中有总共352个位置。图8:—年生和二年生糖用甜菜植物中BvPRR7的昼夜表达样式。贯穿M小时的 期间每2小时收获叶组织。白色和深灰色背景分别表示光照期和黑暗期。所显示的数据 是来自三份独立生物学样品的均值数值。数值表示为通过几何学平均分析(Vandesompele 等，200 相对于BvI⑶H参照基因标准化的相对表达水平。误差棒士SD。ZT，授时因子 (zeitgeber)时间。图9 一组一年生和二年生植物个体之间的等位区分分析的端点读取。Y和X轴上的数值分别表示FAM染料和VIC染料的荧光水平。VIC染料荧光(X轴)的本质升高仅指明二 年生等位基因(在此图中称为等位基因X)的纯合性。FAM染料荧光的本质(substantial) 升高仅指明一年生等位基因((在此图中称为等位基因Y)的纯合性。两种荧光信号的本质 升高指明杂合性，即具有B基因座杂合性的一年生植物。图10 用于借助RNAi来转基因抑制BvPRR7的二元载体的质粒图。BvPRR7的反向 重复由0.61Λ cDNA片段组成，以由来自马铃薯WMLSl基因第二内含子(Eckes等，1986 ； Vancarmeyt等，1990)分开的反义和有义两种取向克隆在启动子(Norris等，1993)与 Nos终止子之间。选择标志由在HSP80启动子(Brunke和Wilson，1993)控制下的PMI基因 组成。图11 显示在比较BvPRR7的18种一年生和2种二年生等位基因时BvPRR7的启 动子区域中鉴定的多态性的表；依照SEQ ID NO :8编号表中所标示的SNP位置。图12 显示在比较BvPRR7的18种一年生和2种二年生等位基因时BvPRR7的编 码区中鉴定的多态性的表；依照SEQ ID NO 8编号表中所标示的SNP位置。序列SEQIDNO1描述了糖用甜菜EST CV301305的核苷酸序列SEQIDNO2描述了正向引物PRR7-F的核苷酸序列SEQIDNO3描述了反向引物PRR7-R的核苷酸序列SEQID NO 4描述了 BvPRR7等位变体2 (单元型#2)的内含子3的核苷酉変序列SEQIDNO5描述了 BvPRR7等位变体1 (单元型#1)的内含子3的核苷酉変序列SEQID NO 6描述了 BvPRR7内含子3的核苷酸序列及其用于定位的等位变异性SEQIDNO7描述了 BvPRR7的二年生等位基因的基因组核苷酸序列SEQIDNO8描述了包括启动子和终止子区域的BvPRR7的基因组核苷·I序列的核苷酸丨序列。SEQIDNO9描述了 BvPRR7的二年生等位基因的编码区的核苷酸序列SEQIDNO10描述了 BvPRR7的一年生等位基因的编码区的核苷酸序列SEQIDNO11描述了 BvPRR7的二年生等位基因的推定的氨基酉堯序列SEQIDNO12描述了 BvPRR7的一年生等位基因的推定的氨基酉堯序列SEQIDNO13描述了引物PRR7 (Tl)-F的核苷酸序列SEQIDNO14描述了引物PRR7 (Tl)-R的核苷酸序列SEQIDNO15描述了探针PRR7(T1)-VIC的核苷酸序列SEQIDNO16描述了探针PRR7 (Tl)-FAM的核苷酸序列SEQIDNO:17描述了引物GJ131 (Tl)-F的核苷酸序列SEQIDNO18描述了引物GJ131 (Tl)-R的核苷酸序列SEQIDNO19描述了探针GJ131(T1)-VIC的核苷酸序列SEQIDNO20描述了探针GJ131 (Tl)-FAM的核苷酸序列SEQIDNO21描述了引物ED031700(T1)-F的核苷酸序列SEQIDNO22描述了引物ED031700(T1)-R的核苷酸序列SEQIDNO23描述了探针ED031700(T1)-VIC的核苷酸序列SEQIDNO24描述了探针ED031700 (Tl) -FAM的核苷酸序列13
SEQIDNO25描述了引物9_27(T2)-F的核苷酸序列SEQIDNO:26描述了引物9_27(T2)-R的核苷酸序列SEQIDNO27描述了探针9_27(I^)-VIC的核苷酸序列SEQIDNO28描述了探针9_27 (T2) -FAM的核苷酸序列SEQIDNO四描述了引物GJO1 (T1) -F的核苷酸序列SEQIDNO30描述了引物GJOl (Tl)-R的核苷酸序列SEQIDNO31描述了探针GJOI(TI)-VIC的核苷酸序列SEQIDNO32描述了探针GJOl (Tl)-FAM的核苷酸序列SEQIDNO33描述了引物SELA3977的核苷酸序列SEQIDNO:；34描述了引物SELA3988的核苷酸序列SEQIDNO:35描述了引物SELA4442的核苷酸序列SEQIDNO:36描述了引物SELA3809的核苷酸序列SEQIDNO37描述了引物SELA3810的核苷酸序列SEQIDNO38描述了引物SELA3807的核苷酸序列SEQIDNO:39描述了引物SELA3766的核苷酸序列SEQIDNO40描述了引物SELA3769的核苷酸序列SEQIDNO41描述了引物SELA3857的核苷酸序列SEQIDNO42描述了引物SELA3860的核苷酸序列SEQIDNO43描述了引物SELA3861的核苷酸序列SEQIDNO44描述了引物SELA3864的核苷酸序列SEQIDNO45描述了用于基因表达分析的正向引物BvPRR7的核苷菌δ序列SEQIDNO46描述了用于基因表达分析的反向引物BvPRR7的核苷菌δ序列SEQIDNO47描述了用于基因表达分析的正向引物BvICDH的核苷菌δ序列SEQIDNO48描述了用于基因表达分析的反向引物BvICDH的核苷菌δ序列SEQIDNO49描述了引物PRR7(T6)-F的核苷酸序列SEQIDNO50描述了引物PRR7(T6)-R的核苷酸序列SEQIDNO51描述了探针PRR7 (T6)-VIC的核苷酸序列SEQIDNO52描述了探针PRR7 (T6) -FAM的核苷酸序列SEQIDNO:53描述了一年生PRR7等位基因中在其启动子区下游约1，31Λ的编码区的核苷酸序列SEQIDNO力4描述了 BvPRR7的一年生等位基因的编码区的核苷環_序列，所述BvPRR7包含约1，31Λ的其启动子区和约0. 7kb的其终止子区域SEQIDNO55描述了引物lr22(Tl)-F的核苷酸序列SEQIDNO56描述了引物lr22(Tl)-R的核苷酸序列SEQ ID NO :57描述了探针lr22(Tl)_VIC的核苷酸序列SEQ ID NO :58描述了探针lr22(Tl)_FAM的核苷酸序列定义如果本文中下文没有另外指明，一般给予本申请范围内使用的技术术语和表述以 植物分子生物学有关领域中通常应用于它们的含义。
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”、和“所述”、 “该”包括复数称谓，除非上下文另外明确指明。如此，例如，提到“一株/种植物”包括一或 多株/种植物，而提到“一个/种细胞”包括细胞、组织、等等的混合物。“糖用甜菜”指甜菜(Beta)属内的所有种和亚种，以及甜菜的所有种类栽培甜 菜。已经将栽培的甜菜分成四组叶甜菜(leaf beet)、菜用甜菜(gardenbeet)、饲料甜菜 (fodder beet)和糖用甜菜(sugar beet)。“糖用甜菜”也指所有栽培甜菜，包括那些为制 糖以外的目的(诸如乙醇、塑料或工业产品)而种植的。具体而言，“糖用甜菜”指饲料甜菜 和糖用甜菜，但是尤其指糖用甜菜。此术语还包括适合于在热带或亚热带地区生长的糖用 甜菜植物。“一年生糖用甜菜系”指以杂合或纯合状态在B基因座处含有显性等位基因B的糖 用甜菜植物。“二年生糖用甜菜系”指以纯合状态在B基因座处含有隐性等位基因b的糖用甜菜 植物。“抽苔”指自营养性莲座阶段向花序或生殖性生长阶段的转换。如本文中所使用的，“延迟的抽苔”或“抽苔的延迟”必须理解为调控糖用甜菜植 物的天然抽苔反应。在具有延迟的抽苔的植物中，作为抽苔的第一可见步骤的茎伸长比在 正常植物中开始得晚。抽苔反应可以延迟仅几天(即，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13或14 天)和多至数周(即2、3、4周)或数月(即1、2、3、5、或6个月)。抽苔的延迟还可以导致 对抽苔响应的完全抑制；此类植物在春化后不抽苔，而且展现出非抽苔表型。如本文中所使用的，“B基因”指负责决定糖用甜菜中的一年生习性(早期抽苔) 的基因。携带显性等位基因B的植物能够以不依赖于春化的方式自幼年期转变成生殖期， 即在没有先前暴露于冷温度的情况中进行枝条伸长，接着开花。“春化”指有些植物中将植物暴露于冷一段时间促进成花诱导的过程。“等位基因”在本发明范围内理解为指与不同形式的基因或任何种类的可鉴定遗 传元件有关的各种遗传单元的交替形式，因为它们位于同源染色体中的相同基因座，所以 它们在遗传方面是交替的。在二倍体细胞和生物体中，给定基因(或标志物)的两个等位 基因通常占据一对同源染色体的对应基因座。如本文中所使用的，术语“单元型”指个体自一个亲本遗传的一组等位基因。如 此，二倍体个体具有两份单元型。术语“单元型”可以以更有限的意义使用，指与表型性状 (诸如本发明的上下文中的糖用甜菜植物的一年生或二年生抽苔习性)有关的物理上连锁 的和/或不连锁的遗传标志物(例如序列多态性)。关于B基因，此基因的单元型还直接赋 予表型。例如，糖用甜菜的一年生生长习性是由染色体II上基因座B的显性等位基因的存 在引起的。“基因座”在本发明范围内理解为指染色体上包含基因或任何其它促成性状的遗 传元件或因子的区域。如本文中所使用的，短语“遗传标志物”指与一个或多个感兴趣基因座有关的个体 基因组特征(例如存在于个体基因组中的核苷酸或多核苷酸序列)。在一些实施方案中，遗 传标志物在感兴趣群体和由多态性占据的基因座中是多态性的，这取决于上下文。遗传标 志物包括例如单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失、简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、切割扩增多态性序列(CAPS)标志物、多样性阵列 技术(DArT)标志物、和扩增片段长度多态性(AFLP)、等许多其它例子。遗传标志物可以用 于例如在染色体上定位含有促成表型性状表达变应性的等位基因的遗传基因座。短语“遗 传标志物”还可以指与基因组序列互补的多核苷酸序列，诸如用作探针的核酸序列。遗传标志物可以在物理上位于染色体上与它相关的遗传基因座之内或之外的位 置中(即分别是基因内的或基因外的)。换言之，虽然当与感兴趣基因座对应的基因在染色 体上的位置尚未鉴定且遗传标志物和感兴趣基因座之间的重组率非零时通常采用遗传标 志物，但是当前公开的主题也可以采用在物理上在遗传基因座边界内的遗传标志物(例如 在与基因对应的基因组序列之内，诸如但不限于基因内含子或外显子内的多态性)。在当前 公开的主题的一些实施方案中，一种或多种遗传标志物包含1-10种标志物，而在一些实施 方案中，一种或多种遗传标志物包含超过10种遗传标志物。如本文中所使用的，短语“表型性状”指个体源自其基因组与环境相互作用的外观 或其它可检测特征。“表型”在本发明范围内理解为指遗传控制性状的可区分特征。如本文中所使用的，术语“紧密连锁的”或“遗传上紧密连锁的”在糖用甜菜基因组 中与B基因连锁的基因组区域的上下文中理解为指所述基因组区域和B基因在遗传力上紧 密联合，这是由于同一染色体上接近的两者的位置，其通过基因座之间的百分比重组(厘 摩，cM)来测量。如本文中所使用的，术语“连锁”及其语法变型指同一染色体上不同基因座 处的等位基因一起分离(共分离)的趋势比在它们的传递是独立的情况中偶然会预期的趋 势更频繁。如本文中所使用的，短语“信息片段”指具有可回收的且能帮助测定和/或表征感 兴趣遗传基因座的信息内容的多核苷酸片段。此信息内容可以由与所述感兴趣基因座有关 的多态性来代表，诸如例如单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失、简单序列重复(SSR)、限制 性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、切割扩增多态性序列(CAPS)标志 物、多样性阵列技术(DArT)标志物、和扩增片段长度多态性(AFLP)、等许多其它例子，而且 可用于开发遗传标志物。此类“信息片段”的信息内容也可以由能通过相应探针分子来检 测的特定序列来代表。此类信息片段可以是引物或标志物或其部分。此类片段具有至少10 个核苷酸，优选至少15、20、25、30、50、或100个核苷酸的长度。“基于标志物的选择”在本发明范围内理解为指使用遗传标志物来检测一种或多 种来自植物的核酸，其中所述核酸与期望性状有关以鉴定携带关于期望(或不期望)性状 的基因的植物，使得那些植物可用于(或避免用于)选择性育种程序。"PCR (聚合酶链式反应)”在本发明范围内理解为指生成相对较大量的DNA特定区 域的方法，由此使得各种基于那些区域的分析成为可能。“PCR引物”或“引物”在本发明范围内理解为指特定DNA区域的PCR扩增中使用 的分离的单链DNA的短片段。通过核酸杂交将它们与互补的靶DNA链退火以形成引物与靶 DNA链之间的杂合物，然后通过聚合酶诸如DNA聚合酶沿着靶DNA链延伸。可以使用引物 对或组来扩增核酸分子，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规的核酸扩增方法来进 行。引物一般长10-15个核苷酸或更多。引物还可以长至少20个核苷酸或更多，或至少25 个核苷酸或更多，或长至少30个核苷酸或更多。此类引物在高严格杂交条件下与靶序列特16异性杂交。依照本发明的引物可以具有与靶序列的完全序列互补性。要理解的是，本发明 引物的长度可以是本文中规定的数值之间的任何数值。如此，一般长10-15个核苷酸或更 多的引物涵盖具有10、11、12、13、14、或15个核苷酸的长度的引物，而表述“至少20个核苷 酸”进一步包括具有16、17、18、19或更多个核苷酸的长度的引物。其适用于表述“至少25 个核苷酸或更多”和“长至少30个核苷酸或更多”。如本文中所使用的，术语“扩增的”意指使用至少一种核酸分子作为模板构建多拷 贝的核酸分子或与核酸分子互补的多拷贝。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连 接酶链式反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、 Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)、和链置换扩增(SDA)。参见例如Diagnostic Molecular Microbiology :Principles and Applications, D. H. Persing 等编，American Society forMicrobiology, Washington, D. C. (1993)。扩增产物称作扩增子。“探针”是附着有常规的可检测标记物或报告分子诸如放射性同位素、配体、化学 发光剂、荧光标记物或酶的分离的核酸。此类探针与靶核酸的链互补。依照本发明的探针 不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包括聚酰胺和其它探针材料，它们特异性结合 靶DNA序列，而且可以用于检测所述靶DNA序列的存在。引物和探针一般长10-15个核苷酸或更多。引物和探针也可以长至少20个核苷酸 或更多，或至少25个核苷酸或更多，或长至少30个核苷酸或更多。此类引物和探针在高严 格杂交条件下与靶序列特异性杂交。依照本发明的引物和探针可以具有与靶序列的完全序 列互补性，虽然可以通过常规的方法来设计与靶序列不同且保留与靶序列杂交的能力的探 针。要理解的是，本发明引物和探针的长度可以是本文中规定的数值之间的任何数值。如 此，一般长10-15个核苷酸或更多的引物和探针涵盖具有10、11、12、13、14、或15个核苷酸 的长度的引物和探针，而表述“至少20个核苷酸”进一步包括具有16、17、18、19或更多个 核苷酸的长度的引物和探针。其适用于表述“至少25个核苷酸或更多”和“长至少30个核 苷酸或更多”。“多态性”在本发明范围内理解为指群体中存在两种或更多种形式的基因、遗传标 志物、或遗传性状。“单核苷酸多态性”或“SNP”在本发明的范围内理解为指在基因组中的单个核苷酸 (或其它共享的序列)在物种的成员间或个体中配对的染色体间有所不同时发生的DNA序 列变异。来自在单个核苷酸上含有差异的不同个体的两种测序的DNA片段称作两种等位基 因。优选地，SNP仅具有两种等位基因。术语“多核苷酸”在本文中理解为指由含有糖、磷酸根和碱基(或是嘌呤或是嘧 啶)的单体(核苷酸)构成的高分子量的聚合物分子，其可以是单链的或双链的。“多核苷 酸片段”是给定多核苷酸分子的一部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质， 而核糖核酸(RNA)涉及将DNA内所含信息转移至蛋白质。“基因组”是生物体的每个细胞中 所含遗传物质的整体。如此，术语“多核苷酸”指DNA或RNA聚合物，其可以是单链的或双链 的，任选含有能够掺入DNA或RNA聚合物的合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。除非另 外指明，本发明的特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰变体(例如简并密码子替代)和 互补序列，就像明确指明的序列。具体而言，简并密码子替代可通过生成其中一个或多个选 定(或所有)密码子的第三位用混和碱基和/或脱氧肌苷残基替代的序列来实现(Batzer等，1991 ；Ohtsuka等，1985 ；Rossolini等，1994)。术语多核苷酸与核酸、核苷酸序列可互换 使用，而且可包括基因、由基因编码的mRNA、cDNA等。在本发明的核酸分子的上下文中使用时，术语“分离的”指在各自的来源生物体 内在其染色体核酸序列背景内鉴定的和自其染色体核酸序列背景分离/分开的核酸序列。 分离的核酸不是像它在其天然背景中出现的那样的核酸，如果它确实有天然存在对应物的 话。比较而言，未分离的核酸是以它们在自然界中存在的状态找到的核酸诸如DNA和RNA。 例如，在宿主细胞染色体上在接近邻近基因处找到给定的DNA序列(例如基因)。分离的核 酸序列可以以单链或双链形式存在。或者，它可以含有有义和反义链两者(即核酸序列可 以是双链的)。如果在植物基因组的背景中要求保护，本发明的核酸分子与天然存在对应物 的区别在于基因组中的插入位点和插入位点处的侧翼序列。在一个优选的实施方案中，本 发明的核酸分子理解为分离的。如本文中所使用的，短语“核酸”指能与核苷酸串(或链)对应的，单体单元的任何 物理串，包括核苷酸聚合物(例如典型的DNA或RNA聚合物)、修饰的寡核苷酸(例如包含 对于生物学RNA或DNA而言不是典型的碱基的寡核苷酸，诸如2’-0_甲基化寡核苷酸)、诸 如此类。在一些实施方案中，核酸可以是单链的、双链的、多链的、或其组合。除非另外指明， 当前公开主题的特定核酸序列任选在任何明确指明的序列之外还包含或编码互补序列。术语“基因”广泛用于指与生物学功能有关的任何核酸区段。如此，基因包括其表 达需要的编码序列和/或调控序列。例如，基因指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白 质且包括调控序列的核酸片段。基因还包括不表达的DNA区段，其例如形成其它蛋白质的 识别序列。基因可以自多种来源分离，包括自感兴趣来源分离或自已知或预测序列信息合 成，而且可以包括设计成具有期望参数的序列。如本文中所使用的，“表达盒”意指能够在合适的宿主细胞中指导特定核苷酸序列 表达的核酸分子，其包含与感兴趣的核苷酸序列可操作连接的启动子，所述感兴趣的核苷 酸序列与终止信号可操作连接。典型地，它还包含核苷酸序列的正确翻译所需要的序列。表 达盒还可以包含直接表达感兴趣的核苷酸序列不必要的但由于便于自表达载体除去该盒 的限制性位点而存在的序列。包含感兴趣核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着至少 一种其构件就至少一种其其它构件而言是异源的。表达盒还可以是天然存在的但已经以可 用于异源表达的重组形式获得的表达盒。典型地，然而，表达盒对于宿主而言是异源的，即 表达盒的特定核酸序列在宿主细胞中不天然存在，而且必须已经通过本领域中已知的转化 方法导入宿主细胞或宿主细胞的祖先中。表达盒中核苷酸序列的表达可以在组成型启动子 或诱导型启动子的控制下，所述诱导型启动子仅在将宿主暴露于某些特定的外部刺激物时 启动转录。在多细胞生物体诸如植物的情况中，启动子也可以是对特定组织、或器官、或发 育阶段特异性的。表达盒或其片段在转化入植物中时也可以称为“插入的序列”或“插入序 列，，。术语“表达”在用于提及核酸序列诸如基因时指将基因中编码的遗传信息经由基 因的“转录”(即经由RNA聚合酶的酶促作用)转化成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、或snRNA) 和在可适用的情况(此时基因表达蛋白质)中经由mRNA的“翻译”转化成蛋白质的过程。 可以在该过程中的许多阶段调节基因表达。术语“嵌合基因”指含有以下各项的任何基因1)没有在自然界中一起找到的DNA序列，包括调控和编码序列，或幻编码天然不相连的、蛋白质各部分的序列，或幻天然不相 连的、启动子各部分。因而，嵌合基因可包含自不同来源衍生的调控序列和编码序列，或包 含自相同来源衍生的但以与在自然界中找到的方式不同的方式排列的调控序列和编码序 列。“转基因”指已经通过转化导入基因组中并稳定维持的基因。转基因可包括例如对 于要转化的特定植物的基因而言异源或同源的基因。另外，转基因可包含插入非天然生物 体的天然基因，或嵌合基因。“转化”是用于将异源核酸导入宿主细胞或生物体的方法。具体地，“转化”意指DNA 分子稳定整合入感兴趣的生物体的基因组中。“转化的/转基因的/重组的”指其中已经导入异源核酸分子的宿主生物体诸如 细菌或植物。可以将核酸分子稳定地整合入宿主的基因组中或者核酸分子也可以以染色 体外分子存在。此类染色体外分子可以是自主复制的。经转化的细胞、组织、或植物理解 为不仅涵盖转化方法的终产物，而且还涵盖其转基因后代。“未转化的”、“非转基因的”、 “非重组的”宿主指野生型生物体，例如细菌或植物，其不含异源核酸分子。如本文中所使 用的，“转基因的”指如下的植物、植物细胞、或众多结构化的(structured)或非结构化的 (unstructured)植物细胞，其具有经由遗传操作和基因插入的公知技术在与通常存在于 天然植物或植物细胞中的基因座不同的基因座处或以比通常存在于天然植物或植物细胞 中的拷贝数目大的拷贝数目整合入植物基因组中，并且通常整合入细胞核、线粒体或其它 含有染色体的细胞器的染色体中的代表感兴趣基因的核酸序列。与天然存在的突变形成 对比，转基因植物源自操作和插入此类核酸序列以生成非天然存在的植物或具有非天然存 在的基因型的植物。用于转化植物和植物细胞的技术是本领域中公知的，并且可以包括例 如电穿孔、显微注射、土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、和弹道转化(ballistic transformation) 0术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。“编码序列”指编码特定氨基酸序列且排除非编码序列的DNA或RNA序列。它可构 成“不中断的编码序列”，即缺少内含子，诸如cDNA，或者它可包括一个或多个以适宜剪接点 为界的内含子。“内含子”是包含在初级转录物中但经由细胞内为创建能翻译成蛋白质的成 熟mRNA对RNA的切割和再连接被切除的RNA序列。“启动子”指通常位于其编码序列上游(5’ )的核苷酸序列，其通过提供正确转录 需要的RNA聚合酶识别和其它因子来控制编码序列的表达。“启动子”包括最小启动子，它 是由TATA框和承担规定转录起始位点的其它序列构成的短DNA序列，向其添加用于控制表 达的调控元件。“启动子”还指包括最小启动子加能够控制编码序列或功能性RNA表达的 调控元件的核苷酸序列。此类启动子序列由近端和更多远端上游元件组成，后一类元件常 常称作增强子。因而，“增强子”是能刺激启动子活性的DNA序列，而且可以是启动子的内 在元件或为了增强启动子的水平或组织特异性而插入的异源元件。它能够以两个方向(正 常的或倒转的)运转，而且甚至在移动到启动子上游或下游时仍能够运行。增强子和其它 上游启动子元件都结合介导其效应的序列特异性DNA结合蛋白。启动子可以整体衍生自天 然基因，或者由自在自然界中找到的不同启动子衍生的不同元件构成，或者甚至由合成DNA 区段构成。启动子还可以含有涉及响应生理或发育条件控制转录起始效率的蛋白质因子的结合的DNA序列。“起始位点”是围绕作为所转录序列一部分的第一个核苷酸(也定义为+1位置) 的位置。就此位点而言，对基因及其控制区的所有其它序列编号。下游序列(即3’方向的 其它蛋白质编码序列)命名为正数，而上游序列(主要是5’方向的控制序列)命名为负值。在上游激活缺失的情况中没有活性或具有大大降低的启动子活性的启动子元件， 特别是TATA元件称作“最小或核心启动子”。在存在合适转录因子的情况中，最小启动子发 挥允许转录的功能。如此，“最小或核心启动子”仅仅由转录起始需要的所有基础元件(例 如TATA框和/或起始子)组成。“组成性表达”指使用组成性或可调型启动子的表达。“条件性”和“可调型表达” 指由可调型启动子控制的表达。“组成型启动子”指能够在所有或几乎所有植物组织中在植物的所有或几乎所有 发育阶段期间表达它控制的可读框(ORF)的启动子。每一个转录激活元件不显示绝对组织 特异性，但是在大多数植物部分中以转录最有活性的植物部分中达到的水平以上的水 平介导转录激活。“可调型启动子”指以不是组成性的，而是时间和/或空间受调控的方式指导基因 表达的启动子，而且包括组织特异性的和诱导型的启动子。它包括天然的和合成的序列，以 及可以是合成序列与天然序列的组合的序列。不同启动子可以在不同组织或细胞类型中、 在发育的不同阶段、或响应不同环境条件指导基因表达。不断地发现在植物细胞中有用的 各种类型新启动子，众多例子可见于汇编Okamuro等(1989)。在植物中有用的典型的可调 型启动子包括但不限于安全剂可诱导的启动子、自四环素可诱导系统衍生的启动子、自水 杨酸可诱导系统衍生的启动子、自醇可诱导系统衍生的启动子、自糖皮质激素可诱导系统 衍生的启动子、自病原体可诱导系统衍生的启动子、和自蜕皮激素可诱导系统衍生的启动 子。“组织特异性启动子”指不是在所有植物细胞中表达，而是只在特定器官(诸如叶 或种子)、特定组织(诸如胚或子叶)、或特定细胞类型(诸如叶薄壁组织或种子贮藏细胞) 的一种或多种细胞类型中表达的可调型启动子。这些还包括时间受调控的启动子，诸如在 胚胎发生的早期或晚期、在种子或果实发育中果实成熟期间、或在完全分化的叶中、或在衰 老开始时。“诱导型启动子”指那些能在一种或多种细胞类型中被外部刺激(诸如化学制品、 光、激素、压力、或病原体)开启的可调型启动子。“可操作连接”指单一核酸片段上各核酸序列的联系，使得一核酸序列的功能受到 另一核酸序列的影响。例如，若调控DNA序列和编码RNA或多肽的DNA序列的定位使得调控 DNA序列影响编码DNA序列的表达(即编码序列或功能性RNA处于启动子的转录控制下)， 则说这两序列“可操作连接”或“相关”。编码序列可以以有义或反义取向与调控序列可操 作连接。“表达”指内源基因、ORF或其部分的、或转基因在植物中的转录和/或翻译。例如， 就反义构建体而言，表达可以仅仅指反义DNA的转录。另外，表达指有义(mRNA)或功能性 RNA的转录和稳定积累。表达还可以指蛋白质的生成。“过表达”指转基因细胞或生物体中的表达水平超过正常或未转化(非转基因)细胞或生物体中的表达水平。“反义抑制”指能够抑制自内源基因或转基因表达蛋白质的反义RNA转录物的生 成。“基因沉默”指对病毒基因、转基因、或内源细胞核基因的，同源性依赖性抑制。基 因沉默可以是转录的，这时抑制是由于受影响基因的转录降低，或者是转录后的，这时是由 于与受影响基因同源的RNA种类的周转(降解)升高。基因沉默包括病毒诱导的基因沉默。"RNA干扰”(RNAi)指植物和动物中由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录 后基因沉默的过程。各种术语诸如siRNA、靶RNA分子、切酶或核糖核酸酶III酶是本领域 技术人员已知的概念，并且与RNAi有关的这些术语和其它概念的全面描述可以参见文献。 理解的是，描述RNAi机制的任何特定假设对于实施本发明不是必需的。术语“siRNA”指短干扰RNA。在一些实施方案中，siRNA包含长约21_23个核苷酸 的双链体或双链区；siRNA在每条链的3’端处常含有约2-4个未配对的核苷酸。siRNA的 双链体或双链区的至少一条链与靶RNA分子基本上同源或基本上互补。与靶RNA分子互补 的链是“反义链”；与靶RNA分子同源的链是“有义链”，而且还与siRNA反义链互补。siRNA 还可以含有别的序列；此类序列的非限制性例子包括连接序列、或环，以及茎和其它折叠结 构。siRNA表现为在无脊椎动物和脊椎动物中触发RNA干扰中和在植物中在转录后基因沉 默过程中触发序列特异性RNA降解中起关键媒介物的作用。“dsRNA”或“双链RNA”是具有两条互补链的RNA，其经由称为RNA干扰(RNAi)的 过程指导mRNA的序列特异性降解。将dsRNA切成干扰特定基因表达的siRNA。术语“靶RNA分子”指与siRNA(或dsRNA)的短双链区的至少一条链同源或互补 的RNA分子。典型地，在此类同源性或互补性在至少21个核苷酸的区段里是约100%时， siRNA能够沉默或抑制靶RNA分子的表达。虽然认为经加工的mRNA是siRNA的靶物，本发 明不限于任何具体的假设，而且此类假设对于实施本发明不是必需的。如此，涵盖的是，其 它RNA分子也可以是siRNA的靶物。此类RNA靶分子包括未加工的mRNA、核糖体RNA、和病 毒RNA基因组。靶RNA分子与dsRNA之间在dsRNA的整个长度里有100%的同源性不是必 要的，但是dsRNA的发夹应当包含至少21个核苷酸，优选至少23个核苷酸，更优选至少50 个核苷酸，甚至更优选至少500个核苷酸，最优选至少700个核苷酸，和多至1000个核苷酸 的区段，其与靶RNA分子间具有至少95%，优选100%的同源性。如本文中所使用的，术语“杂交”指常规杂交条件，优选如下的杂交条件，其中使用 5x SSPE,1% SDS, Ix Denhardts溶液作为溶液和/或杂交温度介于35°C和70°C之间，优 选65°C。杂交后，优选首先用h SSC，1% SDS进行清洗，随后用0. SSC进行清洗，温度 介于35°C和75°C之间，特别是介于45°C和65°C之间，但是尤其是59°C (关于SSPE、SSC和 Denhardts溶液的定义参见Sambrook等见上文)。举例而言，Sambrook等，见上文中记载 的高严格性杂交条件是特别优选的。例如，若如上所述于65°C进行杂交和清洗，则存在特别 优选的严格杂交条件。例如，于45°C进行杂交和清洗的非严格杂交条件优选程度较低，而 35 °C甚至更低。“序列同源性或序列同一性”在本文中可互换使用。处于“相同”或百分比“同一 性”在两种或更多种核酸或蛋白质序列的语境中指在为了最大对应而比对或比较时，如使 用下述序列比较算法之一或通过肉眼检查所测量的，两种或更多种序列或亚序列是相同的或具有特定百分比的、相同的氨基酸残基或核苷酸。若要彼此比较的两种序列长度不同，则 序列同一性优选涉及较短序列中与较长序列的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。序 列同一性可使用计算机程序诸如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park,575Science Drive Madison, WI 53711)常规测定。Bestfit 利用 Smith 和 Waterman，Advances in Applied Mathematics 2 (1981)，482-489的局部同源性算法来寻找两种序列间具有最高序 列同一性的区段。在使用Bestfit或另一种序列比对程序来测定特定序列是否与本发明参 比序列具有例如95%同一性时，优选调整参数使得在参比序列全长上计算同一性百分比且 容许参比序列中有占核苷酸总数多至5%的同一性缺口。在使用Bestfit时，所谓的任选参 数优选保留它们的预设(“默认/缺省”)值。在给定序列与上文所述本发明序列之间的比 较中出现的偏差可能是由添加、缺失、替代、插入或重组引起的。优选的是，此类序列比较也 可以用程序“fasta20u66” (2. 0u66版，1998年9月，William R. Pearson和弗吉尼亚大学； 还可参见Pearson，1990，所附例子和http //workbench, sdsc. edu/)进行。为此目的，可使 用“缺省”参数。两种核酸序列基本上相同的另一项指标是这两种分子在严格条件下彼此杂交。短 语“特异性杂交”指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(例如总细胞DNA或RNA)中时， 在严格条件下一种分子只与该序列结合、形成双链、或杂交。“基本上结合”指探针核酸与靶 核酸之间的互补性杂交，而且涵盖微小错配，其可以通过降低杂交介质的严格性来容许，用 以实现对靶核酸序列的期望检测。“严格条件”、“严格杂交条件”或“严格杂交清洗条件”在核酸杂交实验诸如 Southern和Northern杂交的语境中包括提及探针会以比对其它序列可检出地更大程度 与其靶序列杂交的条件。严格条件是靶序列依赖性的，而且在不同环境参数下是不同的， 并且会随多核苷酸的结构而有所不同。较长的序列在较高的温度特异性杂交。关于核 酸杂交的广泛指导可参见 Tijssen P. , 1993Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,第 I 部分，第 2 章 “Overviewof principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，，Elsevier, New York ；禾口 Current Protocols in Molecular Biology,第 2 章， Ausubel 等编，Greene Publishing and Wiley-Interscience :New York(1995),及还有 Sambrook等(2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第 5版CoIdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。特异性通常是杂交后清洗的功能，关键的因素是最终清洗溶液的离子强度和温 度。一般而言，高度严格杂交和清洗条件选择成比特定序列在限定离子强度和PH的热解链 点(Tm)低大约5°。典型的是，在“严格条件”下，探针会与其靶亚序列杂交，但不与其它序 列杂交。Tm是50%的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和pH下)。 很严格的条件选择成等于特定探针的Tm。具有超过100个互补残基的互补核酸在滤器上 在Southern或Northern印迹中的杂交的严格杂交条件的一个例子是50%甲酰胺及Img肝 素，杂交于42 °C进行过夜。通常，高严格清洗之前有低严格清洗以消除背景探针信号。高度严格的清洗条件22的一个例子是0. 2x SSC于65°C清洗15分钟(关于SSC缓冲液的说明参见Sambrook，见下 文)，而非常高度严格的清洗条件的例子是0. 15M NaCl于72°C达约15分钟。用于例如超 过100个核苷酸的双链体的中等(中间)严格性清洗的一个例子是Ix SSC于45°C达15分 钟。用于例如超过100个核苷酸的双链体的低严格清洗的一个例子是4-6x SSC于40°C15 分钟。对于短探针(例如大约10-50个核苷酸)，严格条件通常涉及低于大约1. OM Na离 子、通常大约0.01-1. OM Na离子浓度(或其它盐)的盐浓度，于pH 7. 0-8. 3，而且温度通 常是至少大约30°C。严格条件还可以通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。一般而言，特 定杂交测定法中用无关探针观察到的信噪比2倍(或更高)的信噪比指示检测到特异性杂 交。若由核酸编码的蛋白质基本上相同，则在严格条件下彼此不杂交的核酸仍然是基本上 相同的。这发生于例如使用遗传密码容许的最大密码子简并性来创建核酸拷贝的时候。以下是杂交/清洗条件的例示性组，其可以用于杂交与本发明的参照核苷酸序 列基本上相同的核苷酸序列优选地，参照核苷酸序列在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中于50°C与参照核苷酸序列杂交，其中在2X SSC、0. 1% SDS中于50°C清 洗，更期望地在十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中于50°C杂交，其中在 IX SSC、0. 1% SDS中于50°C清洗，更期望地仍在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M NaPO4, ImMEDTA中于50°C杂交，其中在0. 5X SSC、0. 1 % SDS中于50°C清洗，优选地在7%十二烷基 硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4UmM EDTA 中于 50°C杂交，其中在 0. IX SSC,0. 1%SDS 中于 50°C 清洗，更优选地在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中于50°C杂交，其中在 0. IX SSC、0. 1%SDS中于65°C清洗。可以使用所有上述条件来检测本发明的序列。出于限 定本发明的目的，使用高度严格性条件。“植物”是处于任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。“植物细胞”是植物的结构和生理单元，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是 分离的单细胞或培养的细胞的形式，或者是更高级的、有组织的单元诸如例如植物组织、植 物器官、和完整植株的一部分。“植物细胞培养物”指植物单元，诸如例如原生质体、细胞培养细胞、植物组织中的 细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和各种发育阶段的胚的培养物。“植物材料”指植物的叶、茎、根、花或花的各部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、 插条、细胞或组织培养物、或任何其它部分或产物。这还包括愈伤组织(callus)或愈伤组 织组织以及提取物(诸如来自直根的提取物)或样品。“植物器官”是植物的独特的且明显有结构的且分化的部分，诸如根、茎、叶、花芽、 或胚。如本文中所使用的，“植物组织”指组织成结构和功能单元的一组植物细胞。包括种 植或培养的植物的任何组织。此术语包括但不限于完整植株、植物器官、植物种子、组织培 养物和组织成结构和/或功能单元的任何植物细胞组。此术语在连同上文所列或此定义以 其它方式涵盖的任何特定类型植物组织或在没有任何特定类型植物组织的情况中的使用 并非意图排除任何其它类型的植物组织。如本文中所使用的，术语“育种”及其语法变形指生成后代个体的任何过程。育种 可以是有性的或无性的，或其任意组合。例示性的非限制性类型的育种包括杂交、自交、重 双单倍体衍生物生成、及其组合。“选择性育种”在本发明范围内理解为指使用拥有或显示期望性状的植株作为亲本的育种程序。如本文中所使用的，“发酵”指使用微生物将有机分子转化成另一种分子的过程。 例如，“发酵”可以指需氧转化来自植物材料诸如本发明的植物材料的糖或其它分子以生成 醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如 丙酮)、氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)、抗生素(例如青霉素和四环素)；酶； 维生素(例如核黄素、B12、β -胡萝卜素)；和/或激素。发酵包括可消费醇工业(例如啤 酒和酒)中使用的发酵。发酵还包括厌氧发酵，例如，用于生产生物燃料。可以通过适合于 用于想要的发酵步骤的任何生物体(包括但不限于细菌、真菌、古细菌、和原生生物)来实 现发酵。合适的发酵生物体包括那些能将单糖、二糖、和三糖，特别地葡萄糖和麦芽糖，或任 何其它生物量衍生的分子直接或间接转化成想要的发酵产物(例如乙醇、丁醇等)的生物 体。合适的发酵生物体还包括那些能将非糖分子转化成想要的发酵产物的生物体。此类生 物体和发酵方法对于本领域技术人员是已知的。如本文中所使用的，术语“生物燃料”指由植物材料的需氧或厌氧发酵生成的任何 生物燃料。通过需氧发酵获得的生物燃料的非限制性例子是生物乙醇。可以通过厌氧发酵 获得的生物燃料包括但不限于沼气和/或生物柴油(biodiesel)。需氧和/或厌氧发酵的 方法对于本领域技术人员是已知的。发明详述本发明公开了具有延迟抽苔的表型的转基因糖用甜菜植物。栽培的糖用甜菜是一种二年生植物，其在第一年形成贮藏根和莲座叶。在一段时 间的低温后开始枝条延长(抽苔)和花形成，而一年生甜菜属的许多野生甜菜显示一年生 生长习性，这是由于B基因座处存在抽苔基因B。抽苔基因(B基因)负责决定糖用甜菜中 的一年生习性。认为甜菜物种中的一年生是单基因的且显性的性状。与携带b等位基因的 二年生植物相反，携带显性B等位基因的植物能够以不依赖于春化的方式自幼年期转变成 生殖期，所述二年生植物强制性需要春化进行抽苔，随后发生开花。基因座B的显性等位基 因在野生甜菜中是丰富的，而且在长日照下引起抽苔，无需对于携带隐性等位基因的二年 生栽培种而言通常至关重要的冷要求(Abe等，1997)。本发明人现在使用候选基因办法来鉴定和表征糖用甜菜中推定的抽苔控制基因。 在此办法中，依靠使用BLAST具的同源性搜索将具有登录号CV301305的EST序列鉴定为 PRR7的推定甜菜同源物(参见实施例1. 1)。相应的氨基酸序列显示了假响应调节物接受者 (PRR, pfam00072)或信号接受者(REC，cd00156)域的部分存在(图1)，即均在昼夜节律钟 中起至关重要作用的PRR基因家族的一种标志(Nakamichi等，2005)。图2显示了 CV301305 与PRR7，即其最接近的拟南芥同源物的氨基酸序列比对。如最初在拟南芥中所描述的假响 应调节物7(PRR7)基因是假响应调节物基因家族(PRR1或T0C1、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9) 的成员，所述假响应调节物基因家族都含有两项特征性标记响应调节物接受者(REC)和 CCT域。PRR家族成员的转录水平以昼夜节律方式振荡，这提示其蛋白质与昼夜节律钟紧密 相关。事实上，PRR7在拟南芥中被描述为温度敏感性昼夜节律系统的一种成分(Nakamichi 等，2007 ；&ι1οπι 和McClung 2005)。在植物中，昼夜节律钟牵涉调节许多基础生物学过程， 包括叶运动、光合作用活性的昼间变化和开发时间的光周期控制(Imaizumi和Kay，2006 ； Siou等，2007)。最近，在大麦、小麦和稻(HvPPD、TaPPD和0sraR37)中鉴定和表征PRR7同源物，而且显示为谷物中光周期响应的主要决定子。在本发明的一方面，如此，提供了 BvPRR7的数种一年生和二年生等位基因的序 列，优选地如SEQ ID NO 1、4、5、6、7、8、9、10、53、或M中给定的序列，其编码功能上与B基 因等同的蛋白质。基于EST序列，将约0. 5Kb的部分甜菜PRR7片段扩增并测序(参见实施例1. 1)。 使用自一年生系与对第160位的一种SNP而言多态性的二年生系之间的杂交衍生的198个 个体的F2群体的定位实验显示了染色体II上在GJ131标志物下游IcM的近似距离处的 BvPRR7图(图4)，即已知含有关于不依赖春化的开花的B基因的区域(M5hring等，2004 ； (iaafar等，2005)。标志物测定法的结果显示了 B基因预测基因型与BvPRR7基因基因型之 间的完全匹配(参见实施例1，1)。进一步定位分析的结果，即其定位位置与其与温度敏感 性昼夜节律有关的生物学功能的组合(&ι1οπι 和McClung，2005)显示了 BvPRR7是B基因 的一种强候选物(实施例1. 1)。在下一步中，使用本领域技术人员公知的标准PCR技术来筛选BAC文库以回收糖 用甜菜PRR7基因的全长基因组序列(参见实施例1. 2)。所使用的BAC文库是已经用来自 二年生商业性糖用甜菜栽培种H20的DNA建立的BAC文库。对大小为100-4001Λ的部分 (HindiII)消化的HMW DNA片段进行了两次大小选择。将DNA片段连接入载体pBeloBAC-Kan 中。所述文库含有57，600个克隆，平均插入物大小大约1201Λ，对应于甜菜基因组的8倍覆 盖。通过用单拷贝探针进行的筛选测试了冗余度，而且来自线粒体或质体DNA的克隆的频 率估算为低于1%。对DNA集合后续筛选片段BvPRR7导致携带相应片段的BAC克隆的正鉴 定。为了得到BvPRR7基因的全长序列，使用标准测序技术对先前鉴定的BAC克隆(BAC SBA079-L24)测序。然后可以将两个都与EST CV301305共享序列同源性的非交叠的毗连序 列群组合成一条单序列(SEQ ID NO 8)。基于BAC序列毗连序列群与EST CV301305的比对 及与来自拟南芥的PRR7基因的序列同源性，可预测包含内含子和外显子的甜菜BvPRR7基 因的推定基因结构，如图5所示。基于此预测，基因组序列可显示出跨越整个BvPRR7基因 及ATG终止密码子上游的3. 6kb序列和编码区下游的2. 2kb序列。BvPRR7的相应氨基酸序 列显示于SEQ ID NO 11。BvPRR7氨基酸序列与来自拟南芥的PRR基因家族所有成员(包 括TOCl (PRRl)、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9)的比对说明了氨基末端附近假应答调控物接受 者域(PRR)基序(pfam00072)和羧基末端处CCT基序(pfam06203)的强保守性(图6)。在 来自拟南芥的PRR基因家族之外，BvPRR7还与谷类植物中的PRR7同系物共享强同源性，如 图7所示系统发生树所图示的。谷类植物中的PRR7同系物(更多地称作Ppd)显示出呈现 光周期应答的重大决定子(Turner等，2005 ；Beales等，2007)。尚未证明在糖用甜菜中春 化应答中的作用。基于它们与已知开花时间控制基因的同源性或根据调控蛋白代表性的保守结构 域的存在推导出的调控功能，可以将少数基因鉴定为B基因的潜在候选者。这些基因需要 通过一年生与二年生基因型之间的等位基因变异性和/或基因表达研究或借助使用转基 因办法进行的互补或敲除实验来进一步验证。由B基因赋予的一年生植物习性表现为单 一显性性状；因而二年生植物中对春化的要求是隐性的。如此，将BvPRR7的一年生等位 基因转化入二年生基因型预测将一年生开花行为赋予二年生受体基因型。为了验证此假25说，将在一年生启动子和终止子片段控制下的BvPRR7的一年生等位基因的编码序列转化 入二年生基因型，诸如例如G018(参见实施例2)。转化可通过本领域已知方法来实现，诸 如Chang等，2002所记载的，使用糖用甜菜分生组织作为外植体材料并使用磷酸甘露糖异 构酶(PMI)基因作为选择标志。对转基因枝条检查选择标志的表达，诸如例如PMI活性 (Joersbo等，1998)，随后生根，在土壤中盆载并转移至温室。阴性对照由接受相同体外再生 规程但不进行土壤杆菌感染和选择的非转基因枝条组成。在生长室中种植植物，恒温18°C， 光周期17小时光照和7小时暗。在这些条件(没有通过应用冷温度来诱导抽苔)下，非转 基因二年生对照在多至12周的观察期内不显示任何抽苔迹象，而一年生对照植株通常在6 至8周内开始抽苔。与非转基因二年生对照植株相反，实质性数目的转基因植株在4-10周 内开始抽苔，而且基本上表现为一年生植物，尽管它们具有二年生遗传背景。将抽苔并开花 的转基因植株与二年生保持系交叉授粉以生成后代。对后代植株测试PMI活性，随后在没 有春化的情况中监测抽苔和开花。这些后代植物显示1对1的分离比及PMI活性与一年生 习性之间的完全相关。这些数据证实糖用甜菜中BvPRR7与不依赖春化的开花之间的因果 关系。本发明人进一步发现了 BvPRR7在糖用甜菜的春化响应中起关键的作用，并且如 此可以用于通过抑制春化响应来将抽苔抗性工程化改造入糖用甜菜植物中。在本发明的一 方面，如此，可以在用于生成转基因糖用甜菜植物的转基因方法中使用BvPRR7基因，所述 转基因糖用甜菜植物包含稳定地整合入糖用甜菜基因组中的所述多核苷酸。具体地，自基 因组表达后，可以使用表达产物来调控糖用甜菜植物的春化响应，其通过抑制或下调B基 因的表达来实现。将感兴趣的DNA序列装配入嵌合构建体中，所述嵌合构建体含有要在植物中运行 的调节元件控制下的转基因植物中表达的核酸序列。用于装配此类嵌合构建体的方法是本 领域技术人员公知的。在合适的植物组织中获得足够水平的转基因表达是遗传工程作物生产的一个重 要方面。异源DNA序列在植物宿主中的表达依赖于在所述植物宿主中有功能的可操作连接 的启动子的存在。启动子序列的选择会决定何时和何处在生物体内表达所述异源DNA序 列。例如，可以采用会指导所述基因在再生植物的所有组织中表达的植物启动子片 段。此类启动子在本文中称作“组成性”启动子，而且在大多数环境条件和发育或细胞分 化状态下是有活性的。组成型启动子的例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S转录起始区、 自根癌土壤杆菌T-DNA衍生的1’ -或2’ -启动子、和来自技术人员知道的各种植物基因 的其它转录起始区。此类基因包括例如AP2基因、来自拟南芥的ACTll (Huang等Plant Mol. Biol. 33 125-139 (1996))、来自拟南芥的 Cat3 (GenBank No. U43147 ；Zhong 等，Mol. Gen. Genet. 251 :196-203(1996))、来自欧洲油菜(Brassica napus)的编码硬脂酰-酰 基载体蛋白去饱和酶的基因(Genbank No. X74782 ;Solocombe 等 Plant Physiol. 104 1167-1176 (1994))、来自玉米的 GPcl (GenBank No. X15596 ；Martinez 等 J. Mol. Biol 208 551-565(1989))、和来自玉米的 Gpc2 (GenBank No. U45855 ；Manjunath 等，Plant Mol. Biol. 33 :97-112(1997))。或者，植物启动子可以在特定组织中，或者可以以其它方式在更精确的环境或发育控制下指导本发明核酸分子的表达。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的例子包 括厌氧条件、升高的温度、或光照的存在。此类启动子在本文中称作“诱导型”或“组织特异 性”启动子。技术人员会认识到，组织特异性启动子可以在靶组织以外的组织中驱动可操作 连接的序列的表达。如此，如本文中所使用的，组织特异性启动子指优先在靶组织中驱动表 达，但也可以在其它组织中导致一些表达的启动子。在发育控制下的启动子的例子包括只(或主要只)在某些组织(诸如果实、种子、 或花)中启动转录的启动子。在胚珠、花或种子中驱动核酸表达的启动子是本发明中特别 有用的。如本文中所使用的，种子特异性或优先性启动子指特异性地或优先在种子组织中 指导表达的启动子，此类启动子可以是例如胚珠特异性的、胚特异性的、胚乳特异性的、珠 被特异性的、种皮特异性的、或其组合。例子包括来自胚珠特异性BELl基因的启动子，记载 于 Reiser 等 Cell 83:735-742(1995) (GenBank No. U39944)。其它合适的种子特异性启动 子衍生自下列基因来自玉米的MACl (Sheridan等Genetics 142 1009-1020 (1996))、来 自玉米的 Cat3 (GenBank No. L05934 ；Abler 等 Plant Mol. Biol. 22 10131-1038 (1993))、 来自玉米的编码油质蛋白18kD的基因(GenBank No. J05212 ;Lee等Plant Mol. Biol. 26 1981-1987(1994))、来自拟南芥的 vivparous-1 (Genbank No. U93215)、来自拟南芥的编 码油质蛋白的基因(Genbank No. Z17657)、来自拟南芥的Atmycl (Urao等Plant Mol. Biol. 32 :571-576(1996))、来自拟南芥的2s种子贮藏蛋白基因家族(Conceicao等Plant 5 :493-505(1994))、来自欧洲油菜的编码油质蛋白20kD的基因(GenBankNo. M63985)、来 自欧洲油菜的 napA(GenBank No. J02798 Josefsson 等 JBL26 :12196-1301 (1987))、来自 欧洲油菜的油菜籽蛋白基因(Sjodahl等Planta197 :264-271 (1995))、来自欧洲油菜的编 码2S贮藏蛋白的基因(Dasgupta等Gene 133 :301-302 (199 )、来自大豆的编码油质蛋白 A (Genbank No. U09118)和油质蛋白B (Genbank No.U09119)的基因、及来自大豆的编码低分 子量硫富含蛋白的基因(Choi 等 Mol Gen. Genet. 246 :266-268(1995))。或者，可以鉴定提供具有期望表达特征的启动子或具有表达增强活性的启动子的 具体序列，而且可以经由突变将这些序列或相似序列引入序列中。进一步考虑可以诱变这 些序列以增强它们转基因在特定物种中的表达。此外，组合来自超过一种启动子的元件的启动子也是有用的。例如，美国专利 No. 5，491，288披露了组合花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子与组蛋白启动子。如此，可以将来 自本文中所公开的启动子的元件与来自其它启动子的元件组合。多种5’和3’转录调控序列可用于本发明。转录终止子负责转录终止和正确的 mRNA聚腺苷酸化。3’非翻译调控DNA序列优选包括约50个至约1，000个、更优选约100 个至约1，000个核苷酸碱基对，而且含有植物转录和翻译终止序列。适宜的转录终止子和 已知在植物中有功能的转录终止子包括CaMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子、 豌豆rbcS E9终止子、来自根癌土壤杆菌章鱼碱合酶基因的T7转录物的终止子、和来自马 铃薯或番茄的蛋白酶抑制剂I或II基因的3’末端，但是也可以采用技术人员知道的其它 3’元件。或者，也可以使用伽马coixin、油质蛋白3或来自薏苡属(Coix)的其它终止子。优选的3’元件包括来自根癌土壤杆菌胭脂碱合酶基因的3’元件(Bevan等， 1983)、来自根癌土壤杆菌章鱼碱合酶基因的T7转录物的终止子、和来自马铃薯或番茄的 蛋白酶抑制剂I或II基因的3’末端。
由于转录起始位点与编码序列起点之间的DNA序列(即不翻译的前导序列)能影 响基因表达，所以也可能希望采用特定的前导序列。优选的前导序列包括包含预测指导所 附着基因最佳表达的前导序列，即包括可提高或维持mRNA稳定性和防止不当翻译起始的 优选共有前导序列。本领域技术人员根据本公开内容会知道此类序列的选择。自在植物中 高表达的基因衍生的序列会是最优选的。已经发现在转基因植物中增强基因表达的其它序列包括内含子序列(例如来自 AdhU bronzel、肌动蛋白1、肌动蛋白2 (TO 00/760067)、或蔗糖合酶内含子的)和病毒前 导序列(例如来自TMV、MCMV和AMV的)。例如，已知自病毒衍生的许多非翻译前导序列增 强表达。具体而言，来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)、和苜蓿花叶病毒 (AMV)的前导序列已经显示了在增强表达方面是有效的(例如feillie等，1987 ;SkuZeski 等，1990)。本领域已知的其它前导包括但不限于小RNA病毒前导，例如EMCV前导(脑心 肌炎5非编码区MElroy-Stein等，1989)；马铃薯Y病毒前导，例如TEV前导(烟草蚀纹病 毒)；MDMV前导(玉米矮缩花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导(Macejak 等，1991)；来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导(Jobling等，1987)、 烟草花叶前导(TMV) (Gallie等，1989)；和玉米褪绿斑点(chlorotic mottle)病毒前导 (MCMV) (Lommel 等，1991)。还可参见 Della-Cioppa 等，1987。在期望时，可进一步包括诸如Adh内含子KCallis等，1987)、蔗糖合酶内含子 (Vasil等，1989)或TMV Ω元件(Gallie等，1989)等调控元件。增强子的例子包括来自CaMV 35S启动子、章鱼碱合酶基因(Ellis等，1987)、稻肌 动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因(Callis等，1987)、玉米皱缩I基因(Vasil等，1989)、 TMV Ω元件(feillie等，1989)和来自非植物真核生物的启动子(例如酵母；Ma等，1988)的 元件。一种用于控制表达的主要方法是表达不足。为了表达不足，有两种主要方法，它们 在本领域中常常称作“反义下调”和“有义下调”(有义下调也称作“共抑制”)。一般而言， 这些过程称作“基因沉默”。这两种方法都导致对靶基因表达的抑制。本发明包含用于降低本发明核酸分子的表达、量、活性和/或功能的多种策略。熟 练技术人员领会如下实情，即许多不同方法是可用的，以便以想要的方式影响本发明核酸 分子的表达、量、活性和/或功能。可以提及但不是限制性的例子是“有义”抑制本发明核苷酸序列表达的改变(优选是其表达的降低)是通过“有义”抑制得到 的(参见例如 Jorgensen 等(1996)Plant Mol. Biol. 31，957-973)。在这种情况中，在 DNA 分子中包含整个或部分的本发明核苷酸序列。所述DNA分子优选是可操作连接至在包含靶 基因的细胞(优选植物细胞)中有功能的启动子的，并被导入该核苷酸序列在其中可表达 的所述细胞中。将所述核苷酸序列以“有义取向，，插入所述DNA分子中，这意味着所述核苷 酸序列的编码链能转录。在一个优选的实施方案中，所述核苷酸序列是完全可转录的，而且 所述核苷酸序列中包含的所有遗传信息或其一部分翻译成多肽。在另一个优选的实施方案 中，所述核苷酸序列是部分可翻译的，而且一种短肽得到翻译。在一个优选的实施方案中， 这是通过在所述核苷酸序列中插入至少一个提前终止密码子而实现的，这使得翻译停止。 在另一个更加优选的实施方案中，所述核苷酸序列得到转录，但是没有生成翻译产物。这通常是通过消除由核苷酸序列编码的多肽的起始密码子(例如“ATG”)而实现的。在另一个 优选的实施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分在植物细胞的基因组中稳 定整合。在另一个优选的实施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分包含在 染色体外复制分子中。在包含上文刚刚所述DNA分子之一的转基因植物中，与所述DNA分子中包含的核 苷酸序列对应的核苷酸序列的表达优选是降低的。优选的是，所述DNA分子中的核苷酸序 列与表达得到降低的核苷酸序列至少80%相同，更优选的是，它是至少90%相同的、仍更 优选至少95 %相同的、且最优选至少99 %相同的。“反义”抑制在另一个优选的实施方案中，本发明核苷酸序列表达的改变(优选是其表达的降 低)是通过“反义”抑制得到的。在DNA分子中包含整个或部分的本发明核苷酸序列。所 述DNA分子优选是可操作连接至在植物细胞中有功能的启动子的，并被导入该核苷酸序列 在其中可表达的植物细胞中。将所述核苷酸序列以“反义取向”插入所述DNA分子中，这意 味着所述核苷酸序列的反向互补序列(有时也称作非编码链)能转录。在一个优选的实 施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分在植物细胞的基因组中稳定整合。 在另一个优选的实施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分包含在染色体复 制分子中。为了进一步说明，引用数份描述这种办法的出版物(Green，P.J.等，Ann. Rev. Biochem. 55 :569-597 (1986) ；van der Kro1, A. R.等，Antisense Nuc. Acids&Proteins,第 I25 页-第 141 页(1"1) ；Abel,P. P.等，Proc. Natl. Acad. ki. USA 86 :6949-6952(1989)； Ecker, J. R.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :5372-5376 (Aug. 1986))。在包含上文刚刚所述DNA分子之一的转基因植物中，与所述DNA分子中包含的核 苷酸序列对应的核苷酸序列的表达优选是降低的。优选的是，所述DNA分子中的核苷酸序 列与表达得到降低的核苷酸序列至少80%相同，更优选的是，它是至少90%相同的、仍更 优选至少95 %相同的、且最优选至少99 %相同的。同源重组在另一个优选的实施方案中，至少一个与本发明核苷酸序列对应的基因组 拷贝通过同源重组在植物的基因组中得到修饰，如I^aszkowski等，EMBOJournal 7 4021-26(1988)进一步说明的。这种技术利用同源序列通过本领域称作同源重组的过程来 彼此识别和相互之间交换核苷酸序列的特性。同源重组可以在细胞中核苷酸序列的染色体 拷贝与通过转化导入细胞中的核苷酸序列的引入拷贝之间发生。如此，在核苷酸序列的染 色体拷贝中精确地引入特定修饰。在一个实施方案中，本发明核苷酸序列的调控元件是经 过修饰的。此类调控元件易于通过使用本发明的核苷酸序列或其一部分作为探针筛选基因 组文库来获得。将现有的调控元件用不同的调控元件替换，如此改变核苷酸序列的表达，或 者将它们突变或缺失，如此消除核苷酸序列的表达。在另一个实施方案中，通过缺失核苷酸 序列的一部分或整个核苷酸序列或者通过突变来修饰核苷酸序列。本发明也涵盖突变型 多肽在植物细胞中的表达。这种技术用于破坏内源植物基因的最新精化已有记载(Kempin 等，Nature389 :802-803(1997)及 Miao 和 Lam, Plant J.，7 :359-365(1995))。熟练技术人员知道如何以靶定的方式修饰基因组序列的许多可能的方法。这些 包括特别是如下的方法，诸如依靠靶向同源重组产生敲除突变体，例如通过产生终止密码子来实现、读码框的移位等(Hohn B 和 Puchta H(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96: 8321-8323)或依靠例如序列特异性重组酶或核酸酶来实现序列的靶向删除或倒位。在另 一个优选的实施方案中，通过用由RNA连续区段与在末端具有双重发夹帽的、双链体构象 的DNA残基构成的嵌合寡核苷酸转化细胞，在核苷酸序列的染色体拷贝中引入突变。所述 寡核苷酸的另一项特征是例如在RNA残基处存在2’-0_甲基化。所述RNA/DNA序列设计成 与本发明核苷酸序列的染色体拷贝排列且含有期望的核苷酸变化。例如，此技术进一步记 载于美国专利 5，501, 967 及 Zhu 等(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :8768_8773。核酶在另一个实施方案中，编码本发明多肽的RNA受到对此类RNA特异性的催化性 RNA或核酶的切割。在转基因植物中表达所述核酶，导致所述植物细胞中编码本发明多肽 的RNA的量降低，如此导致所述细胞中积累的多肽的量降低。此方法进一步记载于美国专 利 4，987，071。显性负突变体在另一个优选的实施方案中，改变了由本发明核苷酸序列编码的多肽的活性。这 是通过在转基因植物中表达所述蛋白质的显性负突变体而实现的，导致内源蛋白质的活性 损失。适体在另一个实施方案中，通过在转基因植物中表达特异性结合蛋白质的称作适体的 核酸配体，抑制了本发明多肽的活性。适体优选通过SELEX(通过指数富集进行的配体系统 进化)方法来获得。在SELEX法中，使具有随机化序列区域的单链核酸的候选混合物与蛋 白质接触，并将那些具有升高的对靶物的亲和力的核酸与候选混合物的剩余物分开。扩增 分隔出来的核酸以生成配体富集混合物。数次重复后，得到了具有最佳的对多肽的亲和力 的核酸，并用于在转基因植物中表达。此方法进一步记载于美国专利5，270，163。锌指蛋白还使用结合本发明核苷酸序列或其调控区的锌指蛋白来改变所述核苷酸序列的 表达。优选的是，所述核苷酸序列的表达得到降低或提高。锌指蛋白记载于例如Beerli等 (1998) PNAS 95 :14628-14633 ；WO 95/19431 ;W098/54311 ；或 WO 96/06166，通过述及将它 们都完整收入本文。dsRNA通过dsRNA干扰(RNAi)也获得本发明核苷酸序列的表达变化。已经多次对动物和 植物生物体描述了依靠双链RNA(“双链RNA干扰”;dsRNAi)的基因调节方法(例如Matzke M A 等 U000)Plant Mol Biol 43 :401-415 ；Fire Α.等(1998)Nature 391:806-811; WO 99/32619 ；WO 99/53050 ；WO 00/68374 ；W000/44914；WO 00/44895 ；WO 00/49035 ；WO 00/63364，通过提及而将它们都完整收入本文)。在此明确提及指明的参考文献中所描 述的过程和方法。dsRNAi方法基于如下现象，即同时导入基因转录物的互补链和轮廓链 (contour strand)以高度有效的方式抑制相应基因的表达。优选地，所引起的表型与相 应的敲除突变体的表型非常相似(ffaterhouse P M等(1998) ProcNatl Acad Sci USA 95 13959-64)。dsRNAi方法在降低标志物蛋白质表达上已经证明为特别有效且有利的。双链RNA(dsRNA)分子在本发明范围内优选地意指一种或多种核糖核酸序列，其30由于互补序列而在理论上(例如依照Watson和Crick的碱基对规则)和/或实际上(例如 由于体外和/或体内杂交实验)能够形成双链RNA结构。双链技术人员知道如下的实情， 即双链RNA结构的形成代表平衡状态。优选地，双链分子与相应的解离形式的比率是至少 1比10，优选1 1，特别优选5 1，最优选10 1。本发明进一步涉及双链RNA分子，其在导入植物生物体中(或导入自其衍生的细 胞、组织、器官或增殖材料中)时引起至少一种靶基因的表达降低。优选地，本文的用于降 低靶基因的表达的双链RNA分子包含a) “有义” RNA链，其包含与靶基因的“有义” RNA转 录物的至少一部分基本上相同的至少一种核糖核苷酸序列，和b) “反义”RNA链，其在a)下 与RNA有义链基本上，优选完全互补。“基本上相同的”意指dsRNA序列与靶基因序列相比还可以具有插入、缺失而且还 有个别的点突变，然而引起表达的有效降低。抑制性dsRNA的“有义”链与靶基因核酸序列 的“有义” RNA转录物的至少一个部分之间(或靶基因的核酸序列的互补链的“反义”链之 间)的同源性(如下文中所定义的)优选是至少75%、优选至少80%、非常特别优选至少 90%、最优选100%。dsRNA与标志物蛋白质基因转录物之间的100%序列同一性为了引起靶基因表达 的有效降低不是绝对必要的。因此，该方法对于可由于遗传突变、多态性或进化趋异而存在 的序列偏差是有利地耐受的。如此，有可能例如使用已经生成的自第一生物体的靶基因的 序列开始的dsRNA来抑制第二生物体中的靶基因表达。出于此目的，dsRNA优选地包括靶 基因转录物中与保守区对应的序列区域。所述保守区可以容易地源自序列比较。或者，“基本上相同的” dsRNA还可以定义为能够与靶基因转录物的一部分杂交的 核酸序列。“基本上互补的”意指“反义” RNA链与此“有义” RNA链的互补物相比还可以具有 插入、缺失而且还有个别的点突变。“反义” RNA链与“有义” RNA链的互补物之间的同源性 优选是至少80 %，优选至少90 %，非常特别优选至少95 %，最优选100 %。靶基因核酸序列的““有义”RNA转录物的一部分”意指自靶基因核酸序列转录或可 转录的RNA或mRNA的片段。在此上下文中，片段具有优选地至少20个碱基、优选地至少50 个碱基、特别优选地至少100个碱基、非常特别优选地至少200个碱基、最优选地至少500 个碱基的序列长度。还包括完全可转录的RNA或mRNA。还包括如下的序列，诸如可以在人 工条件下自靶基因区域转录的那些序列，所述靶基因区域在其它情况中在天然条件下不转 录，诸如例如启动子区域。dsRNA可以由一条或多条多核糖核苷酸链组成。天然地，为了实现相同的目的，还 有可能将多种在每种情况中包含上文定义的核糖核苷酸序列部分之一的个别dsRNA分子 导入细胞或生物体中。可以自两个互补的、分开的RNA链开始或者优选地自单一、自身互补 的RNA链开始来形成双链dsRNA结构。在此情况中，“有义” RNA链和“反义” RNA链优选以 反向“重复”形式彼此共价连接。如WO 99/53050中所描述的，例如，dsRNA还可以包含发夹结构，其通过由连接序 列(“接头”;例如内含子)连接“有义”和“反义”链来得到。将优选给予自身互补的dsRNA 结构，因为它们仅需要RNA序列的表达，而且总是包含等摩尔比率的互补RNA链。优选地， 连接序列可以是内含子(例如马铃薯ST-LSl基因的内含子；Vancarmeyt G F等(1990)MolGen Genet220(2) :245-250)。编码dsRNA的核酸序列可以包括别的元件，诸如例如转录终止信号或多聚腺苷酸化信号。举例而言，可以以下列方式实现在细胞或植物中聚集(若想要的话)dsRNA的两条 链a)用包含两种表达盒的载体转化细胞或植物，b)用两种载体共转化细胞或植物，所述 载体之一包含含有“有义”链的表达盒，而所述载体的另一种包含含有“反义”链的表达盒。 可以在细胞外部或内部启动RNA双链体的形成。可以在体内或在体外合成dsRNA。出于此目的，可以将编码dsRNA的DNA序列插 入至少一种遗传控制元件(诸如例如启动子)控制下的表达盒中。多聚腺苷酸化不是必需 的，并且也不需要存在的任何用于启动翻译的元件。将优选给予靶向靶基因的dsRNA的表 达盒，其存在于转化构建体或转化载体上。出于此目的，优选地，将编码靶向靶基因的dsRNA 的“反义”链和/或“有义”链或dsRNA的自身互补链的表达盒插入转化载体中，并通过使用 下文所描述的方法来导入植物细胞中。稳定插入基因组中对本发明的方法可以是有利的， 但是不是绝对必要的。因为dsRNA引起长期效果，所以瞬时表达在许多情况中也是足够的。 dsRNA也可以是要通过核酸序列表达的RNA的一部分，所述核酸序列要通过将其融合例如 至所述RNA的3’ -非翻译部分来插入。可以以使每个细胞至少一个拷贝成为可能的量导入dsRNA。若合适的话，较高的量 (例如每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)可以引起更有效的降低。对于RNAi抑制BvPRR7，本发明人已经将cDNA片段诸如例如SEQ ID NO 1中所描 述的0. 6Kb片段装配成组成型启动子控制下的RNAi盒(参见实施例幻。合适的组成型启 动子是例如，来自拟南芥的启动子(Norris等，1993)、CaMV 35S启动子、或任何其它 已知在糖用甜菜中促进组成性表达的启动子。表达盒进一步含有合适启动子控制下的选 择标志基因。具体地，标志物基因编码正向选择标志物诸如磷酸甘露糖异构酶或木糖异构 酶。BvPRR7片段的反向重复由来自马铃薯MLSl基因的第二内含子分开(Eckes等，1986 ； Vancanneyt等，1990)以稳定化RNAi盒，而且还改善RNAi现象的效率(Wang和Waterhouse， 2001 ；Smith 等，2000)。DNA分子的插入(插入诱变)在另一个优选的实施方案中，将DNA分子插入本发明核苷酸序列的染色体拷贝或 其调节区中。优选地，此类DNA分子包含能够在植物细胞中转座的可转座元件，诸如例如 Ac/Ds、Em/Spm、突变基因(mutator)。或者，所述DNA分子包含土壤杆菌T-DNA的T-DNA边 界。所述DNA分子也可包含重组酶或整合酶识别位点，其可用于自植物细胞的染色体消除 所述DNA分子的一部分。还涵盖使用T-DNA、转座子、寡核苷酸或本领域技术人员知道的其 它方法进行的插入诱变方法。使用T-DNA和转座子进行插入诱变的方法记载于Winkler 等(1989)Methods Mol. Biol. 82 129-136 及 Martienssen(1998)PNAS95 :2021-2026, 通过述及将它们完整收入本文。别的合适的方法是将无义突变导入内源靶基因中，例 如依靠将RNA/DNA寡核苷酸导入植物中来进行(zhu等Q000)Nat Biotechnol 18(5) 555-558)。也可以依靠DNA-RNA杂合物来产生点突变，所述DNA-RNA杂合物也称为“嵌合 修复术(chimeraplasty) ”(Cole-Strauss 等(1999) Nucl Acids Res 27(5) :1323-1330 ； Kmiec(1999)Genetherapy American Scientist 87(3) :240_247)。32
缺失诱变在又一个实施方案中，本发明核酸分子的突变是在细胞或植物中的所述序列的基 因组拷贝中创建的，其通过缺失所述核苷酸序列或调节序列来实现。缺失诱变的方法是本 领域技术人员知道的。参见例如Miao等，(1995)PlantJ. 7 :359。也可以通过靶基因中的靶 向缺失来降低靶基因表达的活性或量，例如通过在识别序列处序列特异性诱导DNA双链断 裂以在靶基因核酸序列中或接近靶基因核酸序列处特异性诱导DNA双链断裂来实现。在又一个实施方案中，此缺失是在一大群植物中随机创建的，其通过化学诱变或 辐射来实现，并且通过正向或反向遗传学分离在本发明基因中具有缺失的植物。已知用快 中子或伽马射线进行的辐射引起植物中的缺失突变(Silverstone等，(1998)Plant Cell, 10 :155-169 ；Bruggemann 等，(1996) Plant J. , 10 :755-760 ；Redei 禾口 Koncz，于 Methods in Arabidopsis Research, WorldScientific Press (1992)，第 16 页-第 82 页)。可以使用 PCR及基因组DNA合并集合在反向遗传学策略中回收本发明基因中的缺失突变，正如在秀 丽线虫(C. elegans)中所显示的(Liu 等，(1999)，Genome Research，9 :859-867)。正向遗 传学策略会涉及诱变显示PTGS的系，接着对M2后代筛选PTGS的缺失。在这些突变体中会 预期有些突变体破坏了本发明的基因。这可通过使用来自这些突变体的基因组DNA进行的 本发明基因的Southern印迹或PCR来评估。在又一个实施方案中，在植物的每个细胞中改变本发明核苷酸序列的表达。这是 例如经由同源重组或通过染色体中的插入而得到的。这也是例如通过在能够在植物的每一 个细胞中表达有义或反义RNA、锌指蛋白或核酶的启动子控制下表达有义或反义RNA、锌指 蛋白或核酶而得到的。依照本发明的教导，例如如下所述，制备用于表达有义或反义RNA、锌 指蛋白或核酶或用于过表达本发明核苷酸序列的构建体，并转化入植物细胞中。组合应用也是想得到的。别的方法对于熟练技术人员是已知的，并且可以包括阻 止或停止靶基因的加工、由靶基因编码的蛋白质或其mRNA的转运、对核糖体附着的抑制、 对RNA剪接的抑制、降解靶基因RNA的酶的诱导和/或对翻译延长或终止的抑制。因此，本发明还提供了与序列表的SEQ ID NO :1、4、5、6、7、8、9、10、53、或M中所 列序列对应的有义和反义核酸分子及其直向同系物。可以将与编码SEQ ID NO :6所示多肽的核苷酸基本上相似的依照本发明的基因 和可读框(包括任何相应的反义构建体)可操作连接至在植物宿主内有功能的任何启动子 (包括依照本发明的启动子序列或其突变体)。一旦完成，可以将包含表达盒或RNAi盒的本发明多核苷酸构建体动员入对于植 物转化而言合适的载体(诸如例如二元载体)中，然后可以使用公知的转化技术之一(诸 如例如土壤杆菌介导的转化)将其动员至糖用甜菜。可以通过多种完全确立的技术来生成掺有且表达本发明核酸序列或dsRNA的转 基因植物(或植物细胞或植物外植体或植物组织)。构建包含掺有依照本发明的和如本文 所述的核酸序列的表达盒或RNAi盒的本发明嵌合构建体后，可使用标准技术将该嵌合构 建体导入感兴趣植物、植物细胞、植物外植体或植物组织。任选的是，可以再生植物细胞、网 状物或组织以再生转基因植物。所述植物可以是任何高等植物，包括裸子植物、单子叶植物 和双子叶植物。合适的方案是可得的。对于豆科(Leguminosae)(苜蓿、大豆、三叶草、等)、 伞形科(Umbelliferae)(胡萝卜、芹菜、欧洲防风)、十字花科(Cruciferae)(卷心菜、萝卜、油菜籽、嫩茎花椰菜、等)、葫芦科(Curcurbitaceae)(甜瓜和黄瓜)、禾本科(Gramineae) (小麦、玉米、稻、大麦、粟、等)、茄科(Solanaceae)(马铃薯、番茄、烟草、胡椒、等)、及各 种其它农作物。参见 Ammirato 等，编，(1984)Handbook of Plant Cell Culture—Crop Species,Macmillan Publ. Co.，New York,N. Y. ；Siimamoto 等(1989)Nature 338 :274276 ； Fromm等(1990)Bio/technol. 8 :833839 ；及 Vasil 等(1990)Bio/technol. 8 :429434 中记载 的方案。单子叶植物和双子叶植物二者细胞的转化和再生现在是常规的，而且从业人员会 确定最适宜的转化技术的选择。方法的选择会随要转化的植物的类型而变化；本领域技术 人员会认识到特定方法对于指定植物类型的合适性。合适的方法可包括但不限于植物原 生质体的电穿孔；脂质体介导的转化；聚乙二醇(PEG)介导的转化；使用病毒进行的转化； 植物细胞的显微注射；植物细胞的微弹轰击；真空渗透；和根癌土壤杆菌介导的转化。植物转化可以用单一 DNA分子或多种DNA分子(即共转化)进行，而且这两种技 术都适合于与本发明的嵌合构建体一起使用。用于植物转化的许多转化载体是可得的，而 且本发明的表达盒可以与任何此类载体一起使用。载体的选择会取决于优选的转化技术和 要转化的靶物种。用于将构建体导入植物细胞宿主中的多种技术是可得的且本领域技术人员已知 的。这些技术一般包括采用根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌作为转化剂、脂质体、PEG沉淀、 电穿孔、DNA注射、直接DNA摄取、微弹轰击、微粒加速、诸如此类进行的DNA转化(参见例 如EP四5959和EP 138341)(见下文)。然而，可以用本发明的多核苷酸构建体转化植物细 胞以外的细胞。关于植物表达载体和报告基因及土壤杆菌属和土壤杆菌介导的基因转移的 一般描述可见于Gruber等(1993)。可以将含有依照本发明的核酸序列的表达载体导入原生质体或完整的组织或分 离的细胞中。优选的是，将表达载体导入完整的组织中。培养植物组织的通用方法见于例 如Maki等，(1993)；及Wiillips等(1988)。优选的是，使用直接基因转移方法将表达载体 导入玉米或其它植物组织中，诸如微弹介导的投递、DNA注射、电穿孔等等。更优选的是，用 弹道装置使用微弹介导的投递将表达载体导入植物组织中。参见例如Tomes等(19%)。本 发明的载体不仅可用于结构基因的表达，而且可用于外显子-捕获克隆或启动子捕获规程 以检测各种组织中的差异基因表达(Lindsey等，1993 ；Auch和Reth等)。特别优选使用土壤杆菌的二元型载体Ti和Ri质粒。Ti衍生载体转化广泛的 高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物，诸如大豆、棉、油菜、烟草、和稻(Pacciotti等， 1985 ；Byrne 等，1987 ；Sukhapinda 等，1987 ；Lorz 等，1985 ；Potrykus, 1985 ；Park 等，1985 ； Hiei等，1994)。T-DNA用于转化植物细胞的用途得到了广泛研究和详细描述(EP 120516 ； Hoekema, 1985 ；Knauf等-，1983 ；及An等，1985)。为了导入植物中，可以将本发明的嵌合构 建体插入二元载体中，如实施例中所描述的。本领域技术人员会领会，方法的选择可取决于要进行转化的植物的类型，即单 子叶植物或双子叶植物。合适的植物细胞转化方法包括但不限于显微注射(Crossway 等，1986)、电穿孔(Riggs等，1986)、土壤杆菌介导的转化(Hinchee等，1988)、直接基因 转移(Paszkowski等，1984)、和弹道微粒加速，其使用可自Agracetus, Inc. (Madison, Wis.)和BioRad (Hercules，Calif.)获得的装置进行(参见例如Sanford等，美国专利 No. 4，945，050 ；及 McCabe 等，1988)。还可参见 Weissinger 等，1988 ；Sanford 等，1987 (洋葱)；Christou 等，1988(大豆)；McCabe 等，1988 (大豆)；Datta 等，1990 (稻)；Klein 等， 1988 (玉米)；Klein 等，1988 (玉米)；Klein 等，1988 (玉米)；Fromm 等，1990 (玉米)； 及 Gordon-Kamm 等，1990 (玉米)；Svab 等，1990 (烟草叶绿体)；Koziel 等，1993 (玉米)； Shimamoto等，1989(稻)；Christou等，1991 (稻)；欧洲专利申请EP 0332581 (鸭茅和其它 Pooideae) ；Vasil等，1993 (小麦)；Weeks等，1993 (小麦)。在一个实施方案中，采用用于 玉米的原生质体转化方法(欧洲专利申请EP 0292435 ；美国专利No. 5，350，689)。本发明的主要焦点是糖用甜菜的转化。用于转化糖用甜菜的实验规程是本领域技 术人员公知的，诸如使用糖用甜菜分生组织作为外植体材料的Chang等，2002所披露的或 如Joersbo等，1998所描述的。在一个优选的实施方案(如实施例3中所显示的)中，可以将RNAi盒转化入二年 生糖用甜菜基因型诸如例如G018中。对转基因枝条检查选择标志的表达诸如例如PMI活 性(Joersbo等，1998)。使阳性枝条和非转基因对照生根，并转移至于18°C的温室达两周最 小值的驯化期，之后春化处理。一旦完善建立，将转基因植物暴露于春化处理，其由于6°C恒 定温度的14周期间和低人工光的12小时组成。在应用抽苔诱导性条件前，通过逐渐将温 度从10提高至18°C来在气候室中将春化的植物缓慢驯化2周。随后，将植物移植入更大的 盆(2升)中，并监测抽苔，期间暴露于18°C的恒定温度和17小时光/7小时黑暗的长日照 光周期。选出经转化植物细胞或植物并种植至成熟后，鉴定那些显示出感兴趣性状的植 物。所述性状可以是任何上文所述那些性状。另外，为了确认感兴趣性状是由于所导入的感 兴趣核酸序列在依照本发明的调控性核苷酸控制下的表达，可使用Northern印迹、RT-PCR 或微阵列分析mRNA表达或使用免疫印迹或Western印迹或凝胶位移测定法分析蛋白质表 达，由此测定感兴趣多肽或核酸序列的表达水平或活性。如此，本发明涉及植物细胞和组织、自此类细胞和组织衍生的植物、植物材料、自 此类植物衍生的后代和种子、及农业产品，包括可通过例如下文所述任一转化方法得到的、 经过加工的植物产品。一旦将包含依照本发明核酸序列的依照本发明的和如本文所述的表达盒转 化入特定植物物种中，可以使用传统育种技术在该物种中繁殖或移入相同物种的其它 品种中，特别是包括商业性品种。本发明的优选植物包括裸子植物、单子叶植物、和 双子叶植物，尤其是在农业上重要的农作物植物，诸如稻(rice)、小麦(wheat)、大麦 (barley)、黑麦(rye)、油菜(rape)、玉米(corn)、马铃薯(potato)、胡萝卜(carrot)、甘 薯(sweet potato)、糖用舌甘菜(sugar beet)、菜豆(bean)、豌豆(pea)、菊苣(chicory)、 莴苣(lettuce)、甘蓝(cabkige)、花椰菜(cauliflower)、嫩茎花椰菜(broccoli)、芜菁 (turnip) ^ 卜(radish) 1 (spinach) ^ψτ (asparagus)(onion) >H (garlic) >子(eggplant)、胡椒(ρ 印 per)、序菜(celery)、胡萝卜(carrot)、西葫声(squash)、 南瓜(pumpkin)、夏南瓜(zucchini)、黄瓜(cucumber)、苹果(apple)、梨(pear)、温柏 (quince)、甜 jl (melon) 、ψ (plum) 、# Μ (cherry) 、Μ (peach)、油 Μ (nectarine)、胃 (apricot) > ^ (strawberry)、葡萄(grape)、覆盆子(raspberry) > 11 (blackberry) >(pineapple) ^； (avocado)(papaya)(mango) > (banana)(soybean)、烟草(tobacco)、番爺(tomato)、高梁(sorghum)禾口甘蔴(sugarcane)。35
工程化改造入上文所述转基因植物中的遗传特性通过有性生殖或营养生长而传 递，而且如此能在后代植物中维持和繁殖。一般而言，所述维持和繁殖利用开发用来适应特 定目的的已知农业方法，诸如耕耘、播种或收获。也可以应用专用过程，诸如水培或温室技 术。可进一步地在致力于开发具有改良特性(诸如对害虫、除草剂、或压力的耐受，改良的 营养价值，升高的产量，或引起倒伏或落粒损失减少的改良结构)的植物的植物育种中进 行依照本发明的转基因植物的有利遗传特性的使用。各种育种步骤的特征在于清楚限定的 人为干预，诸如选择要杂交的系、指导亲本系的授粉、或选择适宜的后代植物。根据期望的 特性，采用不同的育种度量。相关技术是本领域公知的，包括但不限于杂交/近交/回交育 种、多系育种、品种混和(variety blend)、种间杂交、非整倍体技术、等。杂交技术还包括通 过机械、化学或生化手段进行的植物不育化，以生成雄性或雌性不育植物。不同系的花粉对 雄性不育植物的交叉授粉确保雄性不育而非雌性不育植物的基因组会一致地获得这两个 亲本系的特性。如此，依照本发明的转基因植物能用于改良植物系的育种，例如由于它们的 修饰遗传特性而提高常规方法(诸如除草剂或杀虫剂处理)的效率或容许免除所述方法。 或者，能得到具有改良压力耐受的新农作物，即由于它们经过优化的遗传“配备”，生成质量 比不能耐受相当的不利发育条件的产物要好的收获产物。本领域技术人员会认可可以通过育种入包含不同转基因或非转基因基因型的其 它亲本系(优选糖用甜菜植物系)中来基因渗入本发明的转基因基因型。此不同转基因或 非转基因基因型可以是任何基因型，但是优选包含至少一种感兴趣的性状的基因型。例如， 可以将包含本发明转基因基因型的糖用甜菜近交物与包含对已知感染糖用甜菜植物的不 同病毒有抗性的事件的转基因基因型的糖用甜菜近交系杂交。所得的种子和后代植物会以 叠加形式具有延迟的抽苔的性状和抗性性状。例如，可以将具有本发明转基因基因型的糖 用甜菜近交物与包含草甘膦抗性H7-1事件的转基因基因型的糖用甜菜近交物(欧洲专利 申请EP-A1-1597373，通过提及而将其收入本文)杂交。所得的种子和后代植物具有抗性性 状和延迟的抽苔的性状两者。也可以使用别的性状，如除草剂抗性、疾病抗性或对病毒(即 如例如转基因形式或来自常规来源(如冬青属(Holly)或C48)的BNYVV的病毒或与BNYVV 不同的病毒)的抗性来与本发明的转基因基因型叠加。会进一步认可的是，可以与本发明 的转基因基因型进行其它组合或叠加，并且如此这些例子不应视为限制性的。本领域技术人员还会认可可以用各种种子处理化学品(包括各种杀虫剂和杀昆 虫剂)处理包含本发明转基因基因型的转基因糖用甜菜种子以进一步提升本发明的抗性。可以使用本领域公认的育种技术在任何糖用甜菜近交物或杂种中基因渗入本发 明的转基因基因型。植物育种的目的是在单一品种或杂种中组合多种想要的性状。对于大 田作物，这些性状可以包括对昆虫和疾病(例如衍生自常规的来源，包括但不限于冬青属 和C48)的抗性、对除草剂的耐受性、对热和干旱的耐受性、较大的产率、和较好的农艺学质 量。通过许多作物的机械收获，植物特征诸如萌发和直根建立、生长率、成熟、和根大小的一 致性是重要的。在另一方面，本发明提供了一种用于生成杂种种子的方法，具有延迟抽苔的表型 的糖用甜菜植物来自所述杂种种子。所述方法包括(a)提供具有延迟抽苔的表型的糖用 甜菜系，特别地依照本发明的转基因糖用甜菜植物作为第一亲本系，(b)提供具有不同基因 型的第二糖用甜菜系作为第二亲本系；(c)容许步骤(a)的第一亲本系的植物和步骤(b)的第二亲本系的植物彼此传粉，让所述种子形成，并收获所述杂种种子；其中收获的杂种种 子是具有延迟抽苔的表型的糖用甜菜杂种植物的种子。在此方面的一个实施方案中，步骤 (a)中所提供的第一亲本系是包含本发明的一种或多种或所有多核苷酸的近交糖用甜菜 系。在此方面的一个别的实施方案中，所述第二亲本系选自下组(a)对至少一种影响糖用 甜菜的病毒诸如例如甜菜坏死黄脉病毒有抗性的近交糖用甜菜植物系；(b)对至少一种除 草剂有抗性的近交糖用甜菜植物系；和(c)具有对至少一种疾病的抗性的近交糖用甜菜植 物系。影响糖用甜菜的常见病毒和疾病和针对这些病毒或疾病的抗性的来源的例子是本领 域技术人员已知的。此外，对糖用甜菜使用的除草剂和针对这些除草剂的抗性的来源也是 本领域技术人员已知的。已经自花传粉并为许多世代选择类型的植物在几乎所有基因基因座处变为纯合 的，而且产生真实育种后代的一致群体。两种不同纯合品系之间的杂交产生在许多基因基 因座上可以为杂合的杂种植物的一致群体。在许多基因基因座处各为杂合的两种植物的杂 交会产生在遗传上不同且不会是一致的杂种植物的群体。本领域中已知的且在糖用甜菜植物育种程序中使用的植物育种技术包括但不限 于轮回选择、回交、谱系育种、限制性长度多态性增强的选择、遗传标志增强的选择和转化。 糖用甜菜植物育种程序中糖用甜菜杂种的开发一般需要纯合近交系的开发、这些品系的杂 交、和评估所述杂交。使用谱系育种和轮回选择育种方法来从育种群体开发近交系。糖用 甜菜植物育种程序将来自两种或更多种近交系或多种其它种质来源的遗传背景组合成育 种集合，通过自交和选择想要的表型自所述育种集合开发新的近交系。将新的近交物与其 它近交系杂交，并评估来自这些杂交的杂种以测定那些中哪些具有商业潜力。如糖用甜菜 植物育种程序中实施的植物育种和杂种开发是昂贵且费时的方法。谱系育种以两种基因型的杂交开始，所述基因型的每一种可以具有另一种中缺乏 的或互补另一种的一种或多种想要的特征。若两种初始亲本不提供所有想要的特征，则可 以将其它来源包括入育种种群中。在谱系方法中，在连续世代中对卓越植株进行自交并选 择。在随后的世代中，杂合条件由于自花传粉和选择而为同质系(homogeneous line)所代 替。通常，在育种的谱系方法中，实施5个或更多个世代的自交和选择F1 — F2 ；F2 — F3 ； F3 — F4 ；F4 — F5 ；等等。可以使用轮回选择育种(例如回交)来改善近交系和使用那些近交物生成的杂 种。可以使用回交来将特定的想要性状从一种近交物或来源转移至缺乏所述性状的近交 物。这可以如下实现，即例如首先将卓越的近交物(轮回亲本)与供体近交物(非轮回亲 本)杂交，所述供体近交物携带适合于所讨论性状的基因。然后将此杂交的后代返回与卓 越的轮回亲本配对，接着对所得的后代选择要自非轮回亲本转移的想要性状。通过选择想 要性状的5个或更多个回交世代后，后代会在控制所转移的特征的基因座方面为纯合的， 但是对于基本上所有其它基因会像卓越的亲本。然后自交最后的回交世代以给出所转移的 基因方面的纯育种后代。自含有所转移的基因的近交物开发的杂种与自没有转移基因的相 同近交物开发的杂交基本上相同。也可以使用良种近交系，即纯育种、纯合近交系作为用于育种的起始材料或来源 群体，自此开发其它近交系。可以使用较早所描述的谱系育种和轮回选择育种方法来开发 自良种近交系衍生的这些近交系。作为一个例子，在使用回交育种来创建这些在糖用甜菜37植物育种程序中衍生的品系时，可以使用良种近交物作为亲本系或起始材料或来源群体， 而且可以充当供体或轮回亲本。单杂交杂种源自于两种近交系的杂交，所述近交系之每一种具有互补另一种的基 因型的基因型。第一代的杂种后代称作F1。在糖用甜菜植物育种程序中的商业杂种开发 中，仅寻求Fl杂种植物。优选的Fl杂种比其近交亲本更茁壮(vigorous)。可以在许多多 基因性状中显示此杂种活力或杂合优势，包括增加的营养生长和增加的产率。糖用甜菜植物育种程序中糖用甜菜杂种的开发牵涉三个步骤(1)从多种种质集 合选择植物来进行初始育种杂交；( 自交自育种杂交选定的植物达数个世代以产生一系 列近交系，它们虽然彼此不同，但是准确育种而且是高度一致的；并(3)将选定的近交系与 不同近交系杂交以产生杂种后代(Fl)。糖用甜菜中的近交方法过程中，品系的活力降低。活 力在杂交两种不同近交系以产生杂种后代(Fl)时恢复。近交系的纯合性和同质性的重要 结果是限定近交物对之间的杂种总会是相同的。一旦已经鉴定出给出卓越杂种的近交物， 可以无限地繁殖杂种种子，只要近交亲本的同质性得到维持。在杂交两种近交系以产生Fl后代时产生单杂交杂种。自成对杂交的四种近交系 (AXB和CXD)产生双杂交杂种，然后再次杂交两种Fl杂种(AXB)X(CXD)。自三种近交系产 生三系杂交杂种，其中杂交所述近交系的两种(AXB)，然后将所得的Fl杂种与第三近交系 杂交(AXB)XC。由Fl杂种展现出的大量杂种活力在下一世代(^)中丧失。因此，来自杂种 的种子不用于定植苗(planting stock)。在杂种种子生成中，消除或灭活雌性亲本的花粉生成是优选的。不完全除去或灭 活花粉提供自花传粉的潜力。可能无意收获这种疏忽地自花传粉的种子并与杂种种子包装 在一起。一旦种植种子，有可能鉴定并选择这些自花传粉的植物。这些自花传粉的植物会 在遗传上相当于用于生成杂种的雌性近交系。典型地，这些自花传粉的植物可以由于其降 低的活力而鉴定和选择。雌性自交通过其在生长和/或生殖特征方面活力较小的外观来鉴 定。也可以经由分子标志分析来实现这些自花传粉的品系的鉴定。然而，存在简单且有效的传粉控制系统，其通过在商业杂种种子生产中排除自花 传粉来确保利用杂种优势。若亲本之一是自交不亲和的(Si)、细胞质雄性不育(CMQ或细 胞核雄性不育(匪幻植物，其不能自花传粉或不能产生花粉，则只会发生杂交传粉。通过消 除杂交中一个亲本品种的花粉，植物育种人员确信获得一致质量的杂种种子，只要亲本是 一致质量的，并且育种人员进行单杂交。细胞质雄性不育(CMQ是母体遗传现象，其遗传决 定子位于细胞质细胞器，即线粒体的基因组中。此类植物在其产生功能性花粉粒的能力上 受到严重损害。CMS系统的恢复系基因是显性核基因，其抑制细胞质的雄性不育效果。CMS 植物中雄性不育的表达是隐性核基因与雄性不育特异性胞质基因组之间的不相容性的结果。在一个优选的实施方案中，应用CMS系统以产生本发明的杂种糖用甜菜植物。在 此类系统中，使用雄性不育CMS系作为雌性亲本，其由作为雄性亲本使用的雄性能育系传 粉。依照本发明的延迟抽苔的性状可以存在于CMS雄性不育(雌性)亲本系或雄性能育 (雄性)亲本系或者甚至两者中。优选地，在雄性不育侧保持延迟抽苔的性状以避免经由由 雄性亲本脱落的含有该性状的花粉引起的GM污染。如本领域技术人员容易显而易见的，上文仅是那些期望将本发明的转基因基因型基因渗入其它糖用甜菜系中的人可获得本发明近交物的多种方式中的一些。其它手段是本 领域技术人员可获得的和已知的，并且上述例子仅是例示性的。一般地，用于杂种生成的第二亲本系也可以是具有延迟抽苔的表型的糖用甜菜 植物系，如例如本发明的糖用甜菜植物。优选地，用于生成杂种种子的第一亲本系和第二 亲本系基于遗传上多种多样的背景。遗传距离可以通过使用分子标志测量，如例如记载于 Knaak(1996)的。然而，第二亲本系也可以是糖用甜菜近交物，其包含感兴趣的另一性状，如 例如但不限于草甘膦抗性的(例如含有H7-1事件，如欧洲专利申请EP-A1-1597373中所描 述的，通过提及而将其收入本文)。所得的杂种种子会含有延迟的抽苔和除草剂草甘膦的 叠加性状。第二亲本系中还可以包含别的性状，如除草剂抗性、疾病抗性或针对来自常规来 源(如冬青属或C48)的BNYVV或与BNYVV不同的病毒的抗性以在杂种种子中与本发明的 转基因基因型叠加。会进一步认可可以与本发明的转基因基因型进行其它组合或叠加，并 且如此这些例子不应视为限制性的。本发明的另一个优选的实施方案涉及具有延迟抽苔的表型的糖用甜菜植物的杂 种种子。在本发明的一方面，所述杂种种子是通过本发明的用于生成具有延迟抽苔的表型 的糖用甜菜植物的糖用甜菜杂种种子的方法生成的。此类方法是本领域技术人员已知的。 在本发明的又一方面，提供了具有延迟抽苔的表型的杂种糖用甜菜植物，其是通过种植本 发明的杂种种子生成的。优选地，此杂种植物完全不抽苔，即显示对春化响应的完全抑制。 本发明的进一步优选的实施方案涉及本发明所述杂种糖用甜菜植物的一部分。优选地，所 述部分选自下组种子、胚、小孢子、合子、原生质体、细胞、胚珠、花粉、直根、子叶、提取物或 样品。依照本发明的另一方面，提供了检测生物学样品中本发明的核酸序列或嵌合构建 体的存在的方法。所述方法包括(a)将包含DNA的样品与引物对接触，所述引物对在用于 与来自携带本发明核酸序列或嵌合构建体的糖用甜菜的基因组DNA的核酸扩增反应时产 生诊断本发明糖用甜菜的扩增子；(b)实施核酸扩增反应，由此生成扩增子；并(C)检测所 述扩增子。可以通过本领域中公知的任何手段(包括但不限于荧光的、化学发光的、放射线 学的、免疫学的等)来进行扩增的检测。在意图使用杂交作为用于扩增特定序列以生成扩 增子的手段的情况中，意图通过本领域中公知的任何手段的扩增子生成和检测指示与一种 靶序列(其中利用一种探针或引物)，或者多种序列(利用两种或更多种探针或引物)的预 期杂交。进一步涵盖用于生产糖的方法，其中加工本发明的糖用甜菜植物、或其细胞或组 织、生物学样品或提取物以生产糖。此外，本发明提供了糖，其是通过本发明的生产糖的方 法生产的。用于生产糖的方法可以是本领域技术人员已知的用于生产糖的任何常规方法。另一个优选的方面涉及一种用于生产一种或多种选自下组的生物燃料的方法乙 醇、沼气和/或生物柴油，其通过加工本发明的转基因糖用甜菜植物、或其细胞或组织、或 生物学样品或提取物以生成一种或多种生物燃料来进行。生物燃料可以是通过植物材料的 需氧或厌氧发酵生成的任何生物燃料。通过需氧发酵获得的生物燃料的非限制性例子是生 物乙醇。可以通过厌氧发酵获得的生物燃料包括但不限于沼气和/或生物柴油。需氧和/ 或厌氧发酵的方法是本领域技术人员已知的。本发明进一步涵盖选自下组的生物燃料乙 醇、沼气和/或生物柴油，如通过本发明的用于生产一种或多种生物燃料的方法所生成的。39
在另一个优选的方面，本发明提供了多核苷酸标志物，其在B基因座处或极其接 近B基因座处，特别地在标志物MP0176和GJOl上游IcM距离处定位，而且与标志物GJ131 共分离(M5hring S.等，2004 ；Gaafar R. M.等，2005)(图 5)。本发明进一步涉及糖用甜菜基因组中鉴定的多核苷酸标志物，包括其变体和衍生 物，所述多核苷酸标志物是基于核酸序列开发的，所述核酸序列可获自糖用甜菜中显示与 抽苔基因(B基因)相关表型完美共分离的基因组DNA区，且其中所述标志物容许区分一年 生与二年生基因型或展现出二年生或一年生表型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单 元型。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸标志物具有自本发明的和如上文所描 述的一种或多种核酸序列可获得的核酸序列。优选地，本发明的多核苷酸标志物进一步包 含一个或多个多态性，特别是基于SNP、SSR、或至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但 是特别是基于SNP的多态性，该多态性诊断B基因座处的B等位基因。优选地，此类多核苷 酸标志物能够检测本文中列为SEQ ID NO :8的所述基因组序列的不同等位基因中存在的 和表7-1 (图10中进一步描绘的)和表7-2 (图10中进一步描绘的)中所显示的多种SNP 的至少一种，其中所述多核苷酸标志物能够区分不同等位基因，特别地区分一年生和二年 生糖用甜菜系。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸标志物能够检测至少一种选 自下组的SNP，该组包括列为SEQ ID NO 8的序列的位置#224、#351, #615、#897、#1082、 #1841、#1915、#2334、#11592、#12316、#12490、或 #12544 处的和如表 7-1 (图 10 中进一步 描绘的)和表7-2(图11中进一步描绘的)中所显示的SNP。本发明的别的方面涉及一组 多核苷酸标志物，其包含本发明的和上文所描述的众多多核苷酸标志物。在此上下文中，术 语“众多”指一组超过一个的多核苷酸标志物，其优选地由两种、三种或更多种标志物组成。在本发明的一方面，可以开发并使用本文中没有明确公开的标志物或甚至还要鉴 定的标志物。基于本申请中所提供的信息，对于技术人员会有可能鉴定或开发本文中没有 明确公开的但是在遗传学上与抽苔基因或B基因紧密连锁的，或优选地位于抽苔基因或B 基因内的或与本文中所公开的标志物连锁的标志物。技术人员知道其它标志物可以在筛选 测定法和标志物辅助选择中提供至少相等的效用。例如，可开发基于自测序PCR产物(其是自一年生和二年生植物扩增的)表征的 SNP的分子标志物，优选终点TaqMan 。在这里，会实施数次PCR扩增，以覆盖所述基因的 完整序列。然后在不同一年生和二年生遗传背景内测试新的分子标志，以评估分子测试的 稳健性。在一个实施方案中，分子标志是通过PCR扩增的DNA片段，例如SSR标志物或RAPD 标志物。在一个实施方案中，扩增DNA片段的存在或缺失指示性状自身的或该性状的特定 等位基因的存在或缺失。在一个实施方案中，扩增DNA片段的长度差异指示性状的特定等 位基因的存在，并如此能够区分性状的不同等位基因。在本发明的一个具体实施方案中，使用简单序列重复(SSR)标志物来鉴定亲本植 物和/或其祖先，以及自所述亲本植株杂交产生的后代植株中的本发明相关等位基因。本领域技术人员知道可利用的数种别的方法或办法，它们能用于鉴定和/或开发 与B基因区连锁不平衡的和/或与B基因区连锁的和/或位于B基因区中的标志物，以及 呈现负责二年生基因型的实际原因突变的标志物。本领域技术人员知道的办法包括但不限 于
-在杂交办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定感兴趣区域中的其它序列本 文中公开的引物序列和/或能使用本文中公开的引物序列测定的标志物/基因序列(或其 部分)可用作(杂交)探针，用于自基因组核酸样品和/或RNA或cDNA样品或样品合并物 分离标志物侧翼的和/或与B基因区连锁的和/或与B基因区有关的和/或对B基因区特 异性的核酸序列/基因(例如筛选基因组资源，像BAC文库或gDNA或cDNA文库筛选)；-在PCR办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定感兴趣区域中的其它序列可 使用本文中公开的引物序列和/或标志物/可使用本文中公开的引物序列测定的(候选) 基因序列(或其部分)作为(PCR)扩增引物自基因组核酸样品和/或RNA或cDNA样品或 样品合并物扩增QTL区侧翼的和/或与QTL区连锁的和/或与QTL区有关的和/或对QTL 区特异性的核酸序列/基因，所述样品是或不是自特定植物组织和/或在植物特定处理后 且自糖用甜菜或原则上具有足够同源性的任何其它生物体分离的；-在PCR办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定感兴趣区域中的其它序列在 为标志物序列设计内部引物并用于进一步测定B基因区内的和/或与所述性状遗传连锁的 和/或有关的别的侧翼序列/基因后，能测定一种或多种标志物的核苷酸序列/基因；-在作图和/或比较作图办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定同一区域中的 标志物(在其它图上定位B基因)基于本文中公开的位置信息和/或标志物信息，可通过 遗传作图办法，最终(如果早就需要的话)通过在(高密度)遗传图和/或集成遗传或共 有图上定位已公开标志物(通过遗传作图或基于各图间共有标志物的外推)，鉴定任何类 型的标志物。可鉴定和/或获得与已公开标志物和/或B基因区遗传连锁的和/或位于已 公开标志物和/或B基因区附近的早就知道的标志物和/或新的标志物，并最终用于B基 因(精细)作图和/或B基因克隆和/或MAS育种应用；-在“计算机”办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定B基因区中的别的序列/ 标志物/(候选)基因可以在“计算机”方法中使用本文中公开的引物序列和/或可使用 本文中公开的引物序列或基于连锁标志物测定的标志物/(候选)基因序列(或其部分) 来对序列或蛋白质数据库(例如BLAST)搜索与本文所述性状遗传连锁的和/或与本文所 述性状有关的和/或位于B基因区中的(别的)侧翼和/或同源序列/基因和/或等位基 因多样性(基因组和/或cDNA序列二者或甚至蛋白质，二者都源自辣椒和/或任何其它生 物体)；-在物理作图办法(在物理图或基因组序列上定位B基因)中使用已公开的序列 /标志物可以在原则上具有足够同源性的任何生物体的物理图和/或(完整)基因组序 列上定位本文中公开的引物序列和/或可使用本文中公开的引物序列或使用与本文中公 开的标志物遗传连锁的和/或位于B基因区中的其它标志物测定的标志物/基因序列(或 其部分)来鉴定在B基因(精细作图)和/或B基因克隆和/或MAS育种应用中可应用的 (候选)序列/标志物/基因；-使用已公开的序列/标志物在其它(物理)图或基因组上定位B基因(物种 间)可以在比较基因组或syntheny作图办法中使用本文中公开的引物序列和/或可使用 本文中公开的引物序列测定的标志物/基因序列(或其部分)来鉴定同系物区和同系物和 /或直向同系物序列/与B基因区遗传连锁的和/或位于B基因区中的且在B基因(精细 作图)和/或B基因克隆和/或MAS育种应用中可应用的(候选)基因；
-使用已公开的序列/标志物来选择适宜的个体，容许通过遗传办法鉴定感兴趣 区域中的标志物可使用本文中公开的引物序列和/或标志物来选择具有不同/对比B基 因等位基因的个体。可使用遗传关联办法(geneticassociation approach)和/或大批分 离子分析(bulk segregant analysis, BSA ;Michelmore等，1991)来鉴定特定感兴趣区域 (B基因区)中的和/或与所述性状关联的或遗传连锁的标志物/基因；或-使用已公开的信息来搜索(位置)候选基因可使用已公开的信息来鉴定位置 和/或功能候选基因，其可以与所描述的性状相关和/或遗传连锁。在本发明的另一个具体实施方案中，使用基于单核苷酸多态性的标志物来鉴定亲 本植物和/或其祖先，以及自所述亲本植株杂交产生的后代植株中的本发明相关等位基 因。糖用甜菜的商业性种子生产大多在法国南部和意大利北部进行。在这两个地区， 一年生杂生甜菜的存在能在种子生产中引起花粉污染，导致商业性种子中有一年生植物。 这是客户不能接受的，而且因此在收获种子后立即在没有野生甜菜的地区(诸如阿根廷) 种植所有批次的商业性种子。不对植物春化，而且通过利用抽苔者的存在来鉴定污染有一 年生植物的种子批次。因此，依照本发明的多核苷酸标志物可用于各批商业性种子的质量控制(这通过 对商业性二年生糖用甜菜种子筛选一年生污染物来进行)及在育种程序中鉴定一年生植 物/ 二年生植物(这使用一年生性状来加速育种过程，或在一起引入一年生性状与遗传变 异新来源时)。如此可开发基于依照本发明的且如本文中所描述的基因序列的不同测定法，并用 于对植物材料筛选一年生等位基因的存在或缺失。过去，已经开发了能用于遗传作图、基因克隆、标志物辅助植物育种及用于基因组 指纹术和调查遗传关系的分子标志技术。遗传标志物基于基因组区域的核苷酸序列中的 DNA多态性开发，而且能通过限制酶或依靠两个引发位点来检测。有数种类型的分子标志物可用于基于标志物的选择，包括限制性片段长度多态性 (RFLP)、多态性DNA的随机扩增(RAPD)、扩增限制性片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复 (SSR)和多核苷酸多态性(SNP)。不同类型标志物的信息内容可以是不同的，这取决于用于获得标志物数据的方法 和关于标志物评分的群体。例如，并非总是可能区分在纯合条件中存在的基因组片段与杂 合片段。在杂合群体中，像F2，共显性标志物(像限制性片段长度多态性)(RFLP，Botstein 等，1980)和共显性评分的扩增片段长度多态性(AFLP，Vos等，19%)产生比显性标志物 (像随机扩增多态性DNA) (RAPD, Welsh和McCleland，1990)和显性评分的AFLP要多的信 息。RFLP是共显性的，而且能够鉴定独特基因座。RFLP涉及使用限制酶在特定短限制性位 点(源自重复或位点间缺失或限制性位点处突变的多态性)处切割染色体DNA。AFLP要求用限制酶消化细胞DNA，之后使用PCR和引物中的选择性核苷酸来扩增 特定片段。凭借此方法，可测量多至100个多态性基因座，而且每项测试只要求相对较少的 DNA样品。用于实现跨越植物基因组多态性区域的核苷酸片段的此类扩增的最优选方法采 用聚合酶链式反应(“PCR”)(Mullis等，1986)，其使用包括能够与以双链形式限定多态性的近端序列杂交的反向引物和正向引物的引物对。与RFLP不同，基于PCR的技术只要求少量(大约10% )的DNA作为模板通过PCR 扩增生成大量的靶序列。一种此类基于PCR的技术是RAPD，其利用低严格性聚合酶链式反应(PCR)扩增， 使用具有任意序列的单一引物来生成无名DNA片段的株特异性种类。该方法只要求很少的 DNA样品，且分析大量的多态性基因座。然而，受到众多反应条件、显性方式的继承、和群体 特异性影响的短引物的不可预测的表现是RAPD的主要缺点。微卫星、或简单序列重复(SSR)、简单序列长度多态性(SSLP)、短串联重复(STR)、 简单序列基序(SSM)、和序列靶微卫星(STM)代表一类广泛分布于整个真核生物基因组中 的重复序列。重复数目和长度的变异是多态性的一个来源，甚至在密切相关的个体间。SSR 分析基于选择性扩增的这些(短重复)序列来检测简单序列重复中的变异。此类微卫星序 列可容易地使用侧翼基因座特异性寡核苷酸作为引物通过PCR来扩增，并检测DNA长度多 态性(Litt 和 Luty，1989 ；Weber 和 May, 1989)。单一核苷酸位置处导致替代、缺失或插入的突变产生多核苷酸多态性或SNP，其在 人类中每1. 3kb发生一次(Cooper等，1985 ；Kwok等，1996)。大多数此类型多态性只具有 两种等位基因，也称作双等位基因基因座。基于SNP的定位克隆可加速疾病性状和有效量 生物学信息突变的鉴定(Wang等，1998)。可使用有效选出点突变的PCR延伸测定法来检测SNP。该规程只要求每份样品少 量DNA。使用PCR进行的SNP检测测定法的三种广泛使用的类型是切割扩增多态性序列 (cleaved amplified polymorphic sequences，CAPS)(Konieczny 禾口 Ausubel，1993 ;Thiel 等，2004)、衍生 CAPS (dCAPS) (Michaels 和 Amasino，1998 ；Neff 等，1998)、和单链构象多态 t生(single strand conformaionpolymorphism, SSCP) (Orita 等，1989)。CAPS多态性指由SNP或INDEL引起的限制性片段长度差异，其是通过由基因座特 异性寡核苷酸引物生成的PCR扩增子中的限制性内切核酸酶识别位点创建或消除的。如下 实施CAPS测定法，即用一种或多种限制酶消化基因座特异性PCR扩增子，然后在琼脂糖或 聚丙烯酰胺凝胶上将经过消化的DNA分开。dCAPS是CAPS技术的改良，通过利用错配的PCR引物，其容许检测大多数单核苷酸 变化。使用该方法时，通过含有一处或多处相对于模板DNA的错配的引物，将包含SNP的限 制酶识别位点引入PCR产物。然后对以此方式修饰的PCR产物进行限制酶消化，并通过所 得限制性样式确定SNP的存在或缺失。SSCP技术在非变性凝胶上将变性双链DNA分开，并如此容许单链DNA的二级结构 及分子量决定凝胶泳动率。ARMS (扩增不应性突变系统)-PCR观程( 等，2001)涉及使用单一 PCR来进行 SNP基因分型(Fan等，2003 ；Chiapparino等，2004)。使用四引物(采用两对引物)在单一 PCR反应中扩增SNP的两种不同等位基因。可采用备选方法来扩增此类片段，诸如“连接酶链式反应”(“LCR”)(Barany, F.， 1991)，其使用两对寡核苷酸探针来指数扩增特定靶物。每对寡核苷酸的序列选择成容许该 对与靶物同一条链的相邻序列杂交。所述杂交为模板依赖性连接酶形成底物。与PCR—样， 所得产物如此在后续循环中充当模板，并且获得期望序列的指数扩增。43
可以用具有多态性位点同一条链的近端和远端序列的寡核苷酸实施LCR。在一个 实施方案中，任一寡核苷酸设计成包含多态性的实际多态性位点。在这样的一个实施方案 中，反应条件选择成使得所述寡核苷酸只能在靶分子含有或缺少与所述寡核苷酸上存在的 多态性位点互补的特定核苷酸的情况中连接到一起。或者，寡核苷酸可以选择成使得它们 不包含多态性位点(参见Segev, PCT申请WO 90/01069)。可采用的另一种方法是“寡核苷酸连接测定法”(“OLA”)(Landegren等，1988)。 OLA方案使用设计成能够与靶物单链上的相邻序列杂交的两种寡核苷酸。像LCR—样，OLA 特别适合于点突变的检测。然而，与LCR不同，OLA导致靶序列的“线性”而非指数扩增。Nickerson等，1990记载了组合PCR和OLA属性的核酸检测测定法(Nickerson等， 1990)。在此方法中，使用PCR来实现靶DNA的指数扩增，然后使用OLA进行检测。在需要 多个分开的加工步骤之外，与此类组合有关的一个问题是它们继承了与PCR和OLA有关的 所有问题。基于在存在具有所得“二寡核苷酸”序列的核酸的情况中两个(或更多个)寡核 苷酸的连接由此扩增二寡核苷酸的方案也是已知的(Wu和Wallace，1989)，而且可容易地 适应本发明的目的。在本发明的又一个实施方案中，使用基于至少一个核苷酸的缺失或插入 (“INDEL”)的标志物来鉴定亲本植物和/或其祖先，以及自所述亲本植株杂交产生的后代 植株中的本发明相关等位基因。可以基于依照本发明的和如上文所述的多核苷酸的序列来 开发这些标志物。具体地，依照本发明的标志物可用于等位区分测定法，特别地用于区分展现出二 年生基因型的糖用甜菜植株的植物分组内的不同单元型的测定法。所述测定法基于一组 探针多核苷酸，其包含与例如通过PCR扩增可获得的BvPRR7基因的亚区域互补的两种不 同探针分子，所述PCR扩增基于如分别在SEQ ID N0:13和SEQ ID NO :14中给定的正向引 物PRR7 (Tl) -F和反向引物PRR7 (Tl) -R,所述探针分子仅相差一个碱基错配，并且是探针 PRR7 (Tl)-VIC (SEQ ID NO 15)和 (Tl)-FAM (SEQ ID NO :16)。进一步优选的组是与探 针 PRR7(T6)-VIC(SEQ ID NO :51)和 PRR7 (T6)-FAM (SEQ ID NO :52) —起的如 SEQ ID NO: 49中所描述的正向引物PRR7 (T6) -F和如SEQ ID NO 50中所描述的反向引物PRR7 (T6) -R, 以及与探针 rr22 (Tl)-VIC (SEQ ID NO :57)和 lr22 (Tl)-FAM(SEQ ID NO :58) —起的如 SEQ ID NO :55中所描述的正向引物lr22 (Tl)-F和如SEQ ID NO :56中所描述的反向引物 lr22(Tl)-R0优选地，此类测定法(其中采用一组探针多核苷酸)包含至少两种不同探针分子， 其相差至少一种错配(one mismatch)，特别地相差位于相邻位点处的两个或更多个错配， 但是特别地相差一个单错配，其中第一探针分子，特别地经标记的探针分子，更特别地用第 一荧光染料和猝灭剂标记的探针分子代表一种等位基因，而第二探针分子，特别地经标记 的探针分子，更特别地用第二荧光染料和猝灭剂标记的探针分子(其与第一染料不相同) 代表另一等位基因，且其中使用所述探针多核苷酸组来区分两种等位变体。可以采用另外 两种不同的荧光标记物，其荧光可以容易区别。例如，用第一荧光染料(如例如FAM)标记 第一探针，而用第二荧光染料(如例如VIC)标记第二探针。在本发明的此类测定法的一个 优选的实施方案中，另外用包含对二年生等位基因特异性的序列的经第二荧光标记的探针分子探查上文所描述的本发明等位区分测定法的步骤b)中所获得的扩增片段。在此测定 法中，第一探针的染料荧光升高仅指示一年生等位基因的存在。此测定法中所使用的两种 染料优选是VIC和FAM。一般地，本发明的测定法优选地采用两种引物(即一对依照本发明 的引物)和至少一种针对一年生等位基因的探针。可以进一步采用第二探针，其是针对二 年生等位基因的探针。在本发明的另一方面，提供了如下的方法，其牵涉可以特异性区分一年生植物和 二年生植物，并且如此可以用于例如种子批次的质量控制的标志物。具体地，本发明涉及一种测定法，该测定法基于一组探针多核苷酸，其包含与例 如通过PCR扩增可获得的BvPRR7基因的亚区域互补的两种不同探针分子，所述PCR扩增 基于如分别在SEQ ID N0:13和SEQ ID NO 14中给定的正向引物PRR7 (Tl)-F和反向弓丨 物PRR7(T1)-R，所述探针分子仅相差一个碱基错配，并且是探针PRR7(T1)-VIC(SEQ ID NO 15) ^P PRR7 (Tl)-FAM(SEQID NO :16)。进一步优选的组是与探针 PRR7 (T6)-VIC (SEQ ID NO 51)和 PRR7 (T6) -FAM(SEQ ID NO :52) 一 起的如 SEQ ID NO :49 中所描述的正 向引物PRR7(T6)-F和如SEQ ID NO :50中所描述的反向引物PRR7 (T6)-R，以及与探针 rr22(Tl)-VIC(SEQ ID NO :57)禾口 lr22 (Tl) _FAM(SEQ ID NO :58) 一起的如 SEQ ID NO :55 中所描述的正向引物lr22 (Tl)-F和如SEQ ID NO :56中所描述的反向引物lr22 (Tl)-R。在另一方面，本发明提供了一种用于在商业种子中鉴定一年生污染物的方法。优 选地，此方法包括使用本发明的和本文中所描述的基于标志物的等位区分测定法。以下实施例仅意图例示本发明的一个或多个优选的实施方案，并且不应解释为限 制本发明的范围。实施例以下实施例提供了例示性实施方案。根据本公开内容和本领域一般技术水平，技 术人员会领会以下实施例意图仅作为例示性的，而且可采用众多变化、改良、和改变而不背 离当前要求保护的主题的范围。实施例1 糖用甜菜PRR7基因的表征实施例1. 1 来自糖用甜菜的推定PRR7同系物的定位基于用于鉴定和表征糖用甜菜中推定抽苔控制基因的候选基因方法，凭借使用 BLAST进行的同源性搜索将编号CV301305的EST序列鉴定为PRR7的推定甜菜同系物。SEQ ID NO :1显示了 EST CV301305的核苷酸序列。相应的氨基酸序列显示了假应答调控物接受 者(PRR，pfam00072)或信号接受者(REC，cd00156)域的部分存在(图1)，其是在昼夜节律 钟中都起关键作用的PRR基因家族的一种标志(Nakamichi等，2005)。图2显示了 CV301305 与其最密切的拟南芥同系物PRR7的氨基酸序列比对，后者已经被描述成温度敏感性昼夜 节律系统的一个成分(Nakamichi等，2007 ；Salome和McClung 2005)。已知昼夜节律钟在 植物中控制数个发育过程，包括开花时间控制(Imaizumi和Kay，2006 ；Zhou等，2007)。基于上述观察结果，使用拟南芥PRR7基因(分别为AT5G(^810和匪120359)与 BvPRR7糖用甜菜EST(CV301305)基因组序列和mRNA之间的比对，推导部分甜菜PRR7片段 的推定基因结构，这揭示了数个推定内含子区的存在(图3)。在使用基因组甜菜DNA作为模 板时，涵盖第三推定内含子区的引物PRR7-F和PRR7-R(SEQ ID NO 2和3)产生大约0. 51Λ45的扩增产物。用于扩增反应的PCR条件如下初始变性95°C 5分钟，接着35个扩增循环30 秒 95"C、30 秒 60°C和 30 秒 72°C，再接着 5 分钟 72"C。在来自 AppliedBiosystems Inc. 的GeneAMP PCR系统9600仪器上使用来自hvitrogenCorporation的钼Taq DNA聚合酶 和相应反应混合物如供应商所推荐的那样运行PCR实验。对PCR产物的序列分析得以重建 BvPRR7基因片段内含子3周围的基因组序列，并证实了长度为四6碱基对的内含子的存在 (SEQ ID NO 4)。在一组(包括15种二年生和1种一年生系)糖用甜菜亲本系间对BvPRR7基因的 基因组片段扩增和测序。所有二年生系展现BvPRR7单态性，因为只观察到两种不同单元 型一种二年生等位基因和一种一年生等位基因(表1)。为了在对一年生习性分离的群体 中定位BvPRR7，开发了一种使用端点TaqMmi 技术靶向第160位SNP(SEQ iD NO 4)的测定法。表2总结了为靶向第160位SNP的PRR7(T1) TaqMan 测定法设计的引物和探针 的核苷酸序列；依照制造商的推荐，该反应体系进一步包括来自Applied Biosystems Inc. 的TaqMan 通用 PCR 大师级混合物，No AmpErase UNG Ox)。使用 ABIPRISM 7700 序 列检测仪仪器，如下实施PCR扩增95°C 10分钟，接着40个循环95°C 15秒和60°C 1分钟。 使用序列检测系统Sequence Detection System) 2. 0软件实施端点测量。表1 在1种一年生和15种二年生糖用甜菜系之间对跨越内含子3的BvPRR7基 因片段观察的多态性。SEQ ID NO 4 位置87160406单元型#1TTG一年生单元型#2CCA二年生标题行(header row)标示BvPRR7基因片段的基因组序列(如SEQ ID NO 4中所 描述的)处的核苷酸位置。标题为“单元型#1”和“单元型#2”的行表示一组16种品系间 观察的2种单元型。表2 与用于SNP#160基因分型的TaqMan测定法PRR7(T1)对应的引物和探针的 核苷酸序列前体名称核苷酸序列(5’至3’)SEQ ID NO PRR7 (Tl)-GAGGTGTCACAGTGTAAGTGTCT13PRR7 (Tl)-RAAAGACTGCTACACGAACCACTAAG14PRR7 (Tl)-FAMFAM-CTGATGAAAAGCTG-MGB-NFQ16PRR7 (Tl)-VICVIC-CTGATGGAAAGCTG-MGB-NFQ1546
使用上述PRR7(T1)测定法，在自一年生系与对第160位SNP而言多态性的二年生 系之间的杂交衍生的198个个体的F2群体中定位了 BvPRR7基因。BvPRR7位于染色体II， 在GJ131标志物下游大约IcM处(图4)，即已知含有关于不依赖春化的开花的B基因的一 个区域(M6hring等，2004 Aaafar等，2005)。PRR7(T1)测定法的结果显示了 B基因预测 基因型与BvPRR7基因基因型之间的完全匹配。B基因的基因型是基于自个别F2植株衍生 的F3群体关于不依赖春化的开花的表型评估预测的。表3总结了包含最靠近的重组事件 的9个后代植株个体的B基因区细微图的图形显示。其定位位置与其与温度敏感性昼夜节 律有关的生物学功能的组合(&ι1οπι 和McClung，2005)显然使得BvPRR7成为B基因的强 候选物。表3 多种标志物的基因型，包括在B基因的任一侧显示重组事件的9个F2植物 间的B基因周围的raR7(Tl)定位。PRR7(T1)以及927(T2)标志物显示了与B基因的预测 基因型完美匹配。B基因的基因型基于自F2植物个体衍生的F3群体的表型评估。(B-二 年生等位基因；A-—年生等位基因；H-对于一年生等位基因杂合的)
权利要求
1.一种核酸序列，其a)与如下的核酸序列具有至少70%的序列同一性；或b)包含如下核酸序列的至少15个连续核苷酸；或c)在严格条件下与如下的核酸序列杂交所述核酸序列选自如SEQ ID而1、4、5、6、7、8、9、10、53或讨之任一项中所列的核酸 序列的组。
2.依照权利要求1的核酸序列，其中所述核酸序列包含如SEQID NO :1、4、5、6、7、8、9、 10、53、或M之任一项中所列的核酸序列。
3.依照权利要求2的核酸序列，其中所述核酸序列包含如SEQID NO :8中所描述的核 酸序列，其中所述序列包含一个或多个核酸取代、缺失、或添加，如表7-1 ((图10中描绘的) 和表7-2(图11中描绘的)中所显示的，其中表7-1(图10中描绘的)和表7-2(图11中 描绘的)中显示的多态性分别代表SEQ ID NO :8中所描述的序列的18种一年生和2种二 年生等位基因。
4.多肽，其是由依照权利要求1至3中任一项的核酸序列编码的。
5.依照权利要求4的多肽，其具有选自下组的氨基酸序列如SEQID NO 11或12中 所描述的氨基酸序列。
6.嵌合构建体，其包含表达盒，所述表达盒包含在调节元件控制下，优选地在植物中有 功能的调节元件控制下的依照权利要求1至3中任一项的核酸序列。
7.依照权利要求6的嵌合构建体，其进一步包含选择标志基因，其容许在选择方法中 区分经转化的和未转化的植物材料。
8.依照权利要求6或7的嵌合构建体，其中为BvPRR7基因表达的转基因下调提供所述 嵌合构建体。
9.依照权利要求8的嵌合构建体，其用于BvPRR7基因表达的转基因下调，其中所述嵌 合构建体包含编码dsRNA的核酸分子序列，所述dsRNA能够靶向通过转录编码B基因蛋白， 优选地BvPRR7蛋白的DNA序列而生成的mRNA以进行降解。
10.依照权利要求9的嵌合构建体，其中编码所述dsRNA的核酸分子具有至少21个核 苷酸的长度，而且与所述BvPRR7基因的编码序列的至少一部分，优选地与依照权利要求1 至3中任一项的核酸序列基本上相同。
11.依照权利要求9或10的嵌合构建体，其中编码所述dsRNA的核酸分子具有在组成 型启动子，优选地来自拟南芥的启动子的控制下的如SEQID NO 1中所描述的核苷酸 序列。
12.依照权利要求9至11中任一项的嵌合构建体，其进一步包含来自马铃薯MLSl基 因的第二内含子的序列。
13.植物转化载体和/或植物表达载体，其包含依照权利要求6至12中任一项的嵌合 构建体。
14.依照权利要求13的植物表达载体，其是包含依照权利要求6至12中任一项的嵌合 构建体的RNAi表达载体。
15.依照权利要求14的RNAi表达载体，其中所述RNAi表达载体包含图11中所显示的 嵌合构建体。
16.植物细胞，其包含依照权利要求6至12中任一项的嵌合构建体或依照权利要求13 至15中任一项的载体。
17.依照权利要求16的植物细胞，其是糖用甜菜植物的植物细胞。
18.具有延迟抽苔的表型的转基因植物，优选糖用甜菜植物或其细胞、组织或种子，各 包含依照权利要求16或17的植物细胞或依照权利要求6至12中任一项的嵌合构建体或 依照权利要求1至3中任一项的核酸序列，其中所述转基因植物特别是糖用甜菜植物表达 所述dsRNA，从而延迟特别是抑制抽苔，并且所述植物展现出延迟抽苔的表型，优选为非抽 苔表型。
19.转基因植物，特别是糖用甜菜植物，其是自依照权利要求18的细胞、组织或种子生 成的。
20.一种生成杂种种子的方法，可以自所述杂种种子种植具有受调控的抽苔的表型的 植物特别是糖用甜菜植物，所述方法包括下列步骤a.提供具有受调控的抽苔的表型的植物系特别是糖用甜菜系，特别是依照权利要求 18或19的转基因糖用甜菜植物作为第一亲本系；b.提供具有不同基因型的第二植物系，特别是糖用甜菜系作为第二亲本系；其中步骤a)或步骤b)的所述亲本系之一是雄性不育cms系，且其中另一亲本系是雄 性能育，并c.容许所述雄性能育亲本系的植物传粉给第二雄性不育亲本系的花，让所述种子形 成，并收获所述杂种种子；其中收获的杂种种子是具有延迟抽苔的表型的杂种植物，特别是糖用甜菜杂种植物的 种子。
21.依照权利要求20的生成杂种种子特别是糖用甜菜杂种种子的方法，其中所述雄性 不育CMS糖用甜菜亲本系是近交糖用甜菜系，其包含依照权利要求1至3中任一项的核酸 或其片段。
22.具有延迟抽苔的表型的植物特别是糖用甜菜植物的杂种种子。
23.依照权利要求22的杂种种子，其中所述种子是通过权利要求20或21的方法生成的。
24.具有延迟抽苔的表型的杂种植物特别是杂种糖用甜菜植物，其是通过种植权利要 求22或23的杂种种子生成的。
25.植物部分，其选自下组种子、胚、小孢子、合子、原生质体、细胞、胚珠、花粉、直根、 子叶、提取物或生物学样品，它们衍生自依照权利要求18或19的转基因糖用甜菜植物或其 种子或依照权利要求22或23的杂种植物或其种子。
26.依照权利要求1至3中任一项的核酸序列或其片段用于转化植物细胞特别是糖用 甜菜植物细胞的用途。
27.转化植物细胞特别是糖用甜菜植物细胞的方法，包括使用依照权利要求1至3中 任一项的核酸序列或依照权利要求6至12中任一项的嵌合构建体或依照权利要求13至15 中任一项的载体。
28.依照权利要求18或19的转基因植物、依照权利要求M的杂种植物、或依照权利要 求25的植物部分在选自下组的方法中的用途糖生产的方法、需氧发酵的方法和厌氧发酵的方法，特别是在糖生产的方法中的用途。
29.用于生产糖的方法，其中加工依照权利要求18、19、对或25中任一项的糖用甜菜植 物、或其细胞或组织以生产糖。
30.自依照权利要求18、19、对或25中任一项的糖用甜菜植物、或其细胞或组织生成的糖。
31.多核苷酸标志物，其中所述标志物是基于核酸序列开发的，所述核酸序列可获自糖 用甜菜中显示与抽苔基因(B基因)相关表型完美共分离的基因组DNA区，且其中所述标志 物容许区分一年生与二年生基因型或区分展现出二年生或一年生表型的糖用甜菜植物的 植物分组内的不同单元型(haplotypes)。
32.依照权利要求31的多核苷酸标志物，其中所述核酸序列可获自依照权利要求1至 3中任一项的核酸序列。
33.依照权利要求31或32的多核苷酸标志物，其进一步包含一个或多个多态性，特别 是基于SNP、SSR、或至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但是特别是基于SNP的多态 性，该多态性诊断B基因座处的B等位基因。
34.依照权利要求33的多核苷酸标志物，其能够检测如SEQID NO :8所列的所述基因 组序列的不同等位基因中存在的和如表7-1(图10中描绘的)和表7-2(图11中描绘的) 中所显示的多种SNP的至少一种，其中所述多核苷酸标志物能够区分不同等位基因，特别 是区分一年生和二年生糖用甜菜系。
35.依照权利要求34的多核苷酸标志物，其能够检测至少一种选自下组的SNP，该组包 括如 SEQ ID NO 8 所列的序列的位置 #224、#351、#615、#897、#1082、#1841、#1915、#2334、 #11592、#12316、#12490、或#12544处的和如表7-1(图10中描绘的)和表7-2 (图11中描 绘的)中所显示的SNP。
36.多核苷酸标志物组，其包含权利要求31至35中任一项的多个多核苷酸标志物。
37.引物对，其由正向引物和反向引物组成，所述引物能够与糖用甜菜基因组DNA中显 示与抽苔基因(B基因)完美共分离的基因组区域内的核苷酸序列退火。
38.依照权利要求37的引物对，其与依照权利要求1至3中任一项的核酸序列退火，并 扩增依照权利要求31至35中任一项的多核苷酸或其信息部分，其中所述多核苷酸包含一 个或多个多态性，特别是一个或多个诊断B基因座处的B等位基因且容许区分一年生和二 年生基因型的多态性。
39.依照权利要求38的引物对，其选自下组a.引物对，其与BvPPR7的第三内含子中如SEQID NO 6中所描述的核苷酸序列退火， 并自包含多态性特别是包含位置#87处的C/T SNP和/或位置#160处的C/T SNP和/或 位置#406处的A/G SNP的多态性的所述区域扩增信息片段；b.弓丨物对，其与如SEQID NO :8所列的核苷酸序列退火，并自包含多态性的所述序列 扩增信息片段，所述多态性选自基于所述序列的不同等位基因中存在的SNP的多态性，如 表7-1 (图10中描绘的)和表7-2 (图11中描绘的)中所显示的。
40.依照权利要求39的引物对，其包含a.如SEQ ID NO :49中所描述的正向引物PRR7(T6)-F和如SEQ ID NO :50中所描述的 反向引物PRR7(T6)-R，用于扩增包含SNP#2334的片段；或b.如SEQID NO 13中所描述的正向引物PRR7 (Tl)-F和如SEQ ID NO: 14中所描述的 反向引物PRR7 (Tl) -R,用于扩增包含SNP#160的片段；或c.如SEQID NO :55中所描述的正向引物lr22(Tl)-F和如SEQ ID NO :56中所描述的 反向引物lr22(Tl)-R。
41.依照权利要求31至36中任一项的多核苷酸标志物、依照权利要求36的多核苷酸 标志物组、或依照权利要求37至40中任一项的引物对在等位区分测定法中的用途，所述等 位区分测定法用于鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在。
42.用于鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的等位区分测定 法，其容许区分一年生和二年生植物，其中使用依照权利要求31至36中任一项的多核苷酸 标志物、依照权利要求36的多核苷酸标志物组、或依照权利要求37至40中任一项的引物 对。
43.依照权利要求42的等位区分测定法，其包含下列步骤a.自要分析的糖用甜菜植物获得基因组DNA的样品，b.使用依照权利要求37至40中任一项的引物对自所述样品或基因组DNA扩增片段，并c.分别比较所扩增的片段与已知与二年生表型有关但与一年生表型无关的等位序列。
44.依照权利要求42或43的等位区分测定法，其中在步骤c)中用包含对一年生等位 基因特异性的序列的经第一荧光标记的探针分子探查步骤b)中获得的扩增片段，且其中 所述第一探针的染料荧光的升高指示一年生等位基因的存在。
45.依照权利要求44的等位区分测定法，其中另外用包含对二年生等位基因特异性的 序列的经第二荧光标记的探针分子探查步骤b)中获得的扩增片段，且其中所述第一探针 的染料荧光的升高仅指示一年生等位基因的存在。
46.一种在商业种子中鉴定一年生污染物的方法，其使用依照权利要求42至45中任一 项的基于标志物的等位区分测定法来进行。
全文摘要
本发明涉及具有延迟抽苔的表型的转基因糖用甜菜植物。本发明进一步涉及多核苷酸，其在糖用甜菜基因组内与抽苔基因或B基因紧密连锁，而且可以用于区分一年生与二年生基因型或展现出二年生基因型的糖用甜菜植株的植物分组内的不同单元型。
文档编号C12N15/82GK102057045SQ200980121061
公开日2011年5月11日 申请日期2009年5月25日 优先权日2007年5月23日
发明者托马斯·克拉夫特, 皮埃尔·平, 约翰尼斯·J·L·吉伦 申请人:先正达参股股份有限公司