修饰的显示增加的蛋白酶抗性的促红细胞生成素(epo)多肽及其药物组合物的制作方法

专利名称：修饰的显示增加的蛋白酶抗性的促红细胞生成素(epo)多肽及其药物组合物的制作方法
修饰的显示增加的蛋白酶抗性的促红细胞生成素(EPO)多肽及其药物组合物相关申请要求2008年5月四日提交的题为"Modified Erythropoietin (EPO) Polypeptides that Exhibit Increased Protease Resistance and Pharmaceutical Compositions Thereof"的美国临时申请61/130，376的优先权，该临时申请的申请人为Thierry Guyon， Giles Borrelly,Xavier Gallet，Lila Drittanti 和 Manuel Vega。允许时，上述申请的主题以其全文援引加入。本申请涉及2007年11月沘日提交的题为“MODIFIED ERYTHROPOIETIN POLYPEPTIDES AND USES THEREOF，，的美国申请 11/998，387，申请人为 Thierry Guyon,Giles Borrelly, Xavier Gallet，Lila Drittanti 和 Manuel Vega，本申请还涉及题为“MODIFIED ERYTHROPOIETIN POLYPEPTIDES AND USES THEREOF”的国际申请 PCT/GB2007/004520，申请人为 Thierry Guyon, Giles Borrelly, Xavier Gallet, Lila Drittanti 禾口 Manuel Vega, 其均要求2006年11月洲日提交的题为美国临时申请60/861，615的优先权。本申请还涉及2005年7月6日提交的题为“RATIONAL EVOLUTION OF CYTOKINES FOR HIGHER STABILITY,THE CYTOKINES AND ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES” 的美国申请 11/176，830，申请人 Rene Gantier, Thierry Guyon,Manuel Vega禾口 Lila Drittanti, 其公开为美国申请US 2006-0020116,其是2003年9月8日提交的题为“RATIONAL EVOLUTION OF CYTOKINES FOR HIGHER STABILITY,THE CYTOKINES AND ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES” 的美国申请 10/658，834 的继续申请，申请人 Rene Gantier, Thierry Guyon, Manuel Vega 和 Lila Drittanti，公开为美国申请 US-2004_013^77-A1。本申请也涉及 2005 年 8 月 2 日提交的题为 “RATIONAL DIRECTED PROTEIN EVOLUTION USING TWO-DIMENSIONAL RATIONAL MUTAGENESIS SCANNING” 美国申请 11/196，067，申请人 Rene Gantier, Thierry Guyon, Hugo Cruz Ramos, Manuel Vega 禾口 Lila Drittanti,公开为美国申请US-2006-0020396-A1，其为2003年9月8日提交的美国申请10/658，355的继续申请， 申请人:Rene Gantier,Thierry Guyon,Hugo Cruz Ramos,Manuel Vega禾口Lila Drittanti, 题为"RATIONAL DIRECTED PROTEIN EVOLUTION USING TWO-DIMENSIONAL RATIONAL MUTAGENESIS SCANNING”，公开为美国申请 2005-0202438。本申请还涉及2003年9月8日提交的美国申请10/658，834，以及公开的国际 PCT 申请 WO 2004/022593，申请人 Rene Gantier, Thierry Guyon, Manuel Vega 和 Lila Drittanti,题为“RATIONAL EVOLUTION OF CYTOKINES FOR HIGHER STABILITY, THE CYTOKINES AND ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES”。本申请还涉及 2003 年 9 月8日提交的美国申请10/658,355，以及国际PCT申请WO 2004/022747,申请人Rene Gantier, Thierry Guyon, Hugo Cruz Ramos, Manuel Vega 禾口 Lila Drittanti,题为 "RATIONAL DIRECTED PROTEIN EVOLUTION USING TWO-DIMENSIONAL RATIONAL MUTAGENESIS SCANNING”。上述申请的每一个的主题以其全文援引加入。发明领域本发明提供了修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽。所述EPO多肽经修饰以显示与相应的未修饰EPO多肽不同的物理性质和活性。编码这些多肽的核酸分子也在本发明提供。还提供了利用所述多肽进行治疗和诊断的方法。
背景技术：
临床使用的治疗性蛋白的有效递送是对药学科学的挑战。一旦在血流中，这些蛋白通常在短时间内通过不同的生理过程从循环中清除，包括代谢以及利用正常蛋白清除途径进行的清理，诸如肾过滤(例如肾小球)或血中的蛋白裂解。一旦到达消化道腔内，这些蛋白通常被腔内蛋白酶消化。后者可以是影响蛋白半寿期的限制性过程，所述的蛋白用作治疗剂，用于口服施用或皮下、静脉内或肌内注射中。与这些施用途径相关的问题是已知的并且已经试图利用多种策略来解决这些问题。此外，许多治疗性蛋白是糖基化的，而制备糖基化治疗性蛋白非常昂贵，高度可变并且很难进行。这些蛋白的非糖基化形式的制备通常由于蛋白降解而不可能实现。细胞因子家族是改善蛋白家族的施用和生物同化作用的临床工作和研究的焦点， 其中包括促红细胞生成素(EPO)。重组制备的EPO多肽被认可用于治疗各种贫血，诸如肾衰、慢性感染、癌和AIDS导致的贫血等；但是，仍然非常需要更为稳定的促红细胞生成素用于治疗。促红细胞生成素的血浆半寿期相对较短(Spivak，J.L.和Hogans，B. B.，Blood 73(1) :90-99(1989) ；McMahon, F. G. , et al.，Blood 76(9) 1718-1722 (1990))，因此，治疗性血浆水平会迅速降低，必须重复静脉内施用。由于天然存在的变体具有不良副作用以及施用、生物利用度以及短半寿期的问题，需要改善EPO的性质以用作生物治疗剂。因此，在本发明的目的中，一个目的是提供修饰的EPO多肽和其它治疗性多肽，其具有改善的治疗性质。

发明内容
本发明提供了配制为口服施用的药物组合物。所述组合物含有修饰的治疗性多肽或者所述修饰多肽的活性片段，其中所述修饰在所述活性片段中。所述修饰的治疗性多肽或其活性片段可以是糖基化的，部分糖基化的或去糖基化的(即未糖基化，如去除糖基化部分、抑制糖基化，以及在不糖基化所述多肽的宿主如细菌宿主中表达。所述治疗性多肽或其活性片段是含有至少一个糖基化位点、含有鉴别为蛋白酶抗性并称为鉴别为蛋白酶抗性的掩蔽的is-HIT残基的掩蔽残基处含有一或多个氨基酸修饰的多肽，且所述治疗性多肽或其活性片段与不含有所述一或多个氨基酸修饰的未修饰的治疗性多肽或其活性片段相比显示增加的蛋白酶抗性。所述掩蔽的is-HIT残基可以是所述多肽糖基化位点0-25人之内如 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 或 25 人之内的is-HIT残基。所述药物组合物中的修饰的治疗性多肽或其活性片段在掩蔽的is-HIT残基处可以含有 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 或更多个氨基酸修饰。其在掩蔽的 is-HIT 残基处可以含有 2,3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17， 18，19,20或更多个氨基酸修饰。在药物组合物的一些实施方案中，所述修饰的治疗性多肽或其活性片段含有至少2个氨基酸修饰，其中2个氨基酸修饰在被不同糖基化位点掩蔽的掩蔽is-HIT残基处。
所述修饰的治疗性多肽或其活性片段可以是细胞因子或其活性片段。细胞因子包括但不限于促红细胞生成素(EPO)、白细胞介素-1 β (IL-I)、白细胞介素2 (IL-2)、白细胞介素3 (IL-3)、白细胞介素4 (IL-4)、白细胞介素5 (IL-5)、白细胞介素6 (IL-6)、白细胞介素 9(IL-9)、干扰素-β (IFN-β)、干扰素-γ (IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、血小板生成素(TPO)、 白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、制瘤素M(OSM)和血管内皮生长因子(VEGF)。这种治疗性多肽的例子是选自包括 SEQ ID NO :2，237274，276，278，280，282，284，286，288， 290，292，294，296，298，300，302，304 和 306 任一个、其活性片段、或序列如 SEQ ID NO :2， 237274，276，278，280，282，284，286，288，290，292，294，296，298，300，302，304 和 306 任一所示的多肽的其他变体的等位基因变体、种的多肽的任意多肽。
当所述修饰的治疗性多肽或其活性片段是SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :237所示的促红细胞生成素(EPO)或其与具有SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :237所示序列的多肽具有至少或至少大约 60 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %，99 % 或更高序列相同性的等位基因变体或种变体或其他变体。所述EPO多肽中的掩蔽is-HIT残基可以在在选自N24，N38, N83和SU6的一或多个糖基化位点被糖基化掩蔽的残基处。这种掩蔽的is-HIT残基包括但不限于相应于SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :237的氨基酸残基的残基 R14, L16, L17, E18, K20, E21, E23, E31, L35, E37, P42, D43, E62, W64, L67, L69, L70, E72, L75, R76, L80, L81, P87, W88, E89, P90, L91, L93, D96, K97, P121, P122, D123, P129, L130, R131，D136，F138，R139，K140，L141，F142，R143和Y145或者在等位基因变体和种变体中的对应残基或其他残基。掩蔽的is-HIT残基被修饰的多肽的例子包括修饰的EPO多肽或活性片段，其中所述修饰是选自 R14H, R14Q, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E31Q, E31H, L35V, L35I, E37Q, E37H, P42S, P42A, D43Q, D43H, E62Q, E62H, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, P90S, P90A, L91I，L91V，L93V, L93I，D96Q，D96H, K97Q, K97T, P121S, P121A, P122S, P122A, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H 和 Y145I，如 K20Q, L80I, P90S, L93I, L93V, D96Q, D123N, L130I, R131H, R131Q, D136N, R139H, R139Q, R143H 和 R143Q,或K20Q，L80I, L93I，L93V和R139H和等位基因变体、种变体和其他变体中的对应修饰的一或多个氨基酸修饰。例如，所述修饰的治疗性多肽或其活性片段可以是修饰的ΕΡ0， 其中所述修饰选自 R139H ；L93I ；K20Q/R139H ；K20Q/R139H/L93I ；L80I/R139H/L93I ；K20Q/ R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/L80I/R139H/L93I ；R139H/L80I ；R139H/L93V ；R139H/ L93I ；K20Q ；K20Q/L93I ；L80I ；L93V ；K20Q/L80I ；和 K20Q/L93V,如 R139H, R139H/K20Q, K20Q/R139H/L93I ；L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/L80I/ R139H/L93I ；R139H/L80I ；R139H/L93V和R139H/L93I，和等位基因变体、种变体和其他变体中的对应修饰。
所述修饰的治疗性多肽或其活性片段可以进一步含有在非掩蔽is-HIT残基处的一或多个氨基酸修饰以及增加所述多肽的蛋白酶抗性或改变所述多肽的另一种性质或活性的其他修饰。当所述修饰的治疗性多肽或其活性片段是促红细胞生成素(EPO)多肽时，举例的非掩蔽is-HIT残基可以选自相应于SEQ ID NO :2或237的氨基酸残基P2， P3, R4, L5, C7, D8, RIO, L12, E13, Y15, C29, K45, F48, Y49, W51, K52, R53, M54, E55, L102, R103, L105, L108, L109, R110, L112, K116, E117, F148, L149, R150, K152, L153, K154, L155，Y156，E159，R162，D165和R166，以及等位基因变体、种变体和其他变体中的对应修饰。在非掩蔽is-HIT残基处的举例修饰包括P2A，P3S，P3A，R4H，R4Q，L5I，L5V，C7S， C7V, C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, Y15H, Y15I, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I, W51S, W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123Q, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H，和 R166Q，如 R4H ；F48I ； K52Q ；K116T ；R150H ；E159N ；K116N ；K45N ；K52N ；D165Q ；D165H ；D165N ；R166H ；和 L153V 或 R4H，K52N, L153V和E159N，以及等位基因变体、种变体和其他变体中的对应修饰。举例的修饰的治疗性多肽或其活性片段。这种修饰的治疗性多肽或其活性片段的例子是具有选自 R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ；R139H/E159N ；K20Q/R139H/R4H ；K20Q/R139H/ K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/R139H/E159N ；L80I/ R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/E159N ；L93V/R139H/K52N ； L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/E159N ；K20Q/L93I/R139H/ K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/ K52N/80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E 159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/R139H/E159N ；L93I/R139H/ K52N ；L93I/R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L153V ；K20Q/E159N ；K20Q/R4H ；K20Q/ K52N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/K52N/ L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/R4H ；K20Q/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/K52N/L80I/R139H ；R4H/K20Q/ L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/K52N/L153V；R4H/K20Q/L93I/ R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H；K20Q/L93V/ R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N,如 R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ； R139H/E159N；K20Q/R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/ E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/ R139H/R4H ；L93V/R139H/E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/ R139H ；K20Q/L93I/R139H/E159N ；K20Q/L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/ K20Q/L80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/L80I/R139H/L153V；K20Q/L93V/R139H/ R4H；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/ R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/ R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V；K20Q/L93I/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/ K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/K52N/L153V；R4H/K20Q/ L93I/R139H/K52N；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H ；K20Q/ L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N 或 K20Q/R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ； K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/ L93I/R139H/E159N ；K20Q/L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/ R139H ；K20Q/L80I/R139H/E159N；K20Q/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E 159N ； K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H ；K20Q/L801/Rl39H/E159N/K52N；K20Q/L801/Rl39H/E159N/ L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/ R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L931/Rl39H/E159N/R4H ； K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H/ L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N； R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H；K20Q/L93V/R139H/E159N/ K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N,和特别是 K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/L80I/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N,以及等位基因变体、种变体和其他变体中对应修饰的修饰的那些。
配制为口服施用的药物组合物中所述修饰的EPO多肽或其活性片段可以进一步在糖基化位点N24，N38和N83的一或多个处包括或多个氨基修饰，其中所述修饰消除了在所述位点处的糖基化。这种修饰包括在选自NMH，N38H, N83H, N24K, N38K和N8!3K的残基处的氨基酸置换和等位基因变体、种变体和其他变体中的对应修饰。
本发明还提供了特定的修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽。在提供活性片段时，其中发生修饰。所述修饰的多肽可以被配制在药物组合物中，包括用于口服和胃肠外施用或任何合适施用途径的那些。所述修饰的EPO多肽和/或其活性片段可以用于治疗易于用EPO治疗的疾病或病症。除了下文所述的修饰，本文提供的所述修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽还可以包括在糖基化位点 N24，N38和N83的一或多个处的一或多个氨基修饰，其中所述修饰消除了所述位点处的糖基化，如选自NMH，N38H, N83H, N24K, N38K和N8!3K的氨基酸置换。
本文提供的所述修饰的EPO多肽包括长度是160，161，162，163，164，165或166个氨基酸的那些多肽。所述未修饰的EPO多肽可以是具有或含有SEQ ID NO :2或237所示氨基酸序列的多肽，或可以是与具有SEQ ID NO :2或237所示序列的多肽具有至少或至少大 ^ 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 或更高序列相同性的等位基因变体或种变体或其他变体。所述修饰的EPO多肽或其活性片段可以保留所述未修饰多肽的一或多种活性。所述修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽可含有除了下述之外的修饰，其中所述修饰是羧基化、羟基化、hasylation、氨甲酰化、硫酸化、磷酸化、白蛋白化、氧化或与聚乙二醇(PEG)部分缀合的一或多种。所述修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽可含有除了下述之外的修饰，其中所述额外的氨基酸修饰导致所述修饰的治疗性多肽的免疫原性、羧基化、羟基化、hasylation、氨甲酰化、硫酸化、磷酸化、氧化、PEG化或蛋白酶抗性发生改变。
本发明提供了修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽，其在EPO多肽、其等位基因变体或种变体或其他变体的掩蔽的is-HIT残基处含有一或多个氨基酸修饰，其中所述在掩蔽的is-HIT残基处的一或多个氨基酸修饰选自相应于SEQ ID NO 2 或 237 所示残基的 R14H，L16I, L16V, L17I，L17V，E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I，E37Q，E37H, P42S, D43Q, D43H, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, L80V, L80I, L81I, L81V, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, L91I, L91V, L93V, L93I，D96Q，D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, D123H, D136Q, D136H, D136N, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, R143H, R143Q和Y145H ；以及所述修饰的EPO多肽与不包含所述一或多个氨基酸修饰的未修饰的EPO多肽相比显示增加的蛋白酶抗性。所述在上述掩蔽的is-HIT残基任一处的修饰可以是一种修饰。
本发明还提供了修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽， 其在EPO多肽、或其等位基因变体或种变体或其他变体的掩蔽的is-HIT残基处含有两或多个氨基酸修饰，其中所述两或多个氨基酸修饰在掩蔽的is-HIT残基处，选自相应于SEQ ID NO 2 或 237 所示残基的 R14H，R14Q, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E31Q, E31H, L35V, L35I, E37Q, E37H, P42S, P42A, D43Q, D43H, E62Q, E62H, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, P90S, P90A, L91I，L91V，L93V, L93I，D96Q，D96H, K97Q, K97T, P121S, P121A, P122S, P122A, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H 和 Y145I ；且所述修饰的EPO多肽与不包含所述两或多个氨基酸修饰的未修饰的EPO多肽相比显示增加的蛋白酶抗性。这种多肽的例子是含有任一如下修饰的那些K20Q/R139H ；K20Q/R139H/L93I ； L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/L80I/R139H/L93I ；R139H/ L80I ；R139H/L93V；R139H/L93I ；K20Q/L93I ；K20Q/L80I ；和 K20Q/L93V。
本发明还提供了修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的EPO 多肽，其在EPO多肽、或其等位基因变体或种变体或其他变体的掩蔽的is-HIT残基处含有一或多个氨基酸修饰以及在非掩蔽的is-HIT残基处的进一步修饰，其中所述在掩蔽的 is-HIT残基处的一或多个氨基酸修饰选自相应于SEQ ID N0:2或237所示残基的R14H， R14Q, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E31Q, E31H, L35V, L35I, E37Q, E37H, P42S, P42A, D43Q, D43H, E62Q, E62H, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I，D96Q，D96H, K97Q, K97T, P121S, P121A, P122S, P122A, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I，R131H， R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V,F142I，F142V，R143H，R143Q，Y145H和Y145I ；所述在非掩蔽的残基处的一或多个氨基酸修饰选自 P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I，E13Q，E13H, E13N, Y15H, Y15I, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I，W51S，W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123Q, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H，和R166Q ；且所述修饰的EPO多肽与不包含所述两或多个氨基酸修饰的未修饰的EPO多肽相比显示增加的蛋白酶抗性。这种多肽和其活性片段的例子是含有选自如下修饰的任意多肽或片段:R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ；R139H/E159N ；K20Q/ R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ； L80I/R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/ E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/ E159N ；K20Q/L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/ L80I/R139H/E159N ；K20Q/K52N/80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/ R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/ R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L153V ；K20Q/ E159N ；K20Q/R4H ；K20Q/K52N ；K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/ K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/R4H ；K20Q/K52N/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V；R4H/K20Q/ K52N/L80I/R139H ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/ K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N,如 K20Q/ L80I/R139H/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/ L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；K20Q/ L93V/R139H/E159N/K52N。
本发明还提供了修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽，其在EPO多肽修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽或其等位基因变体或种变体或其他变体中含有一或多个氨基酸修饰，其中所述修饰选自K20Q/ R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80U/R139H/L93I ； L80I/R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/ E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/ K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/K52N/L80I/R139H ；K20Q/ L93V/R139H/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/ L153V ；L93I/R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L93I ；K20Q/L153V ；K20Q/E159N ；K20Q/R4H ；K20Q/K52N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/ R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/ E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/K52N/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/ R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/R4H；K20Q/R139H/E159N ；K52N ；K20Q/R139H/ E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N；K20Q/L93I/ R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/K52N/L80I/R139H ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/ R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N；R4H/K20Q/ L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；K20Q/ L80I ；K20Q/L93V ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N。
本发明还提供了修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽， 其在EPO多肽、或其等位基因变体、种变体或其他变体中含有两或多个修饰，其中至少一个修饰是相应于SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :237所示氨基酸残基的R4H。其他修饰可以选自 P2S, P2A, P3S, P3A, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I，C7T，D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I，E13Q，E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I，E37Q，E37H, E37N, P42S, P42A, D43H, K45T, W51S, W51H, K52T, M54V, M54I，E62Q，E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I，D96Q， D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123H, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q，E159H，E159N，D165H，R166H，和 R166Q，如 K20Q ；F48I ；K52Q ；L80I ；P90S ；L93V ；L93I ； D96Q ；K116T ；L130I ；R131H ；R131Q ；R143H ；R143Q ；R150H ；D123N ；D136N ；E159N ；K116N ； K45N ；K52N ；D165Q ；D165H ；D165N ；R166H ；L16I ；L16V ；R139H ；R139Q ；和 L153V 或 K20Q ； F48I ；K52Q ；L80I ；L93V ；L93I ；K116T ；L130I ；R131H ；R143H ；R143Q ；R150H ；D123N ；E159N ； K116N ；K45N ；K52N ；D165H ；D165N ；L16I ；R139H ；R139Q ；禾口 L153V。举例的 EPO 多肽和其活性片段是具有在如下处的修饰或具有相应于如下的修饰的那些R4H/R150H ；R4H/R143H ； R4H/E159N；R4H/R139H；R4H/R139Q ；R4H/L93I ；R4H/D96Q ；R4H/L130I ；R4H/L153V；R4H/ K20Q ；R4H/F48I ；R4H/R131Q；R4H/K45N；R4H/K52N ；R4H/K52Q ；R4H/L80I ；R4H/K116T ；R4H/ D123N；R4H/D136N；R4H/P90S ；R4H/D165Q；R4H/D165H；R4H/D165N；R4H/K116N；R4H/R143H ； R4H/R166H ；R4H/L16I ；R4H/L16V ；R4H/L93I/R143Q ；R4H/L93I/R150H ；R4H/R143Q/R150H 和 R4H/L93I/E159N。
本发明还提供了修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽， 其在SEQ ID NO :2或237所示多肽的等位基因变体或种变体或其他变体中或在位置上具有修饰。
修饰的EPO多肽在EPO多肽或其等位基因变体或种变体或其他变体中包含一或多个氨基酸修饰，其中所述修饰的EPO多肽选自R4H/R150H ；R4H/R143H ；R4H/E159N ；；R4H/L130I ；R4H/L153V；R4H/K20Q ；R4H/ F48I ；R4H/R131Q；R4H/K45N ；R4H/K52N ；R4H/K52Q ；R4H/L80I ；R4H/K116T ；R4H/D123N ；R4H/ D136N ；R4H/P90S ；R4H/D165Q ；R4H/D165H ；R4H/D165N ；R4H/K116N；R4H/R143H；R4H/R166H； R4H/L16I ；R4H/L16V ；R4H/L93I/R143Q ；R4H/L93I/R150H；R4H/R143Q/R150H ；R4H/L93I/ E159N。
本发明还提供了编码本文提供的修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽任一的核酸分子。本发明提供了含有所述核酸分子的载体和含有所述载体和或核酸分子的细胞。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞，包括哺乳动物细胞和藻类细胞。
本发明还提供了含有本文提供的修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽和/或所述核酸、载体和/或细胞任一的药物组合物。所述药物组合物可以配制为用于任何施用途径，如用于口服、胃肠外、静脉内，皮内、皮下、口腔、吸入、粘膜内、直肠或局部施用。例如，所述组合物可以是液体、乳液、悬浮液、气雾剂、片剂、锭剂或包囊的形式，如肠溶包衣的片剂或包囊。所述药物组合物可以配制用于口服施用至胃肠道。
在本文所有实施方案中，包括药物组合物和方法和修饰的多肽的如下实施方案可以选择。当所述修饰的治疗性多肽是EPO时，其长度可以是160，161，162，163，164，165或 166个氨基酸。所述未修饰的多肽可以是氨基酸序列如SEQ ID NO :2或237所示的EPO多肽。所述显示增加的蛋白酶抗性的修饰的治疗性多肽可以保留与修饰的治疗性多肽在相同条件下的未修饰的治疗性多肽的一或多种活性或其他性质，包括当所述未修饰的治疗性多肽是完全糖基化的。所述修饰的治疗性多肽或其活性片段可以对消化道的蛋白酶显示增加的蛋白酶抗性。所述增加的蛋白酶抗性可以通过所述修饰的治疗性多肽在其口服施用或存在于消化道中时来显示。所述修饰的治疗性多肽或其活性片段可以包括进一步的修饰，包括例如羧基化、羟基化、hasylation、氨甲酰化、硫酸化、磷酸化、白蛋白化、氧化、或与聚乙二醇(PEG)部分缀合的一或多种。所述修饰的治疗性多肽或其活性片段可以含有导致修饰的治疗性多肽的免疫原性、羧基化、羟基化、hasylation、氨甲酰化、硫酸化、磷酸化、氧化、 PEG化或蛋白酶抗性发生改变的一或多个额外的氨基酸修饰。
所述药物组合物可以配制为固体、液体、凝胶或其他形式。当组合物配制为用于口服施用时，其可以配制为片剂或包囊，如肠溶包衣的片剂或包囊是肠溶包衣的。
本发明提供了治疗方法，其中给对象施用本文提供的任意药物组合物以治疗易于用特定治疗性多肽治疗的疾病或病症。所述组合物可以任何合适途径施用，包括但不限于胃肠外，如皮下，以及口服至消化道或配制为经口或鼻的粘膜施用。当所述修饰的治疗性多肽或其活性片段是修饰的促红细胞生成素(EPO)时，易于用EPO治疗的疾病或病症包括伴随肾衰竭、AIDS、恶性疾病和慢性炎症的贫血；围手术期手术；铁超载病症；异常止血；组织保护治疗；神经性障碍；和自体捐血。贫血可以是地中海贫血，镰刀细胞贫血，早产儿贫血， 伴随顺钼化疗的贫血，和大剂量放疗和/或化疗加骨髓移植后贫血。
附图简述

图1显示表示为带状的促红细胞生成素的两个视图(A和B)。3个N-连接的糖基化位点NM，N38和N83以及被选用于修饰蛋白酶抗性的代表性相应的残基(分别为K20Q， R139H和L80I)通过填充图中的空白来显示。被选用于蛋白酶抗性的另外的残基也通过填充图中的空白显示(例如，R4H，L153V，E159N)。
图2是鉴别为蛋白酶抗性的非掩蔽和掩蔽的is-HIT残基的卡通图示。所述非掩蔽残基在暴露于蛋白酶解的位点并且可以是被突变以赋予对蛋白酶解增加的抗性的位点。所述掩蔽残基是通过糖基化被正常屏蔽的位点，但是在所述多肽去糖基化时变成暴露的。所述掩蔽残基是可以被突变以赋予对蛋白酶解增加的抗性的位点，且在所述多肽去糖基化或部分糖基化时(例如糖基化位点突变时，在不能糖基化的宿主中表达和/或在体内施用时暴露于葡糖苷酶)的状态下对蛋白酶讲解提供保护。所述图是仅用来举例的促红细胞生成素(EPO)的卡通图示，但是掩蔽和非掩蔽的is-HIT残基可以在任何糖基化的治疗性多肽中鉴别。
发明详述 结构概述 A.定义 B.促红细胞生成素(EPO) C.修饰的EPO多肽显示增加的蛋白酶抗性 1.蛋白酶抗性 a.丝氨酸蛋白酶 b.基质金属蛋白酶 C.通过去除蛋白酶解位点对蛋白酶解增加的抗性 d.修饰的EPO LEAD多肽显示增加的蛋白酶抗性 2.Super-LEAD 3.其他EPO修饰 a.免疫原性 b.糖基化 C.额外或可选择的修饰 D.通过治疗性多肽的蛋白酶抗性修饰缺失的糖基化的补偿 1.鉴别掩蔽残基的方法 2.在掩蔽位点含有蛋白酶抗性修饰的EPO多肽 3.在掩蔽位点含有蛋白酶抗性修饰的其他治疗性多肽 a.GM-CSF b.M-CSF C.G-CSF d.LIF e.白细胞介素1β f.白细胞介素2 g·白细胞介素3 h.白细胞介素4 i.白细胞介素5 j·白细胞介素6 k.制癌蛋白M 1.干细胞因子 m.干扰素β η.干扰素Y 4.治疗性多肽的其他修饰 a.增加溶解度的修饰 E.进化或修饰EPO多肽和其他修饰的治疗性多肽的示例方法 1.非限制性理性诱变一维(ID)-扫描 2.二维QD)理性扫描(限制理性诱变) a.鉴别 in-silico HIT b.鉴别置换氨基酸 c.构建突变蛋白和生物学测定 3.三维(3D)扫描 a.同源性 b.3D-扫描(结构同源性)方法 4.Super-LEAD 禾口累力口定向诱变(additive directional mutagenesis) (ADM) 5.多重叠引物延伸 F.对蛋白酶解具有增加的抗性的EPO变体的评估 G.生产EPO多肽和其他治疗性多肽 1.表达系统 a.原核表达 b.酵母 c.昆虫和昆虫细胞 d.哺乳动物细胞 e.植物 2.纯化 3.融合蛋白 4.多肽修饰 5.核苷酸序列 H.评估修饰的EPO多肽性质和活性 1.体外测定 2.非人动物模型 3.临床测定 I.配制/包装/施用 1.施用修饰的EPO多肽和其他修饰的治疗性多肽 2.施用编码修饰的EPO多肽或其他修饰的治疗性多肽的核酸(基因治疗) J.治疗应用 1.贫血 2.组织保护性治疗 K.诊断应用 L.组合治疗 M.产品和试剂盒 N.修饰的EPO多肽和其他修饰的治疗性多肽的抗体 0.实施例 A.定义 除非另有说明，所有技术和科学术语都具有本领域技术人员常见的含义。所有专利，专利申请，公开出版物，GenBank序列，网站以及其他公开材料除非另有说明包含在此作为参考。如果本发明的术语有多种定义，以本部分中为准。描述URL或其他鉴定子或地址时，应理解所述鉴定子可改变并且因特网上的具体信息随时更新，相关信息可通过搜索因特网找到。其公开内容可作为公众所得的依据。
本发明中，“治疗性多肽”是给动物诸如人对象施用的多肽，用于治疗疾病或病症。 治疗性多肽是本领域已知的，通常是具有体内活性的多肽，诸如细胞因子(例如，促红细胞生成素(EPO))，并可经研究治疗疾病或病症(即缓解疾病或病症的症状)。所述多肽可通过任何方法制备，由此包括但不限于，重组产生的多肽，合成产生的多肽，治疗性多肽，其提取自细胞或组织和其他来源。从任何来源分离或制备的成熟治疗性多肽长度不同。治疗性多肽的异源性根据所述治疗性多肽的来源不同。由此治疗性多肽指制备或分离的异源群体。 同源制备物将说明其为同源的。治疗性多肽还涉及它们的单体、二聚体或其他形式的多聚体。
人治疗性多肽包括等位基因变体同种型，编码核酸分子产生的合成分子，分离自人组织和细胞的蛋白，合成蛋白及其修饰形式。示例性未修饰的成熟人治疗性多肽包括但不限于，未修饰的和天然(即野生型)治疗性多肽和包含信号肽的未修饰的以及天然前体治疗性多肽和/或原肽，以及多形性天然治疗性多肽。其他示例性人治疗性多肽是在N-或 C-末端截短的那些。
治疗性多肽也包括治疗性多肽的等位基因变体或种变体，以及其截短形式或片段，其中含有除增加蛋白酶抗性的修饰以外的修饰。治疗性多肽包括来自不同物种的同源多肽，包括但不限于动物，包括人和非人物种，诸如其他哺乳动物。与人治疗性多肽一样， 非-人治疗性多肽也包括足够长的治疗性多肽的不同长度或片段或部分或包括保持全长成熟多肽的至少一种活性的适当区域。
非-人治疗性多肽包括治疗性多肽，等位基因变体同种型，从核酸制备的合成分子，从非人组织和细胞分离的蛋白，以及其修饰的形式。非人来源的治疗性多肽包括但不限于，牛，绵羊，猪，马，鼠，野兔，犬，猫，禽和其他灵长类，诸如黑猩猩和短尾猿来源的治疗性多肽。
本发明中，“天然治疗性多肽”指存在天然生物体中天然存在的基因编码的治疗性多肽，所述生物体包括人或其他动物。天然治疗性多肽包括编码的前体多肽，其片段或加工的形式，诸如缺乏信号肽的成熟形式以及任何翻译前或翻译后加工或修饰的形式。天然治疗性多肽还包括经过翻译后修饰的那些，所述修饰包括但不限于通过糖基化，羧化，羟基化，hasylation,氨甲酰化，硫酸化，和磷酸化修饰的那些。
本发明中，非-糖基化的多肽是不具有糖基化的多肽(即不含附着于蛋白糖基化位点的碳水化合物部分)。非糖基化多肽通过在宿主诸如原核宿主中表达产生，所述的宿主不糖基化所述多肽，或通过消除所有糖基化位点(例如糖基化位点突变)产生。
本发明中，糖基化位点指多肽中可连接碳水化合物部分的氨基位置。通常糖基化蛋白含有一或多个氨基酸残基，诸如精氨酸或丝氨酸以连接碳水化合物部分。
本发明中，完全糖基化的多肽是在该多肽中所有天然糖基化位点均被糖基化的多肽。
本发明中，去糖基化的多肽与天然糖基化蛋白相比糖基化减少，因为其中附着多肽的碳水化合物部分较少，诸如由于通过突变去除了较少直到所有糖基化位点。去糖基化的多肽也包括其中一或多个碳水化合物部分通过化学或酶裂解去除或部分去除的多肽。
本发明中，天然糖基化位点指天然多肽天然生成时其中连接碳水化合物部分的氨基。
本发明中，“天然多肽”指生物体包括人或其他动物中天然存在的基因编码的多肽。
本发明中，术语“在相同条件下产生”指利用相同的生产方法产生每种多肽来制备两或多种多肽。
本发明中，“促红细胞生成素”多肽(EPO)指任何促红细胞生成素多肽，包括但不限于，重组产生的多肽，合成产生的多肽，天然EPO多肽，从细胞以及组织提取的促红细胞生成素多肽，所述组织包括但不限于肾、肝、尿和血液。促红细胞生成素的其他名称包括印oietin。促红细胞生成素简称包括EPO，hEPO (人促红细胞生成素)，和rhuEP0(重组人促红细胞生成素)。促红细胞生成素包括不同物种的相关多肽，包括但不限于人或非人源动物。人促红细胞生成素(hEPO)包括促红细胞生成素，等位基因变体同种型，来自核酸的合成分子，分离自人组织和细胞的蛋白质，及其修饰形式。示例性未修饰的成熟人促红细胞生成素多肽包括但不限于，未修饰的野生型天然促红细胞生成素多肽(诸如包含序列SEQ ID NO :2或237的多肽)以及未修饰的包括信号肽的野生型前体促红细胞生成素多肽(例如， SEQ ID N0:1的前体EPO多肽)。本领域技术人员理解成熟促红细胞生成素多肽(SEQ ID NO 2)的位置与前体EPO多肽SEQ ID NO 1相差27个氨基酸残基，SEQ ID NO :1是含有信号肽序列的促红细胞生成素多肽。SEQ ID NO :2的第1个氨基酸残基“对应”SEQ ID NO=I 的第观个氨基酸残基。术语“促红细胞生成素”也包括从成熟EPO多肽(SEQ ID NO 2)通过蛋白酶解裂解C末端精氨酸制备的促红细胞生成素多肽或C末端精氨酸已经去除的重组 EPO多肽(例如，SEQ ID NOS :236 (前体)和237 (成熟))。本发明的EPO多肽可进一步修饰，诸如通过化学修饰或翻译后修饰。所述修饰包括但不限于，PEG化，白蛋白化，糖基化， 法尼基化(farnysylation)，羧化，羟基化，hasylation，氨甲酰化，硫酸化，磷酸化，和其它已知多肽修饰。本发明的EPO多肽可通过对一级氨基酸序列的缺失、添加或取代一或多个氨基酸进一步修饰。
任何物种的促红细胞生成素包括促红细胞生成素(本发明中，种变体)，包括人和非-人物种。非-人来源EPO多肽包括但不限于，鼠、犬、猫、野兔、禽、牛，绵羊，猪，马， 鱼，蛙和其他灵长类的促红细胞生成素多肽。示例性非-人来源EPO多肽包括，例如，猕猴 (Macaca mulatta，例如，SEQ ID N0:202)，小鼠(Mus musculus，例如，SEQ ID N0:203)，大鼠(Rattusnorvegicus，例如，SEQ ID NO :204)，猪(Sus scrofa，例如，SEQ ID NO :205)， 犬(Canis familiaris，例如，SEQ ID NO :206)，猫(Felis catus，例如，SEQ ID NO :207)， 兔(Oryctolagus cuniculus，例如，SEQ ID NO :208)，公牛(Bos taurus，例如，SEQ ID N0:209)，马(Equus caballus，例如，SEQ ID N0:210)，绵羊(Ovis aries，例如，SEQ ID NO: 211)，黑猩猩(Pan troglodytes，例如，SEQ ID NO :212)，斑马鱼(Danio rerio，例如， SEQ ID NO :213)，日本河飩鱼(Takifugu rubripes，例如，SEQ ID NO :214)，猩猩(Pongo pygmaeus，例如，SEQ ID NO :225)，大猩猩(Gorilla gorilla，例如，SEQ ID NO :226)等 (例如，SEQ ID NOS :215-224)。通常，人EPO多肽种变体与人EPO多肽相比具有至少40%， 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 或更高氨基酸相同性。
人和非-人EPO多肽包括EPO多肽，等位基因变体同种型，组织特异性同种型和等位基因变体，具有一或多个氨基酸突变、取代、缺失、插入或添加的合成变体，通过翻译核酸制备的合成分子，分离自人和非人组织和细胞的蛋白，嵌合EPO多肽及其修饰形式。人和非-人EPO也包括足够长的EPO的片段或部分或包括适宜区域以保持全长成熟多肽的至少一种活性。另外，本发明中的修饰EPO多肽的片段或部分包含一或多个本发明所述的氨基酸修饰(例如表3所示氨基酸修饰)。
本发明中，“成熟促红细胞生成素”指缺乏信号序列的EPO多肽。通常信号序列靶向蛋白用于通过内质网(ER)高尔基途径分泌并在插入ER中之后的翻译过程中被裂解。因此，成熟EPO多肽通常是分泌型多肽。一个实例中，成熟人EPO多肽如SEQ ID N0:2所示。 SEQ ID NO 2所示氨基酸序列与SEQ ID NO 1所示前体多肽的区别在于SEQ ID N0:2缺少信号序列，所述信号序列包括SEQ ID NO 1的残基1-观。
本发明中，“天然促红细胞生成素”指存在生物体包括人或其他动物中的天然EPO 基因编码的EPO多肽。天然EPO多肽包括编码的前体多肽，其片段，以及加工的形式，诸如缺乏信号肽的成熟形式以及任何翻译前或翻译后加工的或修饰的形式。例如，人表达ΕΡ0。 示例性天然人EPO序列是SEQ ID NO 1(具有信号肽的前体ΕΡ0)和SEQ ID NO 2 (缺乏信号肽的成熟ΕΡ0)。天然EPO多肽还包括经翻译后修饰的那些，包括但不限于通过糖基化，羧化，羟基化，hasylation，氨甲酰化，硫酸化，和磷酸化修饰。天然EPO多肽也包括在SEQ ID NO 2的R166发生蛋白酶解裂解的那些。其他动物产生天然ΕΡ0，包括但不限于，灵长类，小鼠，大鼠，猪，狗，猫，兔，鸡，牛，羊，蛙和鱼。其他动物的示例性天然EPO序列如SEQ ID NOS 202-226 所示。
本发明中，“蛋白酶-抗性多肽”是与天然或野生型多肽相比其一级氨基酸序列中包含一或多种修饰并与没有所述一或多个氨基酸取代的天然或野生型多肽相比显示增加的蛋白酶解抗性的蛋白。
本发明中，经对一级结构的改变进行修饰而具有蛋白酶抗性的多肽指在多肽的一级序列中的一或多个氨基酸修饰的多肽，其赋予蛋白酶抗性。其中包括不导致在该位点的翻译后修饰的改变。
对蛋白酶抗性增加可通过检测暴露于胃肠道和/或血清中的具体蛋白酶之后的活性来评估。通常与缺乏赋予所述抗性的氨基酸序列中的改变的相同多肽相比，蛋白酶抗性增加至少约 1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，20%，30%，40%，50%， 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300%,400%, 500%,或更多。其他实施方案中，与缺乏赋予抗性的氨基酸序列改变的相同多肽相比，口服配制剂中变体多肽的蛋白酶抗性增加至少2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，80倍，90倍，100倍，200倍，300倍， 400倍，500倍，600倍，700倍，800倍，900倍，1000倍，或更多。
本发明中，“蛋白酶解抗性”指多肽被蛋白酶解剂的裂解的任何量的降低，诸如蛋白酶。这可通过修饰易被具体蛋白酶裂解的多肽中的具体氨基酸残基使得该多肽与没有所述修饰的多肽在相同蛋白酶、相同条件下相比对裂解的易感性降低。显示蛋白酶解抗性增加的修饰的多肽与缺乏所述氨基酸修饰的相同多肽相比显示例如，1^,2% ,3^,4^,5%, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % , 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %,或更多的蛋白酶解抗性。
本发明中，“蛋白酶，” “蛋白质酶”或“肽酶”可互换使用，指催化共价肽键的水解的酶。蛋白酶包括，例如，丝氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸内肽酶构成一类肽酶，特征是存在位于酶活性中心的丝氨酸残基。丝氨酸蛋白酶参与机体的多种功能，包括血液凝结、炎症以及原核生物和真核生物中的消化酶。“丝氨酸蛋白酶”裂解的机制基于丝氨酸对靶肽键的亲核攻击。半胱氨酸，苏氨酸或与天冬氨酸或金属结合的水分子也起到这样的作用。丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的排列的侧链形成大多数丝氨酸蛋白酶常见的催化三体。丝氨酸蛋白酶活性位点形状是裂缝状，其中结合有多肽底物。多肽底物N 末端到C末端的氨基酸残基标记为(Pi,…，P3，P2，P1，P1'，P2'，P3'，…，Pj)。代表性结合亚位点被标记(Si，...，S3，S2，S1，S1'，S2'，S3'，...，Sj)。裂解在Pl和PI，之间催化。
本发明中，基质金属蛋白酶(MMP)指任何家族的金属依赖性，诸如Si2+-依赖性，内肽酶，其降解细胞外基质(ECM)的组分。MMP包括四个类型胶原蛋白酶，基质降解酶，膜型金属蛋白酶以及明胶酶。MMP和纤溶酶原激活物的蛋白裂解活性，以及其抑制物，对于保持 ECM完整性是重要的。细胞-ECM反应影响并介导多种过程，包括各种细胞类型的增殖，分化，粘附以及迁移。MMP也加工多种细胞表面因子，受体和其他可溶蛋白并参与组织重构，诸如创伤愈合，怀孕和血管生成。在体内生理条件下，MMP作为非活性前体(酶原)合成并被裂解以产生活性形式。此外，所述酶被称为基质金属蛋白酶抑制物(TIMPs)的内源性抑制物特异性调节。
本发明中，相应的残基指与等位基因变体或种变体或其他同种型多肽相比而言的残基。本领域技术人员可轻易鉴定所述多肽中的相应残基。例如，通过排列EPO多肽的序列，本领域技术人员可鉴定相应的残基，利用保守且相同的氨基酸残基作为指引。例如，SEQ ID N0:2(成熟促红细胞生成素)的Al对应SEQ ID NO :1 (前体促红细胞生成素，其具有信号肽序列)的A28。另外的情况中可鉴定相应的区域。本领域技术人员可利用保守氨基酸作为指引发现人和非人序列中的相应氨基酸残基。例如，前体人EPO SEQ ID N0:1的残基 P148(成熟人EPO SEQ ID NO :2的残基P121)对应前体小鼠EPO SEQ ID NO :203中的残基 P147。
本发明中，促红细胞生成素(EPO)多肽或其他治疗性多肽的“活性部分或片段”指多肽的部分，其包括至少一种本发明的修饰并显示活性，诸如全长多肽的一或多种活性或具有其他活性。例如，对于EPO多肽，所述活性包括但不限于，红细胞生成或组织保护活性。 活性可为全长多肽活性的百分数(更多或更少)，包括但不限于与全长多肽相比1%，2%，3%,4%,5%, 10%, 20%, 30%,40%, 50%,60%, 70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % 的活性，或更高的活性。所述活性可通过经验确定。确定EPO多肽或其他修饰的治疗性多肽的功能或活性的实验包括本领域已知的那些，本发明中也进行了举例说明。EPO多肽的测定包括，例如，但不限于红细胞增殖实验，细胞存活实验或临床试验以测定治疗性益处。活性也包括EPO多肽的片段或修饰的形式或其他修饰的治疗性多肽具有而全长多肽或未修饰的EPO多肽不具有的活性。
本发明中，“未修饰的靶蛋白，” “未修饰的蛋白，” “未修饰的多肽，” “未修饰的ΕΡ0，” “未修饰的治疗性多肽”以及其语法变体指这样的起始多肽，其被选用于本发明所述的修饰。起始靶多肽可为天然存在的野生型多肽。此外，起始靶多肽可改变或突变，从而与天然野生型同种型不同，但相对于修饰的多肽在本文也称为起始未修饰靶多肽。因此，本领域已知的存在蛋白被修饰从而与未修饰的参比多肽相比具有所需的具体活性或性质的增加或降低可被选出并用作起始未修饰靶蛋白。例如，这样的蛋白可为靶蛋白通过一或多个但氨基酸改变对其天然形式修饰并具有所需的性质的增加或降低，诸如免疫原性降低(见例如，美国专利申请2004-0063917，2005-0220800，2006-035322，和 2006-0073563)或改变其氨基酸残基以改变糖基化，在本文称为未修饰的蛋白，以相同或不同性质的进一步修饰。本领域已知的示例性修饰的EPO多肽包括任何EPO多肽例如，美国专利 4，703，008，4，835，260，5，457，089，5，614，184，5，856，298，6，831，060，6，555，343， 6，831，060，和 7，041，794 ；美国专利申请 2004-0063917，2005-0107591，2005-0176627， 2006-029094,和 2006-0008872 ；国际专利公开 W08603520, EP0640619, W004003176, EP1228214, W005103076, W09424160W09012874 中所述的那些。
现有技术中已知的现存蛋白质可以如本文所述选择和使用以鉴别在其它结构同源的靶蛋白质上的结构同源的基因座，所述现存蛋白质先前已被修饰以在特定生物学活性或性质中与未修饰的或参考蛋白质相比具有希望的改变如增加或降低。例如，已通过一或多个单氨基酸变化修饰并具有希望的性质或活性例如对蛋白酶解的抗性的增加或降低的蛋白质可以用于本文提供的方法中，以在结构同源的靶蛋白质上鉴别相应的结构同源的基因座，所述基因座可以用合适的置换氨基酸置换并测试其希望的活性的增加或降低。
如本文所用，EPO多肽或其他治疗多肽的“活性”或“功能活性”是指由所述多肽显示的任何活性。这种活性可以凭经验确定。对于EPO多肽，这种活性包括但不限于促红细胞生成或组织保护活性。活性可以用已知的测定体外或体内评估。例如，对于EPO多肽，活性可以通过体外或体内测量红细胞增殖而评估。这种测定的表明多肽显示活性的结果可以与多肽的体内活性相关，其中体内活性可以被称为治疗活性或生物学活性。修饰的多肽的活性可以是未修饰多肽活性的任何百分比水平，包括但不限于与未修饰多肽相比的活性、 2%,3%,4%,5% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%, 94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或更多活性。用于确定EPO修饰形式的功能性或活性的测定是本领域技术人员已知的。举例性的评估EPO多肽活性的测定包括促红细胞生成测定，其测量红细胞增殖并在实施例中描述。
如本文所用，“治疗活性”是指治疗多肽的体内活性。通常，治疗活性是用于治疗疾病或病症的活性。修饰多肽的治疗活性可以是未修饰多肽的治疗活性的任何百分比水平，包括但不限于与未修饰多肽相比的1%活性，2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%, 200 300%,400%, 500 %或更多治疗活性。
如本文所用，糖基化对于“治疗活性是所需的”或“对于治疗活性是重要的”是指多肽的糖基化形式具有比治疗多肽的去糖基化或非糖基化形式(即未糖基化的多肽形式， 如在细菌宿主中表达的多肽)更高的治疗活性(当施用时的体内活性)。例如，如果糖基化多肽的治疗活性高于非糖基化形式，特别是非糖基化形式不能用于治疗时，糖基化是治疗活性所需的。这种活性差异依赖于蛋白质，但是本领域技术人员能认识到特定蛋白质是否适合治疗用途。这种蛋白质的举例是促红细胞生成素(EPO)，其是糖基化蛋白，并且作为糖基化蛋白治疗性施用。糖基化治疗蛋白形式与非糖基化形式的活性差异如所述依赖于蛋白质，但是可以比治疗多肽的去糖基化或非糖基化形式的治疗活性高15 %、25 %、30 %、50 %、 100%，包括至少或大约1倍，至少或大约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、 20 倍、30 倍、40 倍、50 倍、60 倍、70 倍、80 倍、90 倍、100 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500 倍、 600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或更多倍。
如本文所用，“显示至少一种活性”或“保持至少一种活性”是指由修饰的多肽如修饰的EPO多肽或其它治疗多肽显示的与不含修饰的多肽相比的活性。保持未修饰多肽的活性的修饰多肽可以显示改良的活性或保持未修饰多肽的活性(例如，EPO多肽的促红细胞生成或组织保护活性)。在一些情况中，修饰多肽可以保持与未修饰多肽相比增加的活性。在一些情况中，修饰多肽可以保持与未修饰多肽相比降低的活性。修饰多肽的活性可以是未修饰多肽活性的任何百分比水平，包括但不限于与未修饰多肽相比的活性、2%、 3%,4%,5% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更高活性。例如，修饰 EPO 多肽保持至少大约或 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少 99% 的未修饰多肽的活性。在其它实施方案中，活性变化高于未修饰多肽至少大约2倍、3倍、4倍、 5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、 200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或更多倍。保持活性的测定取决于待保持的活性。这种测定可以体外或体内进行。活性可以例如用现有技术已知并且在下述实施例中描述的测定测量，例如但不限于细胞增殖和细胞存活活性。与未修饰多肽相比修饰多肽的活性也可以基于在施用多肽后体内治疗或生物学活性或结果评估。例如，对于EPO多肽，这种活性包括但不限于血细胞比容水平、网织红细胞计数、红细胞质量、 血浆铁周转率、骨髓通过时间(marrow transit time)或血红蛋白浓度(即血红蛋白C合成刺激)或网织红细胞应答刺激中的改变。
如本文所用，促红细胞生成素或其它治疗多肽的“性质”是指促红细胞生成素多肽或治疗多肽显示的任何性质。这种性质包括但不限于蛋白质稳定性、蛋白酶解抗性、构象稳定性、热耐受性及PH条件耐受性。性质变化可以改变多肽的“活性”。例如，治疗多肽的蛋白酶抗性的变化可以改变体内治疗多肽。
如本文所用，“蛋白质稳定性”是指在一或多种条件下增加的蛋白质半寿期，所述条件包括但不限于暴露于蛋白酶、增加温度、特定PH条件和/或暴露于变性成分。由多肽显示的增加的蛋白质稳定性可以体现为增加的蛋白酶抗性或增加的构象稳定性如增加的温度、PH耐受性或对其它变性成分的耐受性。显示体外或体内增加的蛋白质稳定性的修饰多肽比修饰多肽更稳定例如1% >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%, 40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%, 100%,200%,300%,400%,500%或更高。多肽的蛋白质稳定性例如可以在蛋白酶抗性或构象稳定性(例如对温度变化的抗性)测定中评估以确定多肽的活性是否改变，如下述实施例所述。例如，修饰多肽与野生型多肽相比对蛋白酶(例如α-胰凝乳蛋白酶，羧肽酶， 内蛋白酶Arg-C，内蛋白酶Asp-N，内蛋白酶Glu_C，内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶)酶解的抗性可以凭经验测试，其是通过用蛋白酶处理多肽一定时间，然后测试多肽的残余功能活性如促红细胞生成或组织保护活性。
如本文所用，“血清稳定性”是指血清中的蛋白质稳定性。
如本文所用，“蛋白酶解抗性”是指蛋白酶解剂如蛋白酶对多肽裂解的任何量的降低。这可以通过修饰对特定蛋白酶裂解敏感的特定氨基酸残基以使它们与在相同条件下由相同蛋白酶的裂解相比对裂解较不敏感。显示增加的蛋白酶解抗性的修饰多肽显示例如比未修饰多肽高 1% >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%, 60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%, 300 %、400 %、500 %或更多的蛋白酶解抗性。
如本文所用，“蛋白酶敏感位点”是多肽中对特定蛋白酶裂解敏感的氨基酸位置。 蛋白酶敏感位点在本文中与蛋白酶识别位点或蛋白酶裂解位点互换使用。
如本文所用，“构象稳定性”是指多肽对变性的耐受性的任何量的增加。这可以如下实现修饰对变性条件敏感的特定氨基酸残基以使它们在相同条件下对变性较不敏感。 构象稳定性可以通过评估多肽对变性条件的抗性或易感性而确定，例如对温度或PH的抗性。显示增加的构象稳定性的修饰多肽显示例如高于未修饰多肽1%、2%、3%、4%、5%、 6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%, 94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更多的抗性。
如本文所用，“变性”是指蛋白质结构中的任何非共价变化。这一变化可以改变多肽分子的二级、三级和/或四级结构。多肽的变性可以通过例如但不限于暴露于离液剂如脲和盐酸胍、去污剂、温度、PH和裂解二硫桥的试剂如二硫苏糖醇而实现。
如本文所用，“热耐受性”是指任何温度影响的或依赖的蛋白质稳定性的变化。例如，一种变化如增加的热耐受性，可以反映在暴露于改变的(特别是增加的)温度之后或与相同条件下的未修饰蛋白质相比降低的多肽变性的量。显示增加的热耐受性的修饰多肽显示出在变化的温度下与未修饰多肽相比高1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%,99%,100%,200%,300%,400%,500%或更高的稳定性。例如，修饰多肽当给对象施用时可以显示与未修饰多肽相比增加的体内热耐受性，由此显示增加的血清半寿期。
如本文所用，"EC5tl”是指产生一半的最大应答所需的治疗多肽的有效浓度。为本文目的，所测量的应当是EPO的任何活性，例如但不限于在促红细胞生成或组织保护测定中的活性。
如本文所用，“半寿期”是指测量的参数如多肽分子的效力、活性和有效浓度下落到其原始水平的一半如其在0时间点的原始效力、活性或有效浓度的一半所需的时间。因此，多肽分子的参数如效力、活性或有效浓度通常随时间测量。为本文目的，半寿期可以体外或体内测量。例如，治疗多肽或修饰的治疗多肽的半寿期可以体外测量，即在一定条件下，例如在暴露于蛋白酶或变性条件如温度或PH下评估在保温后随时间增加的活性(例如促红细胞生成或组织保护活性)。在另一个实施例中，治疗多肽或修饰的治疗多肽的半寿期可以在将多肽施用(例如静脉内、皮下、十二指肠内、口服)给人类或其它动物后体内测量， 随后随时间取血样以确定血样中多肽的剩余有效浓度和/或活性。
如本文所用，“治疗多肽介导的疾病或病症”是指任何这样的疾病或病症，其中用治疗多肽(或修饰的治疗多肽)治疗改善了该疾病或病症的任何症状或表现。
如本文所用，“促红细胞生成素或EPO介导的疾病或病症”是指任何这样的疾病或病症，其中用促红细胞生成素(或修饰的促红细胞生成素)治疗改善了该疾病或病症的任何症状或表现。举例的促红细胞生成素介导的疾病或病症包括但不限于贫血如慢性炎症、 肾衰竭、AIDS、恶性肿瘤导致的贫血或使用EPO多肽的组织保护活性以在应答性哺乳动物细胞、组织或器官损伤后保护抗损伤或功能恢复的疾病或病症。
如本文所用，“治疗”患有疾病或病症的对象是指对象的症状部分或完全减轻，或者在治疗后保持稳定。因此治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防是指防止潜在疾病或病症和/或防止症状恶化或疾病或病症的进展。防止疾病或病症包括减轻或消除导致疾病或病症发生的一或多种风险因子。治疗还包括本文提供的修饰的治疗多肽和口服组合物的任何药物学应用。
如本文所用，治疗包括预防、治疗和/或治愈。例如，治疗包括本文提供的修饰的促红细胞生成素或其它治疗多肽及本文提供的其组合物的任何药物学应用。
如本文所用，预防是指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病的进展。
如本文所用，防止是指绝对防止特定疾病或病症。因为通常不能确定疾病或病症是否从未发生，因此防止还包括降低发生或患有疾病或病症的风险。
如本文所用，不包括外源加入的蛋白酶的组合物是未添加蛋白酶而配制的组合物。组合物中存在的任何另外的蛋白酶产生自配制方法。
如本文所用，“施用的治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指至少足以在对象中产生治疗作用的剂量配制品(dosage formulation)中的药剂、化合物、材料的量。典型地，所述的量足够高，以在血液中达到治疗有效量。要达到的血液中的治疗有效量对于方法中采用的许多治疗多肽是已知的，针对未修饰多肽已建立剂量配制品有效剂量。对于修饰蛋白质， 用于治疗的蛋白酶抗性多肽的治疗有效量将根据被治疗的特定条件、被治疗的患者的年龄及物理条件、病症的严重性、治疗持续时间、并行治疗的性质、采用的特定蛋白酶抗性多肽、 特定的药物学可接受赋形剂和/或主治医师的知识和技能范畴内的因素而变化。
如本文所用，术语“药物学可接受赋形剂”包括任何本领域技术人员已知的生理学惰性、药物学无活性材料，其与选择使用的特定蛋白酶抗性多肽的物理化学特征相容。药物学可接受赋形剂包括但不限于聚合物、树脂、增塑剂、填充剂、润滑剂、溶剂、共溶剂、缓冲系统、表面活性剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、药物级染料或颜料及粘度剂。本文描述的药物组合物中含有的药物学可接受赋形剂的全部或部分可以是肠溶包衣的部分。
如本文所用，治疗多肽的“ 口服施用”或“ 口服递送”是指通过摄食而将治疗多肽施用给胃肠道。典型地，本文提供的用于口服施用的组合物与粘膜递送不同之处在于治疗多肽被递送至低位肠道以吸收进血液。
如本文所用，术语“低位肠道”是指小肠和大肠。
如本文所用，“粘膜施用”或“粘膜递送”治疗多肽是指将治疗多肽施用粘膜表面， 包括鼻、肺、阴道、直肠、尿道和舌下或颊递送。
如本文所用，“口腔粘膜(oromucosal)，，是指口腔和/或鼻咽腔的粘膜层。
如本文所用，术语“肠溶包衣”涉及药物学可接受赋形剂的混合物，其施加于蛋白酶抗性多肽、与蛋白酶抗性多肽组合、与蛋白酶抗性多肽混合或其它方式加入到蛋白酶抗性多肽。肠溶包衣实现在低位肠道释放蛋白酶抗性多肽并防止片剂、胶囊剂或其它口服剂型的早期消化或降解。包衣可以施加于蛋白酶抗性多肽的压缩片剂、明胶胶囊和/或珠、颗粒(granules)、颗粒(particles)或冻干粉末，所述冻干粉末被包在淀粉或明胶胶囊中或压缩成片剂。
因此，肠溶包衣可以施加于压缩片剂，该压缩片剂含有蛋白酶抗性多肽的颗粒 (granules)、颗粒(particles)或冻干粉末；但是在颗粒(granules)或颗粒(particles) 本身在压缩成片剂之前是肠溶包衣的情况下，则压缩片剂自身的肠溶包衣是任选的。肠溶包衣还可施加于治疗多肽珠或小颗粒上，其可以被包在淀粉或明胶胶囊中。如果希望，胶囊然后可以用肠溶包衣进行包衣。因为其肠溶包衣，这些口服配制品会阻止蛋白酶抗性多肽不希望地递送到上胃肠道特别是口腔、咽和食道的粘膜和上皮组织。通过选择组成包衣的赋形剂、其类型和/或其厚度，包衣还实现了将活性成分递送到低位胃肠道的可以被本领域技术人员操作的点。
如本文所用，术语“延迟释放”是蛋白酶抗性多肽的递送，其通过将蛋白酶抗性多肽配制在药物组合物中以便释放在低位肠道的一些通常可预测的位置实现，所述位置远离如果治疗多肽的递送无改变时会实现释放的位置。用于实现活性成分的延迟释放的举例方法包括用一种物质包衣(或其它方式包囊)活性成分，所述物质不被吸收或不由胃肠液降解，从而直到到达小肠的特异希望地点才释放活性成分。本文所用的延迟释放配制品的举例类型通过一种物质包衣活性成分的片剂、胶囊、或颗粒(particles)、颗粒(granules)或珠而实现，所述物质是PH依赖性的，即在小肠中通常存在的pH下降解，但是在口腔、咽、食道或胃通常存在的PH下不降解。但是，如果希望实现经口服施用含有蛋白酶抗性多肽的药物组合物局部递送至仅大肠中，或递送至起自小肠的整个肠道，则可以如本文所述或通过本领域技术人员已知的任何方法变化或改变包衣材料的选择和/或包衣或组合蛋白酶抗性多肽和选择的包衣材料或其它药物学可接受赋形剂的方法。
如本文所用，“治疗作用”或“治疗效益”是指治疗症状的正结果，可以包括例如临床指标的有益变化，例如，在用EPO多肽治疗的情况中，血细胞计数(RBC)、血小板计数、血细胞比容(HCT)、血红蛋白水平(血红蛋白C)以及主观指标如疼痛降低、疲劳降低、体力改善或感觉改善。
如本文所用，“应答细胞”是指哺乳动物细胞，通过暴露于修饰的治疗多肽，其功能或生存力可以被保持、促进、增强、再生或以任何其它方式受益。
如本文所用，待治疗的“对象”包括人类及人类或非人动物。哺乳动物包括灵长类， 如人、黑猩猩、大猩猩和猴子；家养动物，如狗、马、猫、猪、山羊、牛，和啮齿类，如小鼠、大鼠、 仓鼠和沙鼠。
如本文所用，待治疗的“患者”或“对象”包括人类或非人动物。哺乳动物包括灵长类，如人、黑猩猩、大猩猩和猴子；家养动物，如狗、马、猫、猪、山羊、牛；和啮齿类，如小鼠、 大鼠、仓鼠和沙鼠。
如本文所用，“定向进化(directed evolution)方法”是指“适应”蛋白质，包括天然蛋白质、合成蛋白质或蛋白质结构域的方法，以具有改变的比例，如在不同的或现存的天然或人工化学或生物学环境中起作用的能力和/或引起新功能和/或增加或降低给定活性和/或调节给定特征。举例的定向进化方法包括理性定向进化方法，如美国公开申请号US 2003-0134351A1 和 US-2004-0132977A1 所述。
如本文所用，“二维理性诱变扫描Q-D扫描)，，是指本文提供的方法，其中扫描特定蛋白质序列的二维(1) 一维是鉴别蛋白质序列上的特异氨基酸残基以用不同氨基酸置换，称为is-HIT靶位置，及( 第二维是选择用于置换特定is-HIT靶的氨基酸类型，称为置换氨基酸。
如本文所用，“in silico”是指用计算机进行的研究和实验。h Silico方法包括但不限于分子建模研究和生物分子停靠实验。
如本文所用，“is-HIT”是指在靶蛋白质序列上in silico鉴别的氨基酸位置，其已经基于i)待进化的特定蛋白质性质，ii)蛋白质的氨基酸序列，和/或iii)各个氨基酸的已知性质而鉴别。蛋白质序列上的这些is-HIT位置无需使用实验生物学方法而鉴别。例如，一旦选择了待优化的蛋白质特征，使用各种信息来源或先前知识(即蛋白质一级、二级或三级结构、文献、专利)确定易于通过用不同氨基酸置换而改善蛋白质适合性的那些氨基酸位置。这一步骤使用“in silico”蛋白质分析。靶蛋白质一级序列上可能参与被进化特征的全部可能的候选氨基酸位置在本文中称为“in silico HIT”( “is-HIT”)。在这一步骤中鉴别的所有is-HIT的集合(文库)代表了本文提供的二维扫描方法的第一维(靶残基位置)。
如本文所用，“掩蔽的is-HIT”是指基于位于糖基化位点0-25人之内的所述治疗性多肽的三维结构的特定性质或活性(例如蛋白酶抗性)鉴定的is-HIT位置。通常，掩蔽的is-HIT残基距离或距离大约至少一个糖基化位点、有时是2个或多个糖基化位点1，2，3， 4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 或 25 A。
如本文所用，“非掩蔽的is-HIT”是指不基于位于糖基化位点0-25人之内的所述治疗性多肽的三维结构的特定性质或活性(例如蛋白酶抗性)鉴定的is-HIT位置。因此， 非掩蔽的is-HIT残基不被糖基化屏蔽并可以是在甚至所述多肽是糖基化的时暴露在所述多肽表面的那些残基。
如本文所用，在鉴别is-HIT上下文中的“易于提供进化的预定性质或活性”是指蛋白质上的氨基酸位置，其基于in silico分析被认为具有当被置换时导致进化的希望活性的性质或特征。在鉴别置换氨基酸上下文中的短语“易于提供进化的预定性质或活性”是指特定氨基酸类型，其基于in silico分析被认为具有当用于置换未修饰起始蛋白质中的原始氨基酸时导致希望或预选的活性的进化的性质或特征。
如本文所用，“高通量筛选”(HTQ是指一种方法，其测试大量样品，如测试蛋白质或含有编码感兴趣蛋白质的核酸的细胞的样品，以鉴别感兴趣的结构或鉴别与变体蛋白质或含有它们的细胞相互作用的测试化合物。HTS运行易于自动化并且被典型地计算机化以处理样品制备、测定程序和大容量数据的后续处理。
如本文所用，术语“受限制的”在鉴别选择用于氨基酸置换的蛋白质氨基酸残基的 is-HIT氨基酸位置和/或鉴别置换氨基酸的上下文中，是指蛋白质骨架上少于全部氨基酸被选择进行氨基酸置换和/或少于全部其余19个可用于置换未修饰起始蛋白质中存在的原始氨基酸的氨基酸被选择用于置换。在本文提供的方法的特定实施方案中，is-HIT氨基酸位置是受限制的，从而蛋白质骨架上少于全部的氨基酸被选择进行氨基酸置换。在其它实施方案中，置换氨基酸是受限制的，从而少于全部其余19个可用于置换未修饰起始蛋白质中存在的天然氨基酸的氨基酸被选择用于置换。在举例的实施方案中，鉴别is-HIT氨基酸位置和置换氨基酸的两种扫描是受限制的，从而蛋白质骨架上少于全部的氨基酸被选择进行氨基酸置换以及少于全部其余19个可用于置换天然氨基酸的氨基酸被选择用于置换。
如本文所用，“候选LEAD”是突变蛋白质，其设计具有性质、活性或其它属性中的改变，典型地是预定或预选的性质、活性或其它属性，如寻求这种改变的化学、物理或生物学性质或活性。所述改变可以添加、改变、除去或其它方式改变多肽的性质、活性或其它属性。 在本文方法中，候选LEAD通常通过用受限制的亚集或全部其余19个氨基酸系统性置换蛋白质或其结构域中的is-HITS位置而产生，如用PAM分析所获得。候选LEAD可以通过本领域技术人员已知的其它方法产生，由本文高通量方法测试。
如本文所用，“LEAD”是“候选LEAD”，其性质、活性或其它属性已被改变、优化、改善、添加或消除。为本文目的，针对显示这种活性或性质的未修饰多肽中的感兴趣的性质或活性，“LEAD”典型地具有不同于修饰的和/或野生型(天然)蛋白质至少大约是或是1%、 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%,300%,400%,500%^； 更多的活性。在一些实施方案中，活性改变是高于未修饰和/或野生型(天然)蛋白质的活性的至少大约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、 60 倍、70 倍、80 倍、90 倍、100 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500 倍、600 倍、700 倍、800 倍、900 倍、1000倍或更多倍。希望的改变可以是活性增加或降低，取决于感兴趣的功能或性质(例如至少大约是或是10 %，至少大约是或是20 %等)。LEAD可进一步通过置换相同蛋白质分子上的多个O个或多个)〃 is-HIT〃靶位置而优化以产生〃 super-LEAD"。
如本文所用，术语“super-LEAD”是指将两个或多个LEAD分子中存在的单突变加入到一个单个蛋白质分子中而获得的蛋白质突变体(变体)。因此，在本文提供的修饰蛋白质的上下文中，短语“包含一或多个单氨基酸置换的蛋白质”包括对一个相关蛋白质加入两个或多个本文描述的突变。例如，本文提供的含有一或多个单氨基酸置换的修饰蛋白质可以具有在披露的置换位置的任意 2,3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19， 20或更多个氨基酸置换。super-LEAD突变体分子的集合被产生、测试和在可寻址阵列中逐一表型鉴定。Super-LEAD突变体分子是含有可变数目和类型LEAD突变的分子。展示对于被进化的特定特征的进一步改善的适合性的那些分子被称为super-LEAD。Super-LEAD 可以通过本领域技术人员已知的其它方法产生并由本文的高通量方法测试。为本文目的， super-LEAD典型地具有针对感兴趣功能的活性，其与LEAD的改变的活性(或新活性或消除的活性)具有希望的量的不同，如与其所衍生的LEAD突变体不同至少大约是或是1%、2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%,300%,400%,500%^； 更多。与LEAD—样，super-LEAD的活性变化取决于被“进化”的活性。希望的改变，其可以是活性的增加或降低，取决于感兴趣的功能或性质。希望的改变还可以是性质或活性的添加或消除。
如本文所用，短语“改变的位置”是指LEAD或super-LEAD中用不同置换氨基酸置换以产生希望的改变表型或活性的is-HIT氨基酸位置。
如本文所用，“暴露的残基”是指其15%以上的表面暴露于溶剂。
如本文所用，短语“结构同源性”是指两个或多个蛋白质骨架之间空间一致程度。 采取相同蛋白质结构，折叠，并且在三维结构重叠时显示空间相似性的蛋白质骨架可被认为是结构同源的。结构同源性不是基于序列同源性，而是基于三维同源性。基于蛋白质之间的结构同源性而被称为同源的两个不同蛋白质中的两个氨基酸不是必须位于基于序列的同源区域中。例如，在给定空间位置或限定区域彼此具有小于3. 5,3. 0,2. 5,2. 0、1. 7或 1.5埃的均方根(RMS)差的蛋白质骨架可以被认为是在该区域结构同源的，并在本文中称为在它们的骨架间具有“高一致性”。本文中预期，位于共享一定程度结构同源性的两个或多个不同蛋白质序列上的基本上等价的(例如“结构相关的”)氨基酸位置具有相当的功能任务；也在本文中称为“结构同源位置”。这两个氨基酸然后可被称为是彼此“结构相似的” 或“结构相关的”，即使它们在氨基酸序列上的精确一级线性位置当对比它们的序列时不互相匹配。“结构相关的”氨基酸在一级蛋白质序列中可以彼此远离，当这些序列根据经典序列同源性规则对比时。
如本文所用，“结构同系物”是由结构同源性识别的蛋白质。举例的EPO结构同系物包括许多其它细胞因子，包括例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-2 (IL-2)、白细胞介素-3 (IL-3)、白细胞介素_4 (IL-4)、白细胞介素_5 (IL-5)、白细胞介素-13 (IL-13)、Flt3配体和干细胞因子(SCF)。
如本文所用，两个或多个多肽，如两个EPO多肽或是EPO结构同系物的其它多肽上的“相应于结构相关的”位置，是指基于基于结构同源性确定的以最大化多肽之间的三维重叠的那些氨基酸位置。
如本文所用，“变体”、“治疗多肽变体”、“修饰的治疗多肽”和“修饰的治疗蛋白质” 是指与未修饰治疗多肽相比具有一或多个突变的治疗多肽。“促红细胞生成素”、“修饰的促红细胞生成素多肽”和“修饰的促红细胞生成素蛋白”是指与未修饰促红细胞生成素多肽相比具有一或多个突变的EPO多肽。所述一或多个突变可以是一个或多个氨基酸置换、插入或缺失及其任何组合。典型地，修饰多肽与未修饰多肽相比在一级序列中具有一或多个修饰。例如，本文提供的修饰多肽与未修饰多肽相比可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、或更多个突变。任何长度的多肽均包括在内，只要所得多肽显示至少一种与天然多肽相关的活性即可。
如本文所用，“单氨基酸置换，，是指一个氨基酸由另一个氨基酸置换。置换可以通过天然氨基酸或非天然氨基酸进行。当蛋白质中一个氨基酸由另一个氨基酸置换时，该蛋白质中的氨基酸总数不变。
如本文所用，短语“仅一个氨基酸置换发生在每个靶蛋白上”是指靶蛋白的修饰，从而其以单氨基酸改变与未修饰形式靶蛋白不同。例如，在一个实施方案中，通过置换蛋白质骨架上的仅一个is-HIT靶位置的单氨基酸残基而进行诱变(例如在可寻址阵列中“逐一”)，从而所产生的每个突变体是每个单诱变反应的单产物。针对在每个is-HIT靶位置选择的每个置换氨基酸，重复进行单氨基酸置换诱变反应。因此，产生多个突变蛋白质分子， 由此每个突变蛋白质含有在仅一个is-HIT靶位置的单氨基酸置换。
如本文所用，短语“假野生型”在单或多个氨基酸置换的上下文中，是这样的氨基酸，它们尽管在给定氨基酸位置与原始(例如天然)氨基酸不同，但是可以置换该位置的天然氨基酸而不导入特定蛋白质活性的任何可测量的变化。
编码突变分子集合的一群(文库)核酸分子集合被产生并表型鉴定，以便选择这样的蛋白质，其具有不同于原始氨基酸的氨基酸序列，但是仍基本上相同水平(即至少大约是或是 10%,50%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%，根据蛋白质)和类型的与原始蛋白质一样的希望活性。一个集合(或文库)含有两个、三个、四个、五个、10、50、100、500、1000、103、IO4或更多个修饰的治疗多肽。
如本文所用，“相应于蛋白质的氨基酸位置的位置”，是指这样的氨基酸位置，它们基于与具体的参考蛋白质的序列和/或结构对比被确定相应于彼此。例如，相应于SEQ ID NO 2所示人EPO的氨基酸位置的位置可以通过将SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列与感兴趣的特定EPO多肽对比而凭经验确定。相应位置可以由本领域技术人员使用手工对比或使用各种可获得的对比程序(例如BLASTP)进行这种对比而确定。相应位置也可以基于结构对比，例如使用计算机模拟的蛋白质结构对比。定义多肽的氨基酸相应于一个公开序列中的氨基酸是指，使用标准对比算法如GAP算法对比所述多肽和所述公开序列以最大化相同性或同源性(当保守氨基酸进行对比时)而鉴别的氨基酸。
如本文所用，“相应于…的位置”是指一个核酸分子或蛋白质中的相对于另一个参考核酸或蛋白质中的位置的感兴趣位置(即碱基编号或残基编号)。相应于另一个参考蛋白质中的位置的感兴趣位置可以是例如在前体蛋白、等位基因变体、异源蛋白、来自另一物种的相同蛋白的氨基酸序列(即物种变体)中。相应位置可以通过比较和对比序列以最大化匹配的核苷酸或残基数而确定，例如，从而序列间的相同性大于95 %，优选大于96 %，更优选大于97 %，还更优选大于98 %，最优选大于99 %。感兴趣的位置然后被给予参考核酸分子中的编号。
如本文所用，术语“同源性”和“相同性”可互换使用，但是蛋白质的同源性可包括保守氨基酸变化。与鉴别相应位置中一样，氨基酸序列被对比以便获得最高级匹配 (参见例如!Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press, New York,1988 ；BiocomputinR :Informatics and Genome Projects, Smith，D. W.， ed.，Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data，Part I， Griffin，A. M.，and Griffin，H. G.，eds.，Humana Press，New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinie，G.，Academic Press，1987 ；and Sequence Analysis Primer，Gribskov, M. and Devereux, J.，eds.，M Stockton Press，New York， 1991 ；Carillo et al. (1988)SIAM J Applied Math 48 :1073)。
如本文所用，“序列相同性”是指在测试和参考多肽或多核苷酸之间比较中相同的氨基酸(或核苷酸碱基)数。同源多肽是指预定数目的相同或同源氨基酸残基。同源性包括保守氨基酸取代及相同残基。序列相同性可以通过标准对比算法程序确定，使用每个供应商确立的默认缺口罚分。同源核酸分子是指预定数目的相同或同源核苷酸。同源性包括不改变编码的氨基酸的取代(即“沉默取代”)及相同残基。基本上同源的核酸分子典型地在中等严格性或在高严格性在感兴趣核酸分子全长上或感兴趣核酸分子全长的至少大约 70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%上杂交。还包括这样的核酸分子，其含有简并密码子代替杂交核酸分子中的密码子。(为确定蛋白质的同源性，保守氨基酸及相同氨基酸可以被对比；在这种情况中，相同性百分比和同源性百分比不同)。任何两个核酸分子是否具有至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% “相同的”核苷酸序列(或者任何两个多肽是否具有这样的氨基酸序列)可以用已知的计算机算法如“FASTA”程序确定，使用例如Pearson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)所述的默认参数(其它程序包括 GCG 禾呈(Devereux, J. ， et al. ， Nucleic Acids Research 12(1) :387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F.，et al.，J. Molec. Biol. 215 :403(1990) :Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed.，Academic Press, San Diego (1994), and Carillo et al. SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。例如，National Center for Biotechnology ^formation数据库的BLAST功能可用于确定相同性。其它商业或公共可利用程序包括DNA Star “ MegAlign" program (Madison, WI)禾口 University of Wisconsin Genetics Computer Group (UffG) " Gap"程序(Madison WI))。蛋白质和/或核酸分子的同源性或相同性百分比可以例如用GAP计算机程序比较序列信息而确定(例如Needleman et al. J. Mol. Biol. 48 443(1970)，由 Smith and Waterman (Adv. App 1. Math. 2 :482(1981)修正)。简而言之，GAP 程序确定相似性是将相似的对比符号(即核苷酸或氨基酸)数除以两个序列中较短者的符号总数而得到。GAP程序的默认参数可包括(1) 一元比较矩阵(1代表相同性，O代表非相同性)，Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14 :6745 (1986)的加权比较矩阵，如 khwartz and Dayhoff, eds. ， Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation,pp. 353-358(1979)所述；(2)每个缺口罚分 3. 0，每个缺口每个符号的另外0. 10罚分；及(3)末端缺口不罚分。
因此，如本文所用，术语“相同性”代表测试和参考多肽或多核苷酸之间的比较。在一个非限制性实施例中，“至少90%相同”是指相对于参考多肽从90至100%的相同性百分比。在90%或以上水平的相同性表明如下事实，假定为举例目的，长度为100个氨基酸的测试和参考多肽被比较，测试多肽中不超过10% (即100个中的10个)氨基酸不同于参考多肽的氨基酸。类似的比较可以在测试和参考多核苷酸之间进行。这种差异可以是随机分布于氨基酸序列全长的点突变，或者它们可以簇集在一或多个不同长度的位置，直至可允许的例如10/100个氨基酸差异(约90%相同性)。差异被定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。在高于大约85-90%的同源性或相同性水平，结果应该不依赖于程序和缺口参数集； 这种高水平相同性可以容易地评估，通常无需依赖软件。
如本文所用，短语“序列相关蛋白质”是指彼此具有至少50%、至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列相同性或同源性的蛋白质。
如本文所用，非相关蛋白质或“序列不相关蛋白质”是指彼此具有小于50%、小于40%、小于30%、小于20%氨基酸相同性或同源性的蛋白质。
如本文所用，还应理解术语“基本上相同，，或“相似”随上下文变化，相关领域技术人员理解这一点。
如本文所用，“裸多肽链”是指未进行翻译后修饰或其它化学修饰仅含有共价连接的氨基酸的多肽。
如本文所用，多肽复合物包括由化学修饰或翻译后修饰产生的多肽。这种修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、hasylation，氨甲酰化、硫酸化、羧基化、羟基化、磷酸化及本领域已知的其它多肽修饰。
如本文所用，“输出信号”是指可以随时间被跟踪及任选地定量的参数。例如，当重组蛋白被导入细胞中时，含有重组蛋白的细胞经历许多变化。可以被监测及用于评估转化或转染的任何这种变化就是输出信号，细胞被称为报道细胞；编码核酸被称为报道基因； 包括编码核酸的构建体是报道构建体。输出信号包括但不限于酶活性、荧光、发光、产生的产物量和其它信号。输出信号包括基因的表达或基因产物，包括插入到质粒构建体中的异源基因(转基因)。输出信号是时间("t")的函数，并且与用于组合物中的蛋白质量相关。对于较高浓度的蛋白质，输出信号可以更高或更低。对于任何特定浓度，输出信号作为时间的函数而增加直至达到稳态。输出信号还可以测量细胞、表达异源基因和生物学物质之间的相互作用。
如本文所用，编码突变体集合(或文库)的核酸分子集合群是指携带(即编码) 基因变体的质粒或其它运载体的集合。因此，个体质粒或其它个体运载体携带个体基因变体。集合的每个元件(或成员)在合适的可寻址阵列中与其它元件(或成员)物理分隔， 并作为独立诱变反应的单产物产生。当涉及这种蛋白质集合(或文库)时，其是如此声明的。集合(或文库)含有3、4、5、10、50、100、500、1000、IO3UO4或更多个修饰的EPO多肽或修饰的治疗多肽。
如本文所用，“报道细胞”是应答一种条件而经历变化的细胞。例如，应答将蛋白质或病毒暴露于其外部或内部环境的变化，报道细胞“报道”(即展示或显示变化)。
如本文所用，“报道子”或“报道部分”是指使得可以检测感兴趣的分子如由细胞表达的蛋白质的任何部分。报道部分包括但不限于荧光蛋白(例如红色、蓝色和绿色荧光蛋白)、LacZ和其它可检测蛋白质和基因产物。为在细胞中表达，编码报道部分的核酸可以作为与感兴趣的蛋白质的融合蛋白表达或者在感兴趣的启动子的控制下表达。
如本文所用，表型是指基因型(基因序列)的物理、生理或其它体现。在本文方法中，评估得自基因型改变的表型。
如本文所用，培养基是任何适于支持哺乳动物细胞离体存活性、生长、和/或分化的培养基。这种培养基是本领域技术人员已知的。培养基的例子包括但不限于 X-Vivol5 (Bioffhittaker), RPMI 1640, DMEM, Ham = sF12, McCoys 5A 禾口 Medium 199。培养基可以补加另外成分，包括血清、血清蛋白、生长抑制和生长促进物质如促有丝分裂单克隆抗体及选择剂用于选择遗传工程或修饰的细胞。
如本文所用，在本文提供的各种氨基酸序列中存在的氨基酸根据其已知的三字母或单字母缩写识别(表1)。在各种核酸片段中存在的核苷酸用本领域常规使用的标准单字母名称命名。
如本文所用，“氨基酸”是一种有机化合物，其含有氨基和羧酸基团。多肽包含2或多个氨基酸。为本文目的，氨基酸包括20个天然发生的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物(例如其中α-碳具有侧链的氨基酸)。
如本文所用，任何保护基团、氨基酸及其它化合物的缩写除非另有说明，均符合其常用法、认可的缩写或 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (1972) Biochem. 11 :1726。每个天然发生的L-氨基酸用标准三字母代码(或单字母代码)或标准三字母代码(或单字母代码)WpreEPO" L-"表示；preEPO" D-"表示氨基酸的立体异构形式是D。
如本文所用，“氨基酸残基”是指在其肽键化学消化(水解)多肽形成的氨基酸。 本文描述的氨基酸残基假定为“L”异构形式。“D”异构形式的残基可以取代任何L-氨基酸残基，只要希望的功能性质由多肽保持即可。"NH2”是指多肽的氨基末端存在的游离氨基。 “C00H”是指多肽的羧基末端存在的游离羧基。为与J. Biol. Chem.，243 :3552-3559 (1969) 描述的以及37C.F.R. § § 1.821-1. 822采用的标准多肽命名一致，氨基酸残基缩写如表1 所示 表1-对应表
符号1-字母3-字母氨基酸YTyr酪氨酸GGly甘氨酸FPhe苯丙氨酸MMet甲硫氨酸AAla丙氨酸SSer丝氨酸IIle异亮氨酸LLeu亮氨酸TThr苏氨酸VVal缬氨酸PPro脯氨酸KLys赖氨酸HHis组氨酸QGln谷氨酰胺EGlu谷氨酸ZGlxGlu 和/或 GlnWTrp色氨酸RArg精氨酸DAsp天冬氨酸NAsn天冬酰胺BAsxAsn 和 /或 AspCCys半胱氨酸XXaa未知或其它 应理解本文由化学式代表的所有氨基酸残基序列从左至右方向是常规的氨基末端至羧基末端方向。另外，短语“氨基酸残基”广泛定义为包括对应表(表1)列出的氨基酸以及修饰的和不寻常的氨基酸，入37C. F. R. § § 1.821-1. 822所指的那些，其引人本文做参考。另外，应注意在氨基酸残基序列开头或结尾的短横线“_”是指与其它一或多个氨基酸残基的序列、氨基末端基团如NH2或与羧基末端基团如COOH的肽键。
如本文所用，“天然存在的氨基酸”是指多肽中存在的20个L-氨基酸。
如本文所用，术语“非天然氨基酸”是指具有与天然氨基酸类似结构但已被结构修饰以模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。非天然发生的氨基酸因此包括例如除 20个天然发生的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，并包括但不限于氨基酸的D-立体异构体(isostereomer)。举例的非天然氨基酸在本文描述并是本领域技术人员已知的。
如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括蛋白质核酸(PNA)及其混合物。 核酸可以是单链或双链。当指代探针或引物时(任选地用可检测标记物如荧光或放射标记物标记)，是指单链分子。这种分子典型具有这样的长度，从而它们统计学独特低拷贝数 (典型地小于5、通常小于3)，用于探查或引发文库。通常探针或引物含有与感兴趣基因互补或相同的至少10、15、20、25或30个连续核苷酸的序列。探针和引物可以是5、6、7、8、9、 10或更多、20或更多、30或更多、50或更多、100或更多个核苷酸长。
如本文所用，异源或外来核酸如DNA和RNA可互换使用，是指不是作为其所存在的基因组部分天然存在的，或者在不同于其天然存在的基因座中发现的。异源核酸包括不是其所导入的细胞内源性的而是从另一细胞获得的或合成制备的核酸。通常，尽管不是必须的，这种核酸编码不是正常由表达其的细胞产生的RNA和蛋白质。本文的异源DNA包括本领域技术人员认识到或认为是对于表达其的细胞或基因座是异源或外来的任何DNA或RNA。 异源DNA和RNA也可编码通过影响转录、翻译或其它可调节生物化学过程而介导或改变内源DNA表达的RNA或蛋白质。异源核酸的例子包括但不限于编码可追踪标记蛋白(例如赋予药物抗性的蛋白质)的核酸，编码治疗有效物质(例如抗癌药)、酶和激素的核酸，以及编码其它类型蛋白质(例如抗体)的DNA。因此，本文中异源DNA或外来DNA包括不以在基因组中发现的相应DNA分子的精确方向和位置存在的DNA分子。其也可以指来自另一生物体或物种的DNA分子(即外源的)。
如本文所用，“关于核酸分子或多肽或其它生物分子是分离的”是指所述核酸或多肽已经与获得所述多肽或核酸的遗传环境分离开。其也可以表示从天然状态改变。例如， 天然存在于活体动物中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料分离开的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，如本文采用的术语。因此，在重组宿主细胞内产生和/或包含的多肽或多核苷酸被认为是分离的。“分离的多肽”或“分离的多核苷酸”还意在包括已从重组宿主细胞或从天然来源部分或基本上纯化的多肽或多核苷酸。例如，重组产生的化合物可以通过Smith et al.，Gene,67 :31-40(1988)所述的一步法基本上纯化。 术语分离的和纯化的可互换使用。
因此，“分离的”是指核酸不含那些基因的编码序列，所述基因是在生物体的天然发生的基因组(如果有)中紧邻编码感兴趣核酸的基因侧翼的基因。分离的DNA可以是单链或双链的，并可以是基因组DNA、cDNA、重组杂合DNA或合成DNA。其可以与起始DNA序列相同或者可以通过缺失、添加或取代一或多个核苷酸而与这种序列不同。
从生物细胞或宿主制备的“纯化的”制备物是指含有指定的DNA或蛋白质的细胞提取物，包括感兴趣的DNA或蛋白质的粗提取物。例如，在蛋白质的情况中，纯化的制备物可以通过单项技术或一系列制备或生物化学技术获得，感兴趣的DNA或蛋白质可以以不同纯度存在于这些制备物中。所述程序可以包括但不限于硫酸铵分级分离、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、密度梯度离心和电泳。
“基本上纯的”或“分离的”DNA或蛋白质制备物是指基本上不含这种DNA或蛋白质天然正常结合的天然发生材料的制备物，其含有5%或更少的其它污染物。
含有感兴趣的DNA或蛋白质的细胞提取物是指得自表达所述蛋白质或含有感兴趣DNA的细胞的勻浆制备物或无细胞制备物。术语“细胞提取物”意在包括培养基，特别是已除去细胞的用过的培养基。
如本文所用，“靶向剂”是指可以结合另一个靶分子的任何分子，如抗体、受体或配体。
如本文所用，“受体”是指特异地结合其它分子的生物学活性分子。术语“受体蛋白，，可以用于更具体地指示特异受体的蛋白质性质。
如本文所用，“重组体”是指由基因工程形成的任何子代。
如本文所用，“启动子区”是指控制与其可操纵连接的DNA的转录的基因的部分。 启动子区包括足以供RNA聚合酶识别、结合和转录起始的特异序列。启动子区的这一部分称为“启动子”。另外，启动子区包括调节RNA聚合酶的这种识别、结合和转录起始的序列。 启动子根据调节的性质可以是组成型的或者由顺式作用或反式作用因子调节。
如本文所用，短语与核酸分子“可操纵地连接”通常是指序列或节段与单链或双链形式的一段DNA共价结合，由此一个节段上的控制或调节序列控制或允许其它节段的表达或复制或其它这种控制。这两个节段不必须是相邻的。对于基因表达，DNA序列和调节序列的连接方式是这样的，当合适的分子例如转录激活物蛋白与调节序列结合时，控制或允许基因表达。
如本文所用，“用重组DNA方法经重组方式产生”是指熟知的分子生物学方法表达由克隆的DNA编码的蛋白质、包括基因的克隆表达的用途及方法。
如本文所用，剪接变体是由基因组DNA的初级转录物的差异加工产生的变体，所述差异加工产生超过一种类型的mRNA。
如本文所用，组合物是指两个或多个产品或化合物(例如药剂、调节物、调节物等)的任何混合物。其可以是溶液、悬液、液体、粉末、膏、水性或非水性配制品或其任何组合。
如本文所用，组合是指两或多个项目的任何结合。用于施用给对象的组合的项目可以单独或一起施用，同时或相继使用，或者包装在一起或分开包装。
如本文所用，“制造品”是被制造和销售的产品。在本申请中，该术语意在包括在包装物品中含有的本文所述的修饰的EPO多肽或其它修饰的治疗多肽和/或核酸的药物组合物。
如本文所用，“试剂盒”是指提供在药物组合物中的本文描述的修饰多肽或核酸分子与另一项目的组合，所述项目用于如下目的，所述目的包括但不限于施用、诊断和评价本文所述多肽的活性或性质。试剂盒任选地包括使用说明。
如本文所用，“与产物基本上相同”是指足够相似，从而感兴趣的性质足够不变以便可以使用基本上相同的产物代替所述产物。
如本文所用，术语“载体”是指一种核酸分子，其能转运与其连接的另一个核酸。一种类型的举例的载体是附加体，即能染色体外复制的核酸。举例的载体是能够自主复制和/或表达其所连接的核酸的载体，这种载体典型地包括复制起点。载体还可设计用于整合进宿主染色体中。能指导与其可操纵连接的基因表达的载体在本文中称为“表达载体”。表达载体通常是“质粒”形式，其通常是指环状双链DNA环，其在载体形式时不与染色体结合。 “质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用形式的载体。其它这种形式的表达载体起等价作用并且是本领域已知的。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”。病毒载体是工程病毒，其可操作地与外源基因连接以将该外源基因转移(作为运载体或穿梭体)进细胞。
如本文所用，“等位基因”在本文中与“等位基因变体”可互换使用，是指基因或其部分在群体中的可变形式。等位基因占据同源染色体上相同的基因座或位置。当对象具有一个基因的两个相同等位基因时，该对象被称为对该基因或等位基因是纯合的。当对象具有一个基因的两个不同等位基因时，该对象被称为对该基因是杂合的。具体基因的等位基因可以互相有1个核苷酸或几个核苷酸的不同，并且可以包括核苷酸的取代、缺失和插入。基因的等位基因也可以是含有突变的基因形式。典型地，等位基因变体与野生型和/ 或来自相同物种的优势形式具有至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或更高的氨基酸相同性。
如本文所用，术语“基因”或“重组基因”是指含有开放读框并包括至少一个外显子和任选地内含子编码序列的核酸分子。基因可以是RNA或DNA。基因可以包括编码区之前和之后的区域(前导序列和非转录尾区)。
如本文所用，“内含子”是指基因中存在的但在mRNA成熟过程中被剪接除去的DNA 片段。
如本文所用，“与编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列”是指编码一种多肽的核酸链的互补链的核苷酸序列，所述多肽包括具有该特定SEQ ID NO 1的氨基酸序列。
术语“互补链”在本文中与术语“互补序列”可互换使用。核酸链的互补序列可以是编码链的互补序列或非编码链的互补序列。当指代双链核酸时，编码含有具有特定SEQ ID NO :1的序列的氨基酸残基的核酸的互补序列是指编码该特定SEQ ID NO :1的氨基酸序列的链的互补链，或者指含有该特定核酸序列的互补链的核苷酸序列的任何核酸分子。当指含有一核苷酸序列的单链核酸分子时，这一核酸的互补序列是具有与该特定核酸序列的序列互补的核苷酸序列的核酸。
如本文所用，术语“编码序列”是指基因的编码蛋白质中存在的氨基酸序列的部分。
如本文所用，“有义链”是指双链核酸分子的一条链，其具有编码由该双链核酸分子编码的氨基酸序列的mRNA序列。
如本文所用，术语“反义链”是指双链核酸分子的一条链，其是编码由该双链核酸分子编码的氨基酸序列的mRNA序列的互补序列。
如本文所用，“阵列”是指含有三个或多个成员的元件如核酸分子的集合。可寻址阵列是这样的阵列，其中阵列的成员是可鉴别的，典型地通过在固相支持物上的位置或通过可鉴别或可检测的标记而鉴别，所述可鉴别或可检测的标记例如为颜色、荧光、电信号 (例如RF、微波或不显著改变感兴趣分子的相互作用的其它频率)、条码或其它象征学、化学或其它这种标记。在某些实施方案中，阵列成员固定化到固相表面上的分立的可鉴别位置上，或者直接或间接与可鉴别标记连接或另外相关，如附于微球上或其它颗粒支持物上 (本文称为珠)并悬浮于溶液或展开在表面上。
如本文所用，“支持物”(例如基质支持物、基质、不溶性支持物或固体支持物等) 是指任何固体或半固体或不溶支持物，感兴趣的分子(例如生物分子、有机分子或生物特异性配体)与其连接或接触。这种材料包括用作亲和性基质或支持物以进行化学和生物学分子合成及分析的任何材料，例如但不限于聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、尼龙、玻璃、葡聚糖、几丁质、沙、浮石、琼脂糖、多糖、dendrimers, buckybal 1、聚丙烯酰胺、硅、橡胶和用作支持物以进行固相合成、亲和分离和纯化、杂交反应、免疫测定及其它这种应用的其它材料。本文的基质可以是颗粒状的或者可以呈连续表面形式，如微滴定板或孔、玻片、硅晶片、 硝基纤维素片材、尼龙筛或其它这种材料。当是颗粒状时，典型地所述颗粒的至少一维是 5-10mm范围或更小。这种颗粒统称为“珠”，通常但不是必须是球形。但是，这种指代不是限制基质的几何形状，其可以是任何形状，包括随机形状、针状、纤维和加长的。大概为球形的“珠”，特别是可用于液相的微球也包括在内。“珠”可以包括另外的成分，如用于用磁铁进行分离的磁性或顺磁性颗粒(参见例如Dynabeads (Dynal，Oslo, Norway))，只要所述另外成分不干扰本文的方法和分析即可。
如本文所用，基质或支持物颗粒是指呈离散颗粒形式的基质材料。颗粒具有任何形状和尺寸，但典型地具有至少一维尺寸为IOOmm或更小、50mm或更小、IOmm或更小、Imm或更小、IOOm或更小、50m或更小，典型地具有大小为IOOmm3或更小、50mm3或更小、IOmm3或更小、Imm3或更小、IOOm3或更小，并可以是立方微米级。这种颗粒统称为“珠”。
如本文所用，对照是指与测试样品基本上相同的样品，除了其不用测试参数处理， 或如果是血浆样品，其来自未患有感兴趣病症的正常志愿者。对照也可以是内部对照。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文明确另外指出。因此，例如指代化合物时，包含“胞外结构域”包括具有一个或多个胞外结构域的化合物。
如本文所用，范围和量可以表示为“大约”特定数值或范围。大约也包括精确量。 因此“大约5个碱基”意味着“大约5个碱基”以及“5个碱基”。
如本文所用，“任选的”或“任选地”意味着随后描述的事件或情况发生或不发生， 以及所述描述包括所述事件或情况发生的情况和其不发生的情况。例如，任选地取代的基团意味着所述基团是未取代的或取代的。
如本文所用，对于任何保护基、氨基酸及其它化合物的缩写除非另有说明，否则符合其惯用法、认可的缩写或 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (1972) Biochem.，11 :942-944。
B.促红细胞生成素(EPO) 促红细胞生成素(EPO)是作为激素起作用的造血生长因子家族的成员。其负责调节红细胞生成并保持机体红细胞量在优化水平。EPO生成由肾动脉循环中降低的氧含量刺激，由氧敏感的转录因子介导。EPO主要由肾脏的小管周毛细血管内皮细胞产生。分泌的 EPO结合骨髓红系前体表面上的EPO受体，导致它们快速复制和成熟为功能性红细胞。这一刺激导致红细胞计数的快速上升和作为结果的血细胞比容(血液中的％红细胞)的上升(D'Andrea et al. (1989)Cell 57 277-285 ；Lodish et al. (1995)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 60 :93_104)。
最近，几条线证据提示促红细胞生成素作为细胞因子超家族的成员进行其它重要的生理学功能，这些功能由与促红细胞生成素受体(EPOR)的相互作用介导。这些作用包括促有丝分裂、调节进入平滑肌细胞和神经细胞的钙流入、红细胞生成、血小板超活化、凝血细胞生成及对中间代谢的作用。据信促红细胞生成素提供了补偿应答，用于改善低氧细胞微环境以及调节由代谢应激导致的编程性细胞死亡。因此，除了其促红细胞生成活性之外， EPO还显示组织保护能力。另外，这种组织保护活性看起来不依赖于其造血功能。
人类EPO首先由Lin et al. (1985) Proc Nat Acad Sci USA 82 :7582_4and Jacobs et al. (1985) Nature 313 :806_810克隆并报道氨基酸序列。人类EPO是分子量大约30400 道尔顿的酸性糖蛋白。人EPO的前体序列是193个氨基酸多肽(SEQ ID N0:1所示)，包括相应于SEQ ID NO :1所示氨基酸序列中第1-27位氨基酸残基的27个氨基酸的信号序列。 成熟多肽由166个氨基酸的单多肽链(SEQ ID NO :2所示)组成，其通过包括通过羧肽酶裂解166位精氨酸的翻译后修饰被加工为165个氨基酸的多肽(SEQ ID NO :237所示)。因此， EPO以165个氨基酸的形式存在，但可以166个氨基酸的形式存在，或者是以165或166个氨基酸的不均一分子存在。EPO含有4个半胱氨酸残基(在SEQ ID NO :2所示成熟蛋白质的位置 7、29、33 和 161)，其形成内部二硫键(Lai et al. (1986) J BiolChem 261 :3116_3121 ； Recny et al. (1987) J Biol Chem 262:17156-17163)。半胱氨酸 7 和 161 之间的二硫键对于促红细胞生成活性是重要的。人类EPO的结构已在Cheetham et al. (1988)Nat Struct Biol 5:861-866 and Syed et al. (1998) Nature 395 :511_516 中报道及描述。人类 EPO 是4螺旋束，这在造血生长因子家族成员中是典型的。
在体内，EPO被糖基化翻译后修饰。EPO的碳水化合物部分由在Asn24、38和83 的3个N联糖及在Ser 126的1个0联糖组成(参见例如Browne et al. (1986)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51 693-702 ；Egrie et al. (1986) Immunbiology 172 213-224)。附着于EPO的碳水化合物结构是可变的，这一特征称为微不均一性。碳水化合物部分在分支模式、复杂性大小和电荷中的差异对EPO的药动学和药效学有深远作用。 不同糖基化模式的作用已有很好研究(参见例如，Darling et al. (2002)Biochemistry 41 14524-14531 ；Storring et al. (1998)Br J Haematol 100 79-89 ；Halstenson et al. (1991 Clin Pharmacol Ther 50 702-712 ；Takeuchi et al. (1990)J Biol Chem265 12127-12130)。
通常，蛋白质的糖基化在赋予溶解性、稳定性、对免疫攻击的保护和整体生物学活性是重要的。对于ΕΡ0，例如，糖蛋白中的糖基化位点涉及活性、生物合成和加工、半衰期、 维持活性构象和其归巢至骨髓以及其生物学活性(Dube et al. (1988) J Biol. Chem.，263 17516-17521 ；Cointe et al. (2000)Glycobiology，10 :511_519)。例如，含有增加的碳水化合物含量的EPO多肽同种型通常显示增加的血清半衰期。CHO细胞中产生的EPO多肽的血清半衰期与具有的半衰期以分钟量度的非糖基化EOP相比是大约2小时。EPO糖基化形式的半衰期还显示相对短的半衰期。因此，努力产生具有改良的半衰期的EPO多肽。
EPO在胎儿期间通过肝细胞产生，并也通过肾成纤维细胞和神经元细胞产生。人尿EPO和在细胞中重组产生的重组人EPO(rHuEPO)具有相同的一级序列，但是其糖基化模式不同。另外，不同的rHuEPO根据用于产生其的细胞系而含有不同的糖基化模式。rHuEPO 通过在CHO细胞(即下文讨论的epoietin α和β)、幼仓鼠肾细胞(ΒΗΚ，即印oietin ω)； RPMI 1，788人类淋巴母细胞；COS非洲绿猴肾；MDCK犬肾；L929小鼠成纤维细胞和C127小鼠乳腺(Jelkmann et al. (2004) Internal Medicien，43 :649_659)中的重组工程产生。不同EPO制备物的糖基化的不同当EPO作为治疗药物施用时影响其体内存活。 EPO是主要的生物药品，世界销量达30亿美元。其主要用于增强患者中红细胞和红细胞形成以治疗与慢性肾衰竭、癌症化疗、HIV感染、儿科应用、早产儿相关的贫血并用于降低经历择期非心脏和非血管手术的贫血患者对于输血的需求。其他用于EPO治疗的指示征可以是与自体免疫疾病、AIDS、丙型肝炎感染、充血性心脏衰竭或手术干预相关的贫血。 在人中，用EPO剂量治疗发现是安全且良好耐受的。
有多种可商购获得的EPO多肽。许多EPO多肽具有与人EPO(rhEPO)相同的氨基酸序列并且生产方法和糖基化的变化可以区分这些产品。Epoetin α (产生自基因组DNA)和 epoetin β (产生自cDNA)在美国专利4，703，008和5，955，422中描述。这些多肽具有与人类EPO相同的氨基酸序列并且在中华仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生。Epoetina可以商品名 Procrit(Ortho Biotech),Eprex (Johnson&Johnson),Epogin (Chugai)或Epogen (Amgen)获得。Epoetin β 可以商品名 Neorecormon 或Recormon(Hoffmann-La Roche) 获得。其由Genetics Institute开发用于治疗与肾病相关的贫血。Epoetin ω，在美国专利 5，688，679中描述，具有与人类EPO相同的氨基酸序列并在幼仓鼠肾细胞(ΒΗΚ-21)中产生。 Epoetin ω可以商品名Epomax(Elanex)获得。通常，rHuEPOa禾PrHuEPO^当静脉内或皮下施用时显示6-8小时的半衰期。Dynepo (Epoetin δ ；由Transkaryotic Therapies (与 Aventis Pharma联合)开发)是基因活化的人促红细胞生成素，在人细胞培养物中产生，用于治疗肾衰竭患者的贫血。
开发了其他EPO多肽试图增加多肽的半衰期和生物利用度。Darb印oetina (也已知为 Novel Erythropoiesis Stimulating Protein, NESP)由 Amgen 开发并可以商品名 Aranesp 获得(Macdougal 1(2002) Kidney Int Suppl. 80 :55_61)。其设计含有 5 个 N 连接碳水化合物链(比rhEPO多2个)。Aranesp⑧的氨基酸序列与rhEPO的不同在于5个氨基酸取代(A30N，H32T，P87V，W88N，P90T)，因此使得另外的寡糖附着于位置30和88的天冬酰胺残基上。由于其增加的碳水化合物含量，Aranesp 不同于rhEPO，其有更高的分子量(37100，相比于30400道尔顿)、唾液酸含量(22，相比于14个唾液酸残基)和增加的负电荷。Aranesp⑧增加的碳水化合物含量解释了其独特的生物化学和生物学活性，特别是当经静脉内或皮下途径施用时比其它促红细胞生成素高3倍的循环半寿期，即24-26小时。 然而，相对EPO受体结合亲和性与碳水化合物含量倒相关，Aranesp 展示比rhEPO低4. 3 倍的对EPO受体的相对亲和性。在皮下施用后，Aranesp 吸收缓慢并是限速的，血清水平平均54小时达到最大。达到最大浓度的时间比报道的rhEPO的长，可能是因为Aranesp⑧ 分子大小增加。但是目前延长的循环半寿期使得Aranesp⑧比Procrit⑧有显著的临床优势，因为其给药频率低。
进行了其他尝试通过与聚乙二醇(PEG)的化学缀合来延长EPO的半衰期。PEG化的EPO尽管具有更长的半衰期，与非PEG化的EPO相比显示改变的结构和降低的功能。例如，连续的促红细胞生成素受体激活物(CERA ；由Roche开发)或R-744是第二代促红细胞生成素，用于潜在治疗与化疗相关的贫血。CERA含有约30kDa的单个甲氧基聚乙二醇聚合物，其延长了这一药剂的半寿期。增加半衰期的其他机制包括但不限于EPO与载体蛋白如白蛋白连接，2个完整EPO分子通过使用连接肽(3至17个氨基酸)、通过使用不同试剂的化学交联或者通过组合EPO分子和人免疫球蛋白(Ig)的Fc片段作为融合蛋白的同二聚体化的形成。这些策略的每一种均导致与天然EPO相比所述EPO多肽具有改变的活性。 EPO可以口服、全身性、颊内、经皮、静脉内、肌肉内和皮下施用，典型地，治疗方案中使用多次施用。通常，商业可获得的EPO治疗剂通过皮下、静脉内和腹膜内施用注射施用。典型地，皮下施用更有效，尽管天然EPO通过皮下施用的生物利用度仅是26%。由于相对短的半衰期，天然EPO必须一周3次注射施用。而且，配制品典型地储存在冷藏(2-8°C) 条件以保证活性。因此，改善的EPO稳定性(半寿期)在施用条件(体内)如血清稳定性及体外(例如在生产过程中、纯化和储存条件下)可以改善其作为药物的用途和效率。
C.显示增加的蛋白质稳定性的修饰的EPO多肽 本文提供了通过对蛋白酶抗性评估显示改善的稳定性的EPO多肽的变体(血液、 肠等)。增加的EPO多肽稳定性可以例如通过破坏蛋白酶靶残基或序列、从而使得所述多肽在施用、纯化或储存时对于蛋白酶降解具有抗性而实现。通过在倾向于被蛋白酶降解的位点处改变其一级序列而修饰蛋白酶以成为蛋白酶抗性的。例如，蛋白酶靶残基或序列的氨基酸置换导致蛋白酶靶残基或序列的直接破坏。因此，本文提供了修饰的EPO多肽，其中一级氨基酸序列被修饰以赋予对蛋白酶的增加的抗性，而无其他翻译后或其他修饰的额外需要。
本文提供的蛋白酶抗性EPO多肽仅用在所述多肽的一级序列中一些氨基酸改变 (在很多情况中仅单个改变)修饰。自身一级序列中的突变使得给予多肽蛋白酶抗性。而且，因为所述多肽仅含有一些改变，其能够将其活性保持在与没有所述突变的相同多肽的活性相同或在一些情况中大于没有所述突变的相同多肽的活性的水平。这对于几种原因而言是有利的。首先，这意味着实现治疗作用所需的多肽的量(即剂量)不受所述多肽活性任何改变(即降低)的限制。这是使用许多治疗性多肽例如peg化多肽具有的问题，其中对所述多肽的修饰使得蛋白质活性更低。因此，为实现治疗作用，这种治疗性多肽必须以更高剂量施用。
第二，仅对多肽一级序列的改变意味着没有其他加工要求或混合所述治疗性蛋白和制剂中其他化合物以实现蛋白酶抗性或吸收多肽进入血流的要求。因此，简化了剂量制剂的工艺。例如，仅含有冻干蛋白的片剂可以制备为用于口服施用，即所述蛋白酶抗性蛋白质自身是口服利用的。在肠溶包衣中包括多肽以进一步增加多肽对蛋白酶的抗性、特别是在口服施用时至胃肠道途径时也可能是有利的。
所述修饰的EPO多肽通过对蛋白酶的抗性评估显示改良的稳定性；所述显示这些性质的修饰的EPO多肽因而具有增加的体外或体内蛋白质半衰期。所述修饰的EPO多肽 (本文也称为变体)与未修饰的EPO多肽相比是更稳定的。本文提供的显示增加的蛋白质稳定性的修饰的EPO多肽可以导致增加的体外(例如在生产、纯化和储存期间)或体内 (例如在施用对象后)多肽半寿期。例如，增加的半寿期可以在多肽被施用给对象如人类对象后发生。修饰的EPO多肽的增加的半寿期与未修饰EPO多肽的半寿期相比可以增加的量至少大约是或是 1% >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%, 300%、400%、500%或更高。在一些实施例中，修饰的EPO多肽的增加的半寿期与未修饰 EPO多肽的半寿期相比可以增加的量是至少6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、 50 倍、60 倍、70 倍、80 倍、90 倍、100 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500 倍、600 倍、700 倍、800 倍、900倍、1000倍或更多倍。因此，本文提供的修饰的EPO多肽给EPO提供了优点，包括维持血清中足够药物水平所需的注射频率降低，由此导致例如对象更高的舒适度和接受性， 更低的达到相当的生物学作用所需的剂量，及减轻了二级效应。 显示改良的稳定性的EPO变体在施用条件中如在血流、胃肠道、口腔、喉和/或在储存条件下具有增加的稳定性。稳定性(即蛋白体内半衰期)增加可以导致维持血清中足够药物水平所需的注射频率降低，因而导致i)被治疗对象、特别是人类对象更高的舒适性和接受性，ii)实现相当的生物学作用所需的剂量更低，和iii)结果是(剂量依赖性)二级效应减轻。而且，对蛋白酶的抗性使得多肽适于口服递送，因为其倾向于被胃肠道中发现的蛋白酶消化。
因此，由于对胃肠道中蛋白酶的抗性，本文提供的EPO变体可以配制为口服施用。 对于没有通过一级序列改变被修饰为是蛋白酶抗性的治疗性蛋白质，没有蛋白质可以通过口服施用施用以实现递送治疗有效量的天然或野生型多肽至血流。这是胃肠道蛋白酶对胃肠道中多肽的降解所导致的。尽管天然多肽如EPO可以用肠溶包衣配制，这也不足以实现对胃肠道中蛋白酶的抗性以允许释放至血流。一旦肠溶包衣溶解并且所述天然多肽释放至胃肠道内腔，所述多肽的高水平蛋白酶降解阻止了所述多肽自肠到血液的有效吸收。本文提供的EPO蛋白酶抗性多肽对于蛋白酶如胃肠道蛋白酶的降解是具有抗性的，因此可以被吸收和摄取进入血液。当释放进胃肠道内腔时，所述蛋白酶抗性肽由于其对于肠蛋白酶的抗性而以高浓度存在。结果，治疗有效量的蛋白酶可自肠吸收至血液。另外，对消化道和血流中的蛋白酶降解的抗性允许持续摄取所述蛋白酶抗性治疗性多肽。因此，在血流中所述蛋白酶抗性多肽可以治疗有效浓度在较长时间内被吸收和维持。因此，所述蛋白酶抗性多肽可以被口服施用。如本文所述，这种蛋白酶抗性EPO多肽可以配制为以片剂或胶囊口服施用。有利地，其包括保护抵抗胃的PH条件并允许有效递送所述多肽至下段消化道的肠溶包衣。
增加蛋白酶抗性的修饰补偿了可能由于蛋白质在不能糖基化的宿主中产生而发生的或者在施用及暴露于蛋白酶糖酵解作用后EPO多肽糖基化的缺失。因此，通常被糖基化掩蔽的蛋白酶敏感位点的修饰可以在这些位点没有被掩蔽且暴露于蛋白酶(即血清、血清、肠)时对EPO多肽提供保护措施以提供与不含有这种修饰的多肽相比增加的多肽稳定性。因此，尽管糖基化位点可以将蛋白质与蛋白酶屏蔽并因而增加多肽的半衰期，没有糖基化或部分糖基化的EPO多肽不被如此保护。因此，通过修饰EPO多肽以显示增加的蛋白酶抗性，特别是在通常被糖基化掩蔽的位点，所述多肽与完全糖基化的EPO多肽相比被赋予保护或更好的保护。
1.蛋白酶抗性 将稳定的肽和蛋白质药物递送给患者是药物工业的主要挑战。这些类型的药物在人体中经常由不同的生理过程包括内在化、肾小球滤过和蛋白酶解而消除或去掉。后者经常是影响用作经口施用或者静脉内或肌肉内注射的治疗剂的蛋白质的半寿期的限制过程。因此，感兴趣的是增加蛋白质稳定性的治疗蛋白质，所述蛋白质稳定性增加体现在增加的蛋白酶消化的抗性。治疗蛋白质的修饰是增加抗蛋白酶消化的保护，但不破坏或消除一种或该种治疗活性。这种变化对于生产更持久的治疗蛋白质是有用的。因此，在一个方面中， 本文提供的EPO多肽已被修饰以增加对蛋白酶解的抗性，由此增加修饰的EPO多肽的体外 (例如生产、加工、储存、测定等)或体内(例如血清稳定性)半寿期。因此，本文提供的修饰的EPO多肽可用作更持久的治疗蛋白质。本文所述增加蛋白质对蛋白酶(血液、裂解物、 肠、血清等)的稳定性是意指对于特定蛋白质分子提供更长的体内半衰期并因此降低对对象所需施用的频率。也意指通过赋予蛋白酶抗性增加蛋白酶稳定性产生可以口服施用的多肽。
蛋白酶(Proteases，proteinases)或肽酶催化共价肽键的水解。本文提供的修饰的EPO多肽显示增加的对蛋白酶酶解的抗性，所述蛋白酶包括在体液和组织中存在的那些蛋白酶，所述体液和组织例如包括但不限于唾液、血液、血清、肠道、胃、血液、细胞裂解物、 细胞及其它。这些包括所有类型的蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶。
EP0多肽的修饰包括但不限于对一或多种蛋白酶的抗性，所述蛋白酶包括但不限于胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、氨肽酶、明胶酶B、明胶酶A、 α -胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、内蛋白酶Arg-C、内蛋白酶Asp-N、内蛋白酶Glu_C、内蛋白酶 Lys-C、内腔胃蛋白酶、微绒毛内肽酶(microvillar endop印tidase)、二肽基肽酶、肠肽酶 (enterop印tidase)、水解酶、NS3、因子Xa，粒酶(Granzyme) B、凝血酶、纤溶酶、尿激酶、tPA 禾P PSA0 本文提供的修饰的EPO多肽显示对蛋白酶解，特别是存在于血清、血液、肠道、口腔和其它体液中的酶的蛋白酶解的抗性。这种抗性增加体现为EPO多肽半寿期与在体内 (人血液、人血清、唾液、消化液、肠道等)或含有一或多种蛋白酶的体外混合物中的未修饰或野生型EPO多肽相比增加的量至少大约是或是1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%, 96%,97%,98%,99%UOO%,200%,300%、400%,500%或更高。典型地，本文提供的修饰的EPO多肽的体外或体内半寿期与在血液、血清、唾液或含有一或多种蛋白酶的体外制备物或混合物中的未修饰或野生型EPO多肽相比增加的量选自至少大约是或是1%、 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%,300%,400%,500%^； 更高。
典型地，本文提供的修饰的EPO多肽显示与未修饰的或野生型EPO相比至少一种基本上不变(小于1%、5%或10%变化)的活性。在一些实施例中，与未修饰EPO相比活性增加。在其它实施例中，与未修饰EPO多肽相比活性降低。活性包括例如促红细胞生成或组织保护活性，并且可以与未修饰多肽相比，所述未修饰多肽例如是成熟的野生型天然EPO 多肽(SEQ ID NO :2或237)，野生型前体EPO多肽(SEQ ID NO 1 or 236)或者用作起始材料的任何前体EPO多肽。
a.丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶参与机体一系列功能，包括血液凝集、炎症以及原核生物和真核生物中的消化酶。丝氨酸蛋白酶是序列特异性的。尽管蛋白酶级联激活凝血和补体，其它蛋白酶参与信号途径、酶激活和不同细胞或细胞外区室中的降解功能。
丝氨酸蛋白酶包括但不限于胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，弹性蛋白酶，NS3，因子Xa， 粒酶B，凝血酶，纤溶酶，尿激酶，tPA和PSA。胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和弹性蛋白酶由胰腺腺细胞合成，分泌在小肠中并且负责催化肽键水解。所有这三种酶由它们的X射线结构显示结构类似。这些消化性丝氨酸蛋白酶的每一个靶向多肽链的不同区域，基于围绕裂解位点的氨基酸残基和侧链而不同。丝氨酸蛋白酶的活性位点成形为裂缝，多肽底物结合在此。 氨基酸残基是从多肽底物的N端到C端(Pi，…，P3，P2，P1，P1'，P2'，P3'，…，Pj)及其各自的结合亚位点(Si，…，S3，S2，Si，Sl'，S2'，S3'，…，Sj)标记。裂解在Pl和 ΡΓ之间催化。胰凝乳蛋白酶水解两侧为大的疏水性氨基酸残基肽键。特定的残基包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，它们适合进贴紧的疏水口袋(snug hydrophobic pocket) 0胰蛋白酶水解两侧为阳性电荷的氨基酸残基的肽键。代替具有胰凝乳蛋白酶疏水口袋，胰蛋白酶在口袋背部有一天冬氨酸残基，其可以与阳性电荷残基如精氨酸和赖氨酸相互作用。弹性蛋白酶水解两侧为小中性氨基酸残基如丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸的肽键。与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶相反，弹性蛋白酶含有用缬氨酸和苏氨酸排列的口袋，使其只是收缩，其可以容纳较小的氨基酸残基。丝氨酸蛋白酶遍在于原核生物和真核生物中并起重要的不同的生物学功能如止血、纤维蛋白溶解、补体形成和饮食蛋白消化。
属于丝氨酸蛋白酶家族的弹性蛋白酶展示与其它丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的广泛的序列同源性。丝氨酸弹性蛋白酶优先裂解与脂族氨基酸残基相邻的多肽，典型地为丙氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸，以及程度差一些的亮氨酸和异亮氨酸。人类具有6种弹性蛋白酶基因，它们编码结构相似的蛋白质，弹性蛋白酶1(ELA-1，也已知为胰腺弹性蛋白酶，PE，)，弹性蛋白酶2 (嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，NE，也已知为PMN弹性蛋白酶，骨髓丝氨酸蛋白酶，medullasin，人白细胞弹性蛋白酶，HLE)，弹性蛋白酶2A(ELA_2A)， 弹性蛋白酶2B(ELA-2B)，弹性蛋白酶3A(ELA-3A，弹性蛋白酶IIIA，蛋白酶E)，和弹性蛋白酶-3B(ELA-3B，弹性蛋白酶IIIB，蛋白酶E)。具有弹性蛋白酶活性的其它丝氨酸蛋白酶包括但不限于蛋白酶-3 (PR-3)、内源血管弹性蛋白酶(EVE)和内皮细胞弹性蛋白酶(ECE)。
嗜中性初级嗜苯胺蓝粒携带NE (ELA-2)和PR-3，它们在嗜中性粒细胞活化时被释放。NE参与胞外基质(ECM)降解，包括弹性蛋白、软骨蛋白聚糖、胶原蛋白和纤连蛋白的降解，以及通过吞噬作用吸收进细胞的材料的消化。NE还帮助降解蛋白质，如免疫球蛋白和表面活性剂脱辅蛋白。NE优先裂解Val-X键，以及程度差一些的Ala-X键。NE的异常或过量释放已与结缔组织更新、关节炎和炎症相联系。类似于NE，PR-3也激活酶原，如金属蛋白酶和细胞因子如TNF-α，IL-I β和白细胞介素_8 (IL-8)。
胰腺弹性蛋白酶(ELA-I)优先裂解Ala-X键并主要在皮肤角质形成细胞中表达。 ELA的表达正常不在成人胰腺中发现，尽管其经常在胰腺癌中表达并用作胰腺癌的标记。 正常胰腺的弹性蛋白酶活性归因于ELA-2A和ELA-2B。ELA-2A和ELA-2B优先裂解Leu_X， Met-X 禾口 Phe-X 键。
据信一些病理学症状至少部分是由于弹性蛋白酶和它们的内源抑制剂之间失衡导致。嗜中性粒细胞弹性蛋白酶特别是ELA-2导致的不受控蛋白酶降解参与多种病理学症状，如肺气肿、急性呼吸窘迫综合征、败血性休克、多器官衰竭、类风湿性关节炎和囊性纤维化。
高浓度的弹性蛋白酶可在胃肠道和血液中发现。因此，经这些途径施用的有效治疗剂可以通过弹性蛋白酶裂解位点的修饰而实现。
b.基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶(MMP)是Zn2+和钙依赖性内肽酶家族，其降解胞外基质(ECM)成分。另外，MMP还可以加工许多细胞表面细胞因子、受体和其它可溶蛋白。它们参与正常组织重塑过程如伤口愈合、怀孕和血管发生。在生理条件下，MMP作为无活性前体(酶原)产生并被加工成其活性形式。另外，所述酶由称为基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的内源抑制剂特异调节。MMP的蛋白酶解活性作为生理和病理条件中的组织重塑的效应物机制起作用，以及作为炎症介质起作用。这些蛋白质的过量合成和产生导致ECM的加速降解，其与各自疾病和病症相关，例如骨髓稳态、关节炎、癌症、多发性硬化和类风湿性关节炎。在神经炎性疾病中，MMP参与如下过程，例如(a)血脑屏障(BBB)和血液-神经屏障开放，(b)血液衍生的免疫细胞侵袭神经组织，(c)细胞因子和细胞因子受体脱落(shedding)，以及(d) 在周围和中枢神经系统疾病中的直接细胞损害(L印pert et al. Brain Res. Rev. 36(2-3) 249-57(2001) ；Borkakoti et al. Prog. Biophys. Mol. Biol. 70 (1) :73_94 (1998)). MMP家族成员包括胶原蛋白酶、明胶酶、基质降解酶、基质溶解因子和膜结合MMP。 大多数MMP以无活性酶原形式分泌。分泌的酶原MMP可以通过几种促炎性因子激活，促炎性因子例如氧化剂、蛋白酶包括弹性蛋白酶、纤溶酶和胰蛋白酶及其它MMP(Cuzner and Opdenakker. J. Neuroimmunol. 94(1-2) 1-14 (1999)) 在组织中，生理血 MMP 激活物包括组织或血浆蛋白酶或机会细菌蛋白酶。例如，纤溶酶原激活物/纤溶酶系统、包括遍在纤溶酶原和尿激酶(u-Pa)和组织型纤溶酶原激活物(t-Pa)是病理条件下pro-MMP的重要激活物。MMP活性可以由金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)抑制，由丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins) 抑制，及由非特异性蛋白酶抑制剂如α 2-巨球蛋白抑制。TIMP通过非共价结合MMP的活性锌结合位点而抑制MMP活性。MMP和纤溶酶原激活物的蛋白酶解活性及其抑制剂在维持ECM完整性方面很重要，因为细胞-ECM相互作用影响和介导广泛过程，包括各种细胞类型的增殖、分化、粘附和迁移。基质金属蛋白酶的过量产生牵涉到组织损害和伤口愈合、炎性疾病、±曾生性疾病禾口自身免疫疾病中(St-Pierre et al. Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 2(3) :206_215 (2003) ；Opdenakker, G. Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg. 59 (6) 489-514(1997))。
c.通过除去蛋白酶解位点导致的增加的蛋白酶解抗性 本领域技术人员已知任何方法如下文D部分所述方法可以用于修饰EPO多肽以增加蛋白酶抗性。例如，如本文实施例所述，2D扫描方法学已用于鉴别hEPO上的导致当用蛋白酶(血液、肠道等)、溶血产物或血清攻击时稳定性增加的氨基酸改变。增加对蛋白酶 (血液、裂解物、肠道、血清等)的蛋白质稳定性包括在本文中，以提供特定蛋白质分子的更长的体内半寿期，由此降低对象所需给药频率。
设计蛋白酶解抗性hEPO突变体的第一步包括鉴别蛋白质序列上易受蛋白酶解攻击的位点。基于选择的血液、肠道或任何其它类型蛋白酶列表(表2)，首先in Silico确定 hEPO中可以被那些蛋白酶靶向的所有氨基酸和氨基酸序列的完全列表。这些蛋白酶靶位 (hEPO多肽上的氨基酸或氨基酸序列)被称为in silico HIT(IS-HIT)0由于机体内蛋白酶混合物组成相当复杂，可以预期给定蛋白质序列中的大多数残基可以被蛋白酶解靶向。
设计蛋白酶解抗性的hEPO的第二步包括鉴别合适的置换氨基酸以便如果它们置换了 is-HIT处的hEPO的天然氨基酸，所述蛋白(i)变得蛋白酶解抗性；以及(ii)引起至少与野生型hEPO多肽相当的活性水平。置换氨基酸的选择必须考虑某些蛋白酶的广谱靶特异性以及保持理化性质如hEPO中关键(例如催化行、结合等)残基的疏水性、电荷和极性的需求。
“点接受的突变(Point Accepted Mutation)，，(PAM ；Dayhoff et al.，1978)可以用作2D扫描方法的部分。PAM值，最初用于产生蛋白质序列间的对比，可以以概率矩阵形式获得，其反映了氨基酸之间的进化距离。参考序列中的残基的保守取代是这样的取代，其与相应的参考残基物理学和功能上相似，即具有相似的大小、形状、电荷和/或化学性质，包括形成共价键或氢键和其它相互作用的能力。保守取代显示以最高评分适合可接收点突变形式的PAM矩阵标准。PAM250矩阵用于2D扫描框架中以鉴别用于is_HIT的候选置换氨基酸，以产生不影响蛋白质功能的保守突变。选择了至少两个氨基酸用于在每个is-HIT进行置换，所述氨基酸在PAM250矩阵中具有相应于保守取代或可接受点突变的最高值。明确避免氨基酸由半胱氨酸置换，因为这一变化可以导致分子间二硫键形成。
简而言之，使用PR0TE0L 算法(在线得自 infobiogen. fr 和 bioinfo. hku. hk/ services/analyseq/cgi-bin/proteol_in. pi)，建立了在 166 个氨基酸的成熟 hEPO 多肽 (SEQ ID NO 2)上的可以被识别为蛋白酶(血液、肠道等)的底物的残基的列表，见表2。 该算法基于蛋白酶、蛋白酶的蛋白酶解特异性以及被输入的多肽氨基酸序列生成了蛋白酶消化图。表2示出是用选择的蛋白酶和化学处理进行的蛋白酶解的靶位氨基酸位置的in silico 鉴别。
表2
氨基酸位置蛋白酶或化学处理
AspND内蛋白酶Asp-N
Chymo(F，W，Y，M，L) P胰凝乳蛋白酶
ClosR梭菌蛋白酶
CnBrM溴化氰
IBzOW邻碘苯甲酸
MyxoKMyxobacter
ΝΗ20ΗFgWM
ρΗ2. 5FpρΗ 2. 5
ProEnP脯氨酸内肽酶
权利要求
1.一种修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽，其包含在被不同糖基化位点掩蔽的掩蔽is-Hit残基处的2个氨基酸修饰；和在非掩蔽is-Hit残基处的一或多个额外的氨基酸修饰，条件是所述修饰不是选自 R4H/K20Q/R139H/L80I ；E159N/K20Q/R139H/L93I ；L153V/K20Q/R139H/L80I ；和 E159N/ K20Q/R139H/L80I。
2.权利要求1的修饰的EPO多肽，其中所述修饰选自K20Q/R139H/R4H；K20Q/R139H/ K52N ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/ R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/ L153V；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/ K52N/L80I/R139H ；K20Q/L93V/R139H/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N；K20Q/L93V/R139H/ K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/ L153V；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ； K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/R4H ；K20Q/K52N/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ； K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/K52N/L80I/ R139H ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H；K20Q/R139H/K52N/L153V ； R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/ R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N。
3.权利要求1或2的修饰的EPO多肽，其中所述修饰选自K20Q/L80I/R139H/E159N； K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/ R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ； K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；和 K20Q/L93V/R139H/ E159N/K52N。
4.一种修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽，其在未修饰的EPO多肽中包含选自L80I/ R139H/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/L93I ；K20Q/L153V ；K20Q/E159N ；K20Q/R4H ； K20Q/K52N ；K20Q/L80I ；和 K20Q/L93V 的 2 或多个氨基酸修饰。
5.权利要求1-4任一项的修饰的EPO多肽，其中所述多肽是糖基化的、部分糖基化的或去糖基化的。
6.权利要求5的修饰的EPO多肽，其中所述多肽由于在糖基化位点NM、N38或N83的一或多个处的一或多个进一步的氨基修饰而是部分糖基化的或去糖基化的，其中所述修饰消除了该位点的糖基化。
7.权利要求6的修饰的EPO多肽，其中所述修饰是选自N24H，N38H,N83H, N24K, N38K 和N8I的氨基酸置换。
8.—种修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽，其在未修饰的EPO多肽中包含选自R4H/ R150H ；R4H/R143H ；R4H/E159N ；R4H/R139Q ；R4H/L93I ；R4H/D96Q ；R4H/L130I ；R4H/L153V ； R4H/K20Q ；R4H/F48I ；R4H/R131Q ；R4H/K45N ；R4H/K52N ； R4H/K52Q ；R4H/L80I ；R4H/K116T ； R4H/D123N；R4H/D136N ；R4H/P90S ；R4H/D165Q ；R4H/D165H ；R4H/D165N ；R4H/K116N ；R4H/ R143H ；R4H/R166H ；R4H/L16I ；R4H/L16V ；R4H/L93I/R143Q；R4H/L93I/R150H ；R4H/R143Q/R150H ；和R4H/L93I/E159N的2或多个氨基酸修饰。
9.一种修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽，其在EPO多肽中包含2或多个修饰，其中至少一个修饰是相应于SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :237所示氨基酸残基的R4H。
10.权利要求9的修饰的EPO多肽，其中所述一或多个额外的氨基酸修饰选自P2S， P2A, P3S, P3A, R4Q, L5I，L5V，C7S, C7V, C7A, C7I，C7T，D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I，E37Q，E37H, E37N, P42S, P42A, D43H, K45T, W51S, W51H, K52T, M54V, M54I, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I, D96Q, D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123H, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, D165H, R166H，和 R166Q。
11.权利要求10的修饰的EPO多肽，其中所述额外的氨基酸修饰选自K20Q；F48I ； K52Q ；L80I ；P90S ；L93V ；L93I ；D96Q ；K116T ；L130I ；R131H ；R131Q；R143H ；R143Q ；R150H ； D123N ；D136N ；E159N ；K116N ；K45N ；K52N ；D165Q ；D165H ；D165N ；R166H ；L16I ；L16V ；R139H ； R139Q ；和 L153V。
12.权利要求11的修饰的EPO多肽，其中所述额外的氨基酸修饰选自K20Q;F48I； K52Q ；L80I ；L93V ；L93I ；K116T ；L130I ；R131H ；R143H ；R143Q ；R150H ；D123N ；E159N ；K116N ； K45N ；K52N ；D165H ；D165N ；L16I ；R139H ；R139Q ；禾口 L153V。
13.权利要求9-12任一项的修饰的EPO多肽，其中所述修饰的EPO选自R4H/R150H； R4H/R143H ；R4H/E159N ；R4H/R139H ；R4H/R139Q ；R4H/L93I ；R4H/D96Q ；R4H/L130I ；R4H/ L153V ；R4H/K20Q ；R4H/F48I ；R4H/R131Q；R4H/K45N；R4H/K52N ；R4H/K52Q ；R4H/L80I ；R4H/ K116T；R4H/D123N；R4H/D136N ；R4H/P90S ；R4H/D165Q ；R4H/D165H ；R4H/D165N ；R4H/K116N ； R4H/R143H ；R4H/R166H ；R4H/L16I ；R4H/L16V ；R4H/L93I/R143Q ；R4H/L93I/R150H ；R4H/ R143Q/R150H和 R4H/L93I/E159N。
14.权利要求1-13任一项的修饰的EPO多肽，其中所述未修饰的EPO多肽长度是160， 161，162，163，164，165 或 166 个氨基酸。
15.权利要求1-14任一项的修饰的EPO多肽，其中所述EPO多肽包含SEQID NO :2或 237所示氨基酸序列或与具有SEQ ID NO 2或237所示序列的多肽具有至少或具有至少大 ^ 60 %, 70 %, 75 %, 80 % , 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 或更高序列相同性的变体。
16.权利要求1-15任一项的修饰的EPO多肽，其中所述未修饰的EPO多肽包含SEQID NO :2或237所示氨基酸序列。
17.权利要求1-16任一项的修饰的EPO多肽，其中所述多肽被进一步修饰，且所述修饰是羧基化、羟基化、hasylation、氨甲酰化、硫酸化、磷酸化、白蛋白化、氧化或缀合聚乙二醇(PEG)部分的一或多种。
18.权利要求1-17任一项的修饰的EPO多肽，其中所述多肽含有导致该多肽的免疫原性、羧基化、羟基化、hasylation、氨甲酰化、硫酸化、磷酸化、氧化、PEG化或蛋白酶抗性发生改变的一或多个额外的氨基酸修饰。
19.编码权利要求1-18任一项的修饰的EPO多肽的核酸分子。
20.一种载体，其包含权利要求19的核酸分子。
21.一种细胞，其包含权利要求19的核酸分子。
22.一种细胞，其包含权利要求20的载体。
23.权利要求21或22的细胞，其是原核细胞或真核细胞。
24.一种药物组合物，其包含权利要求1-18任一项的修饰的EPO多肽。
25.权利要求对的药物组合物，其中所述组合物是液体、溶液、悬浮液、气雾剂、片剂、 锭剂或胶囊的形式。
26.权利要求25的药物组合物，其中所述组合物是片剂或胶囊的形式。
27.权利要求沈的药物组合物，其中所述片剂或胶囊是肠溶包衣的。
28.权利要求对-27任一项的药物组合物，其配制为口服、胃肠外、静脉内、皮下、口腔、 吸入、肌内、直肠或局部施用。
29.权利要求观的药物组合物，其配制为口服施用。
30.权利要求四的药物组合物，其中所述药物组合物配制口服施用至胃肠道。
31.一种治疗方法，包括施用权利要求M-30任一项的药物组合物，其中所述疾病或病症可被促红细胞生成素(EPO)治疗。
32.权利要求31的治疗方法，其中口服施用所述药物组合物。
33.权利要求31或32的治疗方法，其中所述疾病或病症选自伴随肾衰竭、AIDS、恶性疾病和慢性炎症的贫血；围手术期手术；铁超载病症；异常止血；组织保护治疗；神经性障碍； 和自体捐血。
34.权利要求33的方法，其中所述贫血选自地中海贫血，镰刀细胞贫血，早产儿贫血， 伴随顺钼化疗的贫血，和大剂量放疗和/或化疗加骨髓移植后贫血。
35.一种配制为口服施用的药物组合物，其包含修饰的治疗性多肽或所述多肽的活性片段，所述活性片段中含有一或多个修饰，其中所述治疗性多肽或其活性片段是含有至少一个糖基化位点的多肽；所述治疗性多肽或其活性片段在一或多个掩蔽的is-HIT残基处包含一或多个氨基酸修饰；及所述治疗性多肽或其活性片段与不包含所述一或多个氨基酸修饰的未修饰的治疗性多肽相比显示增加的蛋白酶抗性。
36.权利要求35的药物组合物，其中所述掩蔽的is-HIT残基选自在所述多肽的糖基化位点0_25人之内的is-HIT残基。
37.权利要求35或36的药物组合物，其中所述掩蔽的is-HIT残基选自在所述多肽的糖基化位点 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 或 25人之内的is-HIT残基。
38.权利要求35-37任一项的药物组合物，其中所述修饰的治疗性多肽是糖基化的、部分糖基化的或去糖基化的。
39.权利要求35-38任一项的药物组合物，其中所述治疗性多肽是细胞因子。
40.权利要求39的药物组合物，其中所述治疗性多肽选自促红细胞生成素(ΕΡ0)，白细胞介素-1 β (IL-I)，白细胞介素-2 (IL-2)，白细胞介素-3 (IL-3)，白细胞介素_4 (IL-4)，白细胞介素-5(IL-5)，白细胞介素-6(IL-6)白细胞介素_9 (IL-9)，干扰素-β (IFN-β)，干扰素-Y (IFN-γ)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)， 巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)，血小板生成素(TPO)，白血病抑制因子(LIF)，干细胞因子(SCF)，制瘤素M(OSM)和血管内皮生长因子(VEGF)。
41.权利要求40的药物组合物，其中所述治疗性多肽选自SEQID Ν0:2，237 274,276, 278，280，282，284，286，288，290，292，294，296，298，300，302，304 和 306 的任一个，其活性片段，或与 SEQ ID NO 2,237 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300，302，304和306任一所示多肽具有至少或至少大约60 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %， 95%，96%，97%，98%，99%或更高序列相同性的变体。
42.权利要求35-41任一项的药物组合物，其中所述治疗性多肽包含至少2个氨基酸修饰，及所述2个氨基酸修饰在被不同糖基化位点掩蔽的掩蔽is-HIT残基处。
43.权利要求35-42任一项的药物组合物，其中所述治疗性多肽是SEQID NO :2或SEQ ID NO :237所示的促红细胞生成素(EPO)多肽，或者是与具有SEQ ID NO :2或237所示序列的多肽具有至少或至少大约 60 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %， 99%或更高序列相同性的变体。
44.权利要求43的药物组合物，其中所述EPO多肽中的掩蔽is-HIT残基选自被在选自 N24，N38, N83和SU6的一或多个糖基化位点的糖基化掩蔽的残基。
45.权利要求44的药物组合物，其中所述掩蔽is-Hit残基选自相应于SEQID NO 2 或SEQ ID而237中氨基酸残基的氨基酸残基1 14丄16丄17』18，1(20工21工23工31丄；35， E37, P42, D43, E62, W64, L67, L69, L70, E72, L75, R76, L80, L81, P87, W88, E89, P90, L91, L93，D96，K97，P121，P122，D123，P129，L130，R131，D136，F138，R139，K140，L141，F142，R143 和 Y145。
46.权利要求45的药物组合物，其中所述掩蔽is-HIT残基被选自R14H，R14Q，L16I， L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E31Q, E31H, L35V, L35I, E37Q, E37H, P42S, P42A, D43Q, D43H, E62Q, E62H, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I，D96Q，D96H, K97Q, K97T, P121S, P121A, P122S, P122A, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H和Y145I的一或多个氨基酸修饰修饰。
47.权利要求46的药物组合物，其中所述掩蔽is-HIT残基被选自K20Q，L80I,P90S， L93I, L93V, D96Q, D123N, L130I, R131H, R131Q, D136N, R139H, R139Q, R143H 和 R143Q 的一或多个氨基酸修饰修饰。
48.权利要求47的药物组合物，其中所述掩蔽is-HIT残基被选自K20Q，L80I,L93I，L93V和R139H的一或多个氨基酸修饰修饰。
49.权利要求48的药物组合物，其中所述治疗性多肽是选自R139H;L93I；K20Q/ R139H ；K20Q/R139H/L93I ；L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/ L80I/R139H/L93I ；R139H/L80I ；R139H/L93V ；R139H/L93I ；K20Q ；K20Q/L93I ；L80I ；L93V ； K20Q/L80I ；和 K20Q/L93V 的修饰的 ΕΡ0。
50.权利要求49的药物组合物，其中所述治疗性多肽是选自R139H，R139H/K20Q，K20Q/ R139H/L93I ；L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/L80I/R139H/ L93I ；R139H/L80I ；R139H/L93V 禾口 R139H/L93I 的修饰的 ΕΡ0。
51.权利要求35-50任一项的药物组合物，其中所述治疗性多肽在非掩蔽is-HIT残基处进一步包含一或多个氨基酸修饰。
52.权利要求51的药物组合物，其中所述治疗性多肽是促红细胞生成素(EPO)多肽且所述非掩蔽is-HIT残基选自相应于 SEQ ID NO :2 或 237 的氨基酸残基 P2，P3，R4, L5，C7，D8，RIO, L12, E13, Y15, C29, K45, F48, Y49, W51, K52, R53, M54, E55, L102, R103, L105, L108, L109, R110, L112, K116, E117, F148, L149, R150, K152, L153, K154, L155, Y156, E159, R162, D165，和 R166。
53.权利要求52的药物组合物，其中所述在非掩蔽is-HIT残基处的进一步修饰选自 P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I，C7T，D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I，E13Q，E13H, E13N, Y15H, Y15I, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I，W51S，W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62N, L102V, L102I，R103H，R103Q,L105I，L105V，L108I，L108V，L109I，L109V，R110H,R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123Q, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H，和 R166Q0
54.权利要求53的药物组合物，其中所述在非掩蔽is-HIT残基处的进一步修饰选自 R4H ；F48I ；K52Q ；K116T ；R150H ；E159N ；K116N ；K45N ；K52N ；D165Q ；D165H ；D165N ；R166H ；和 L153V。
55.权利要求M的药物组合物，其中所述在非掩蔽is-HIT残基处的进一步修饰选自 R4H, K52N, L153V 和 E159N。
56.权利要求51-55任一项的药物组合物，其中所述治疗性多肽是具有选自如下修饰的修饰的 EPO 多肽:R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ；R139H/E159N ；K20Q/R139H/ R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/ R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/ E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/ E159N ；K20Q/L93I/R139H/K52N；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/ L80I/R139H/E159N ；K20Q/K52N/80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/L153V；K20Q/L93V/R139H/ R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/ R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/L153V；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L153V；K20Q/ E159N ；K20Q/R4H ；K20Q/K52N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/R4H ；K20Q/K52N/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/ E159N/R4H；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/ K52N/L80I/R139H ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/ K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N。
57.权利要求56的药物组合物，其中所述治疗性多肽是具有选自如下修饰的修饰的 EPO 多肽R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ；R139H/E159N ；K20Q/R139H/R4H ；K20Q/ R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/R139H/ E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/E159N ；L93V/ R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/E159N；K20Q/ L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/ E159N ；K20Q/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/ L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/ R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/ K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/R4H ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N/ K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L931/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/ K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/ R4H；K20Q/R139H/K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/ L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/ K52N。
58.权利要求57的药物组合物，其中所述治疗性多肽是具有选自如下修饰的修饰的 EPO 多肽K20Q/R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ； L80I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/E159N ；K20Q/L93I/R139H/ K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/ L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H；K20Q/L80I/ R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/ L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/ E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/ R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/L801/Rl39H/L931 ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/ K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N。
59.权利要求58的药物组合物，其中所述治疗性多肽是具有选自如下修饰的修饰的 EPO 多肽K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/ L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N。
60.权利要求43-59任一项的药物组合物，其在糖基化位点N24、N38和N83的一或多个处进一步包含一或多个氨基修饰，其中所述修饰消除了在该位点的糖基化。
61.权利要求60的药物组合物，其中所述修饰是选自NMH，N38H,N83H, N24K, N38K和 N83K的氨基酸置换。
62.权利要求43-61任一项的药物组合物，其中所述未修饰的EPO多肽长度是160， 161，162，163，164，165 或 166 个氨基酸。
63.权利要求43-62任一项的药物组合物，其中所述未修饰的EPO多肽包含SEQID NO: 2或237所示氨基酸序列。
64.权利要求35-63任一项的药物组合物，其中所述修饰的治疗性多肽被进一步修饰且所述修饰是羧基化、羟基化、hasylation、氨甲酰化、硫酸化、磷酸化白蛋白化、氧化或缀合聚乙二醇(PEG)部分的一或多种。
65.权利要求35-64任一项的药物组合物，其中所述修饰的治疗性多肽含有导致修饰的治疗性多肽的免疫原性、羧基化、羟基化、hasylation、氨甲酰化、硫酸化、磷酸化、氧化、 PEG化或蛋白酶抗性发生改变的一或多个额外的氨基酸修饰。
66.权利要求35-65任一项的药物组合物，其配制为片剂或胶囊。
67.权利要求66的药物组合物，其中所述片剂或胶囊是肠溶包衣的。
68.权利要求35-67任一项的药物组合物，其配制为液体。
69.一种治疗方法，其包含口服施用权利要求35-68任一项的药物组合物，其中所述疾病或病症可被所述治疗性多肽治疗。
70.权利要求69的治疗方法，其中所述药物组合物中的修饰的治疗性多肽是修饰的促红细胞生成素(EPO)且所述疾病或病症选自伴随肾衰竭、AIDS、恶性疾病和慢性炎症的贫血；围手术期手术；铁超载病症；异常止血；组织保护治疗；神经性障碍；和自体捐血。
71.权利要求70的方法，其中所述贫血选自地中海贫血，镰刀细胞贫血，早产儿贫血， 伴随顺钼化疗的贫血，和大剂量放疗和/或化疗加骨髓移植后贫血。
72.权利要求M-30或35-68任一项的药物组合物，其配制为用于治疗可用所述促红细胞生成素(EPO)多肽或所述治疗性多肽治疗的疾病或病症的药物。
73.权利要求M-30或35-68任一项的药物组合物，其用于治疗可用所述促红细胞生成素(EPO)多肽或所述治疗性多肽治疗的疾病或病症。
全文摘要
提供了修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和其它修饰的治疗性多肽。所述EPO多肽和其它治疗性多肽经修饰分别显示与未修饰的EPO多肽和其它未修饰的治疗性多肽不同的物理性质和活性。还提供了编码这些多肽的核酸分子。还提供了利用所述多肽的治疗和诊断方法。
文档编号C12N15/12GK102186879SQ200980129823
公开日2011年9月14日 申请日期2009年5月29日 优先权日2008年5月29日
发明者T·居永, G·伯雷利, X·加莱, L·德里坦提, M·维嘉 申请人:韩诺生物制约株式会社