专利名称：对具有硒酸还原活性增强能力的蛋白质进行编码的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质、对其进行编码的基因、使用它们的硒酸的还原方法。
背景技术：
作为微量金属(稀有金属)之一的硒，就生物而言是必须元素，但水溶性的硒化合物(硒酸、亚硒酸等)对生物具有毒性。硒用于复印机、玻璃的着色等较宽范围的用途，所以对于其供给源的确保是重要的。另外，废水、废弃物中的硒化合物对人的健康及生态系统的影响成为问题。作为硒酸的无毒化及除去方法，一直以来在研究树脂吸附、电化学方法等， 但从效率、成本等问题出发未达到实用的程度。另外，无法通过这样的方法来回收硒而进行再利用。本发明人等的目标在于开发硒化合物的生物学的处理方法，从玻璃工场的污泥分离革兰氏阳性细菌硒砷芽孢杆菌(Bacillus selenatarsenatis)SF-l株(以下称为“SF-1 株”)(专利文献1、非专利文献1、非专利文献幻。SF-I株具有将硒酸有效地还原成亚硒酸、进而将亚硒酸还原成元素态硒的能力。元素态硒不溶于水，且无毒，所以有如下可能，即只要使用SF-I株，可以比较低价地将含有硒化合物的废水等无毒化，从其中回收硒而再利用。为了更有效地进行利用了微生物的硒化合物的处理及硒的回收，除了处理条件的研究、设备的开发之外，还需要明确有关硒化合物的还原的分子水平机制。但是，目前为止几乎没有得到有关硒化合物的还原的酶及有关对其进行编码的基因的观点。本发明人等为了弄清楚SF-I株的硒化合物还原机制，对与硒化合物的还原有关的基因进行分析(非专利文献3)，在导入到肠埃希氏菌(Escherichia coli)时，从SF_1株分离出下述DNA片段，所述DNA片段包含对显示从硒酸向亚硒酸的还原活性的蛋白质进行编码的3个开放读码框 (ORF)(非专利文献4)。但是，这些不过是与硒化合物的还原有关的基因组的一部分，需要进一步的分析。专利文献1 日本特开平9-M8595号公报非专利文献1 =Fujita, M.等，J. Ferment. Bioeng. ,83 :517-522(1997)非专利 文献 2 :Yamamura， S.等，Int. J. Syst. Evol. Microbiol. ，57 1060-1-64(2007)非专利文献3:黑田真史等，第57届日本生物工学会大会讲演要旨集、 3A10-2(2005)非专利文献4:永野公太等，第60届日本生物工学会大会讲演要旨集、 1Βρ09(2008)
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于，提供具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质、对其进行编码的基因、使用它们的硒酸的还原方法。用于解决课题的手段本发明如下所示。[1] 一种蛋白质，其是从由以下所构成的组中选择的蛋白质(a)含有序列号8的氨基酸序列的蛋白质；(b)含有序列号8的氨基酸序列中缺失、置换或增加1个或数个氨基酸后的氨基酸序列，且在与含有序列号10的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质；及(c)含有与序列号8的氨基酸序列具有50%以上序列同源性的氨基酸序列，且在与含有序列号10的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质。[2], 一种蛋白质，其是从由以下所构成的组中选择的蛋白质(a)含有序列号10的氨基酸序列的蛋白质；(b)含有序列号10的氨基酸序列中缺失、置换或增加1个或数个氨基酸后的氨基酸序列，且在与含有序列号8的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质；及(c)含有与序列号10的氨基酸序列具有60%以上序列同源性的氨基酸序列，且在与含有序列号8的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质。[3], 一种核酸，其对上述[1]的蛋白质进行编码。[4],上述[3]的核酸，其从由以下所构成的组中选择(a)含有序列号7的核苷酸序列的核酸；(b)与含有序列号7的核苷酸序列的核酸在严格的条件下进行杂交，且对在与含有序列号10的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质进行编码的核酸。5. 一种核酸，其对上述[2]的蛋白质进行编码。6.上述[5]的核酸，其从由以下所构成的组中选择(a)含有序列号9的核苷酸序列的核酸；(b)与含有序列号9的核苷酸序列的核酸在严格的条件下进行杂交，且对在与含有序列号8的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质进行编码的核酸。[7], 一种硒酸的还原方法，其中，包括使宿主细胞表达上述[1]的蛋白质及上述[2]的蛋白质的步骤。[8],上述[7]的方法，其中，通过将上述[3]的核酸及上述W]的核酸导入宿主细胞，来进行上述[1]的蛋白质及上述[2]的蛋白质的蛋白质的表达。[9],上述[7]的方法，其中，还包括使宿主细胞表达含有序列号2的氨基酸序列的蛋白质、含有序列号4的氨基酸序列的蛋白质及含有序列号6的氨基酸序列的蛋白质。发明的效果
通过本发明，提供具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质、对其进行编码的基因、 使用它们的硒酸的还原方法。
图1是表示3个0RF、mpoA(用数字“3”表示)、mpoB(用数字“4”表示)、mpoC (用数字“5”表示)的配置、转录/翻译方向(如箭头所示)及元素态硒生成能力欠缺突变株中Tn916插入部位(用“Τη916”表示)的图。图2是表示2个ORF、dcpA (用数字“3”表示)、mutT (用数字“4”表示)的配置、 转录/翻译方向(如箭头所示)及元素态硒生成能力欠缺突变株中Tn916插入部位(用 “Τη916”表示)的图。图3是表示mpoA、mpoB及mpoC以及dcpA及mutT表达用载体的结构的 图。A :pGEM-mpoABC ;B :pGEM-dcpAmutT ;C :pGEM-dcpAmut T-mpoABC ；及 D: pGEM-mpoABC-dcpAmutT。图4是表示mpoA、mpoB及mpoC以及dcpA及mutT对肠埃希氏菌中的硒酸还原的效果的图。
具体实施例方式本说明书中使用的所谓“硒化合物”的用语，是指含有硒的化合物。作为硒化合物的例子，可以举出硒酸、亚硒酸等。本说明书中使用的所谓“元素态硒”的用语，是指不与其他元素形成化合物的元素形态的硒。本说明书中使用的所谓“硒酸还原活性”的用语，是指将硒酸还原成亚硒酸的活性。本说明书中使用的所谓“硒酸还原酶”的用语，是指对自硒向亚硒酸的还原进行催化的蛋白质。本说明书中使用的所谓“亚硒酸还原活性”的用语，是指将亚硒酸还原成元素态硒的活性。本说明书中使用的所谓“亚硒酸还原酶”的用语，是指对自亚硒酸向元素态硒的还原进行催化的蛋白质。硒砷芽孢杆菌SF-I株(SF-1株)，已知具有硒酸还原活性、及亚硒酸还原活性(专利文献1、非专利文献1、非专利文献i)。硒酸还原活性可以通过对由硒酸生成的亚硒酸进行定量来加以测定。亚硒酸还原活性可以通过对由亚硒酸生成的元素态硒进行定量来加以测定。由核酸编码的蛋白质所具有的硒酸还原活性，例如，将该基因导入到已知具有亚硒酸还原活性的肠埃希氏菌(Bebien，M.等，Microbiology，148 :3865-3872(2002))时有元素态硒生成，这可以通过观察由含有硒酸的培养基上的菌落的红色显色来确认。本说明书中使用的所谓“增强硒酸还原活性的能力，，或“硒酸还原活性增强能力，， 的用语，是指可以增强硒酸还原活性的能力。当对由硒酸生成的亚硒酸进行定量时，在与对照相比活性显著增加的情况下，硒酸还原活性增强。关于由分离后的核酸编码的蛋白质所具有的硒酸还原活性增强能力，通过观察由含有硒酸的培养基上的菌落的红色显色强度的增加，来确认在将该基因导入到含有对硒酸还原酶进行编码的基因的肠埃希氏菌时生成的元素态硒的水平。作为硒酸还原酶，例示出含有由本发明人等从SF-I株分离得到的3个开放读码框 (ORF)、mpoA(序列号1)、mpoB (序列号3)及mpoC(序列号5)所编码的蛋白质MpoA (序列号
52)、MpoB (序列号4)及MpoC (序列号6)的酶(非专利文献4)(关于蛋白质MpoA, MpoB及 MpoC，根据其作为硒酸还原酶(selenatereductasekrd))的功能和源自鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)的连四硫酸还原酶基因的簇的类似性，分别称为SrdB、SrdC、及 SrdA ；对这些蛋白质进行编码的ORF也分别称为srdB、srdC及srdA)。MpoA、MpoB及MpoC 分别与各种公知的钼蝶呤氧化还原酶铁-硫结合亚单位(铁 硫簇)、钼蝶呤氧化还原酶膜亚单位(膜结合亚单位)及钼蝶呤二核苷酸结合区域(保有磷酸基结合部位的催化部位) 具有同源性。另外，MpoA、MpoB, MpoC与源自鼠伤寒沙门氏菌的连四硫酸还原酶具有类似性 (Hensel，M等，Mol. Microbiol. ,32 :275-287 (1999))。源自鼠伤寒沙门氏菌的连四硫酸还原酶基因形成簇，成为在对具有钼蝶呤鸟嘌呤二核苷酸辅助因子的活性中心部分亚单位进行编码的ttrA基因的上游，有作为膜结合亚单位的ttrC基因、含有铁 硫簇的作为亚单位的ttrB基因存在的结构。该位置关系与mp0A、mp0B、mp0C的位置关系非常类似。该文献中记载有ttrA、ttrB及ttrC为连四硫酸还原酶的结构基因。因此，提示本发明人等得到的 mp0A、mp0B、mp0C也同样构成钼蝶呤氧化还原酶的结构基因。另外，mpoB对膜结合亚单位进行编码，与所谓SF-I株的硒酸还原酶为膜结合型的以前的报告一致(Jpn. J. offfat. Treat. Biol. ,40 :161-168(2004)) ο作为具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质，例示出由本发明人等从SF-I株分离出的2个ORF、dcpA(序列号7)及mutT(序列号9)所编码的蛋白质DcpA(序列号8)及 MutT (序列号10)的组合。使这些蛋白质与硒酸还原酶(例如含有MpoA、MpoB及MpoC的物质)一起在肠埃希氏菌中表达时，与仅表达硒酸还原酶的情况相比，硒酸还原活性增强。DcpA的氨基酸序列(序列号8)，与各种公知的二鸟苷酸环化酶/磷酸二酯酶具有同源性。二鸟苷酸环化酶是催化由2分子的GTP合成环二鸟苷酸(c-di-GMP)的酶， 磷酸二酯酶是对c-di-GMP的分解进行催化的酶。通常已知二鸟苷酸环化酶/磷酸二酯酶中存在G⑶EF(Gly-Gly-Asp-Glu-Phe)序列及EAL(Glu-Ala-Leu)序列，含有这些的区域被分别称为G⑶EF结构域及EAL结构域(Mendez-Ortiz，Μ. M.等.，J. Biol. Chem.， 观1-8090-8099(2006))。另外，提示前者担负c-di-GMP的合成，后者担负c-di-GMP的分解 (Tamayo, R.等.，Infectionand Immunity, 76 1617-1627 (2008))。DcpA 中可见 GGDEF 序列(序列号8、238 242位)未见EAL序列。因此，DcpA有可能仅具有担负c-di-GMP的合成的二鸟苷酸环化酶活性。MutT的氨基酸序列(序列号10)与各种公知的MutT/nudix (nucleoside diphosphates linked to other moieties，X)家族蛋白质具有同源性。MutT/nudix家族蛋白质是对在其他分子上键合的核苷二磷酸的水解进行催化的酶的总称，MutT是对分解GTP 而生成GMP的反应进行催化的酶。DcpA及MutT增强硒酸还原活性的机制尚不明确，但如果考虑从SF-I株得到的硒酸还原酶与含有钼蝶呤作为辅助因子的钼蝶呤氧化还原酶具有同源性，和钼蝶呤由GTP合成(Cell Mol. Life Sci. ,62 :2792-2810 (2005))，DcpA及MutT 有可能参与硒酸还原酶的辅助因子的合成。另外，MpoA、MpoC与Tat(Twin-arginine translocation)途径信号也具有高同源性。革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已知作为蛋白质分泌途径具有Sec途径及Tat途径。在Sec途径中，在通过细胞膜时，输送的蛋白质的结构被拆解。另一方面，Tat途径中，在细胞质内折叠的蛋白质以折叠状态直接通过细胞膜。可以说含有钼蝶呤等辅助因子的蛋白质经由该Tat途径被输送(van Dijil, J. Μ.等，J. Biotechnol.， 98 :243-254(2002)).这也提示源自SF-I株的硒酸还原酶含有辅助因子的可能性。本发明人等报告了在将3个0RF、mpOA、mpOB、mpOC导入到肠埃希氏菌时显示硒酸还原活性(非专利文献4)。由此，提示对于硒酸的还原而言通过由这些ORF所编码的蛋白质是足够的。因此，所谓通过进一步导入dcpA及mutT而使得硒酸还原活性进一步增强的观点预料不到的。就SF-I株而言，即便在对mpoA、mpoB及mpoC进行编码的区域、以及对 dcpA及mutT进行编码的区域的任意区域被插入了转座子Tn916的情况下，也会丧失硒酸还原活性，所以在SF-I株中，这两个区域的基因对于硒酸还原活性而言是必须的。即便没有dcpA及mutT的存在也会在肠埃希氏菌中观察到硒酸还原活性的理由尚不明确，但在用作宿主的肠埃希氏菌中有可能存在用作dcpA及mutT的功能代替物的蛋白质。序列号8的氨基酸序列和示出最高同源性的公知序列(diguanylate cyclase with PAS/PAC sensor [ ± ^ ff ^ (Geobacillus sp. )G11MC16] > GenBank Accession No. ZP_03149864)的序列同源性为48%，序列号10的氨基酸序列和示出最高同源性的公知 歹Ij (Mut T/nudix family protein,putative^ (Bacillus cereus)G9241] > GenBank Accession No. ZP_00238672)的序列同源性为56%。氨基酸序列的同源性的计算使用了 BLAST 程序(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/Blast. cgi)。含有序列号 8 或 10的氨基酸序列和具有高于其的序列同源性的氨基酸序列且在分别与含有序列号10或8 的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质的组合，也可以在本发明中适当使用。就这样的序列同源性而言，是与序列号8的氨基酸序列的例如50%、优选70%、更优选80%、进一步优选90%的序列同源性，是与序列号10的氨基酸序列的例如 60 %、优选70 %、更优选80 %、进一步优选90 %的序列同源性。另外，在本发明中，可以使用含有序列号8或10的氨基酸序列中有1个或数个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列且在分别与含有序列号10或8的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质的组合。在本发明中，使用对如上所述的具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质进行编码的核酸。在1个实施方式中，该核酸是含有序列号7或9的核苷酸序列的核酸。在其他实施方式中，本发明的核酸，是与含有序列号7或9的核苷酸序列的核酸在严格的条件下进行杂交，且在分别与含有序列号10或8的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质进行编码的核酸。本说明书中使用的所谓“严格的条件”的用语，是指紧缩的杂交条件。这样的条件例如记载于Sambrook，J.等(eds)，分子克隆实验指南第二版(Molecular Cloning :A Laboratory Manual Second Edition)，冷泉港实验室出版社(1989)等中。作为使用长度为100核苷酸以上的探针时的严格条件的例子，可以举出 6XSSC、0. 5%十二烷基硫酸钠(SDS)、5XDenhardt，s试剂、100 μ g/mL变性片段化鲑鱼精子DNA中68°C下的孵化、2XSSC、0. 1% SDS中室温下的清洗(使SSC浓度降低至0. 1及/ 或将温度升至68 °C)。在本发明的硒酸的还原方法中，具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质在宿主细胞中得以表达。作为宿主细胞，可以使用任意细胞，但优选能在硒化合物的存在下生存的细菌。在1个实施方式中，具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质的表达，通过将对该蛋白质进行编码的核酸导入到宿主细胞来进行。为了该目的，优选使用确立重组DNA技术的细菌作为宿主。作为这样的细菌的例子，虽然没有限定，但可以举出肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌等。核酸的导入使用能在所选择的宿主细胞中复制的载体。载体可以使用源自质粒、噬菌体、病毒等的载体。含有核酸的载体中包含担负目标基因的转录的启动及终止的序列(启动子、终止子等)、开始翻译所需的序列(核糖体结合部位等)。本领域技术人员可以选择适合宿主细胞的这些序列。例如，当原本存在于对具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质进行编码的序列的上游的启动子在宿主细胞中发挥功能的情况下，可以利用该启动子，或者也可以在宿主细胞中发挥功能的其他启动子的控制下配置目标基因使其表达。在宿主细胞不具有硒酸还原酶的情况下，硒酸还原酶可以在宿主细胞中进一步表达。以下，通过实施例详细说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。实施例参考例1 元素态硒生成能力欠缺突变株的获得为了得到欠缺元素态硒生成能力的突变株，通过接合转移，将具有四环素耐药性基因的转座子 Tn916 (Scott，J. R.，等，Annu. Rev. Microbiol. ,49 :367-397 (1995))，从粪肠球菌(Enterococcus faecalis) CG110株(以下称为“CG110株”)导入到硒砷芽孢杆菌SF-1 株(JCM14380、DSM18680)的自然链霉素耐药性突变株(以下称为“Snf株”)。Tn916被插入到导入后的细菌基因组中。因此，在Τη916导入株中，由于Τη916的插入而使参与硒酸的还原或亚硒酸的还原的基因遭到破坏，结果有可能存在欠缺从硒酸生成元素态硒的能力的菌株。在含有链霉素500 μ g/mL的TSB (胰胨豆胨培养液Trypticase Soy Broth)培养基(17. 0g/L酪蛋白、3. 0g/L大豆胨、2. 5g/L葡萄糖、5. 0g/L氯化钠、2. 5g/L磷酸氢二钾)3mL中，在37°C下摇床培养20小时得到Snf株，将该Snf株以7000rpm在4°C下离心分离，进行了集菌。将CGllO株在LB(10g/L细菌用胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L氯化钠) 琼脂培养基上于37°C培养20小时。向该板上添加上述的Smr株的悬浮液，混合2种细菌， 在37°C下培养一晚。使存活的菌体悬浮在TSB培养基IOmL中，将其100倍稀释液200 μ L 接种于多层硒酸选择培养基(在含有链霉素500 μ g/mL、四环素10 μ g/mL、硒酸0. 5mM的LB 琼脂培养基流固后、将等量的含有链霉素500 μ g/mL、四环素10 μ g/mL的LB琼脂培养基流固后的培养基)，在37°C培养一晚。得到Tn916导入株作为对四环素及链霉素示出耐药性的菌落。将上述板在30°C下进行孵化。在该板上，具有元素态硒生成能力的菌株形成红色的菌落，与此相对，欠缺元素态硒生成能力的菌株形成白色的菌落。选择白色的相对小的菌落(一次筛选)。在含有链霉素500 μ g/mL、四环素10 μ g/mL、硒酸钠ImM的LB琼脂培养基上将这些菌落在37°C需氧性地培养一晚之后，使用AnaeroPouch · ’、八(三菱气体化学)并在30°C厌氧性地培养2天。培养后得到了不呈现成为元素态硒生成能力的指标的红色的菌株及红色下降的菌株(二次筛选)。参考例2 利用反向PCR法及LA PCR法的Tn916插入部位周围的DNA序列的决定使用AquaPure Genomic DNA Kit (BI0-RAD)，由在参考例1中得到的元素态硒生成能力欠缺株制备基因组DNA。将该基因组DNA用合适的限制性内切酶进行了消化之后， 供于使用了 T4 DNA连接酶的自身连接。通过以该反应混合物为模板，使用Tn916特异性引物来实施聚合酶链式反应，由此对Tn916插入部位周边的DNA进行扩增，来决定该核苷酸序列。使用基于如此得到的核苷酸序列而合成的引物，使用未插入Τη916的SF-I株的基因组 DNA 作为模板，通过使用了 LA PCR(商标)in vitro Cloning Kit(Takara-Bio)的 DNA 的扩增(LA PCR)，对插入了 Tn916的位置的周边的DNA进行扩增，来决定该核苷酸序列。 在LA PCR中，作为DNA聚合酶，试剂盒使用附加的TaKaRa LA Taq或I^rimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara-Bio)。关于通过上述的操作决定的核苷酸序列，对开放读码框(ORF)进行检索，进而对由其编码的氨基酸序列和公知的蛋白质的氨基酸序列进行比较，由此来鉴定对有可能参与硒化合物的还原的蛋白质进行编码的2个区域。参考例3 :mpoABC操纵子的分析通过参考例2中记载的步骤，发现含有对与公知的钼蝶呤氧化还原酶铁-硫键亚单位(铁 硫簇)、钼蝶呤氧化还原酶膜亚单位(膜结合亚单位)及钼蝶呤二核苷酸键区域 (磷酸基结合部位)具有同源性的蛋白质进行编码的3个ORF的区域。这些ORF从上游向下游按照上述顺序存在于相同方向(图1中用数字“3”、“4”、“5”表示)。将它们分别命名为mpoA、mpoB、mpoC。将mpoA、mpoB、mpoC的核苷酸序列分别示为序列号1、3、5，将由它们编码的蛋白质MpoA、Mp0B、Mp0C的氨基酸序列分别示为序列号2、4、6。由于mpoA的终止密码子和mpoB的启动密码子之间的长度非常接近约17bp，及mpoB和mpoC重复约40bp，所以这3个ORF形成操纵子，其转录通过存在于mpoA的上游的启动子样区域来启动，在存在于 mpoC的下游的终止子样区域终止。需要说明的是，就在参考例1中得到的元素态硒生成能力欠缺突变株而言，Tn916被插入到mpoC区域内(图1中用“Tn916”表示)。使用弓丨物0PER0N1F (序列号11)及0PER0N1R (序列号12)，对包含启动子及3个ORF mpoA、mpoB、mpoC的区域进行扩增，插入TA克隆载体pGEM(注册商标)-T简便载体 asy Vector) (Promega)的多克隆部位，得到了质粒pGEM-mpoABC(图3A)。使用该质粒对肠埃希氏菌DH5 α感受态细胞进行转化。将得到的转化株DH5 α /pGEM-mpoABC,与通过不含mpoA、 mpoB、mpoC的质粒转化后的对照菌株DH5 α /pGEM 一起接种于添加了硒酸0. 5mmol/L的LB 培养基。作为对照，也使用未添加硒酸的培养基。需要说明的是，肠埃希氏菌原本具有还原亚硒酸的能力(Bebien, Μ.等，Microbiology，148 :3865-3872 Q002))，所以只要转化体具有将硒酸还原成亚硒酸的能力，则可以在添加硒酸的培养基上生成元素态硒，其结果，菌落变成红色。结果是DH5 α /pGEM-mpoABC株呈现红色，所以表示在导入了 3个ORF的肠埃希氏菌内显示将硒酸还原成亚硒酸的活性(图4的DH5 α /pGEM-mpoABC)。实施例1 :dcpAmutT操纵子的分析通过参考例2中记载的步骤，发现包含对与公知的二鸟苷酸环化酶/磷酸二酯酶及MutTnudix家族蛋白质具有同源性的蛋白质进行编码的2个ORF的区域。这些ORF从上游向下游按照上述顺序存在于相同方向(图2中用数字“3”、“4”表示)。它们分别被命名为dcpA、mutT。将dcpA、mutT的核苷酸序列分别示为序列号7、9，将由它们编码的蛋白质 DcpA、MutT的氨基酸序列分别示为序列号8、10。由于dcpA的终止密码子和mutT的启动密码子之间的长度非常接近约30bp，所以这2个ORF形成操纵子，其转录通过存在于dcpA的上游的启动子样区域来启动，在存在于mutT的下游的终止子样区域终止。需要说明的是， 就在参考例1中得到的元素态硒生成能力欠缺突变株而言，Tn916被插入到dcpA区域内(图2中用“Tn916”表示)。使用引物ALLGGDEFFW(序列号13)及ALLGGDEFRV (序列号14)，对含有启动子及2 个ORF dcpA、mutT的区域进行扩增，插入到TA克隆载体pGEM-Τ简便载体(注册商标)的多克隆部位，得到了质粒pGEM-dcpAmutT (图;3B)。使用该质粒对肠埃希氏菌DH5 α感受态细胞进行转化。将得到的转化株DH5 α /pGEM-dcpAmutT,与通过不含dcpA、mutT的质粒转化后的对照菌株DH5 α /pGEM —起接种于添加了硒酸0. 5mmol/L的培养基。结果是所有的菌株都不呈现红色，所以表示未示出2个ORF直接将硒酸还原成亚硒酸的活性(图4的DH5 α / pGEM-dcpAmutT)。接着，使用引物UPALLGGDEFFW(序列号1 及UPALLGGDEFRV (序列号16)、或引物 D0WNALLG⑶EFFW(序列号 17)及 D0WNALLG⑶EFRV (序列号 18)，对包含 2 个 ORF dcpA、mutT 的区域进行扩增，得到了向参考例3中得到的质粒pGEM-mpoABC中的mpoA、mpoB、mpoC的上游或下游以相同方向插入的质粒pGEM-dcpAmut T-mpoABC及pGEM-mpoABC-dcpAmutT (图 3C 及 D)。将含有 pGEM-mpoABC-dcpAmutT 的 DH5 α /pGEM-mpoABC-dcpAmut T 株与上述相同接种于添加了硒酸的培养基，结果观察到比DH5 α /pGEM-mpoABC株更强的红色(图4的 DH5 α /pGEM-mpoABC-dcpAmutT)。关于导入了 pGEM-dcpAmut T-mpoABC 的菌株，也得到相同的结果(数据未示出)。如此2个基因dcpA、mutT在肠埃希氏菌中示出mpoA、mpoB、mpoC 所示的具有增强硒酸还原活性的能力。产业上的可利用性通过本发明，提供具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质、对其进行编码的基因、 它们的硒酸的还原方法。
10
权利要求
1.一种蛋白质，其是从由以下所构成的组中选择的蛋白质(a)含有序列号8的氨基酸序列的蛋白质；(b)含有序列号8的氨基酸序列中缺失、置换或增加1个或数个氨基酸后的氨基酸序列，且在与含有序列号10的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质；及(c)含有与序列号8的氨基酸序列具有50%以上序列同源性的氨基酸序列，且在与含有序列号10的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质。
2.一种蛋白质，其是从由以下所构成的组中选择的蛋白质(a)含有序列号10的氨基酸序列的蛋白质；(b)含有序列号10的氨基酸序列中缺失、置换或增加1个或数个氨基酸后的氨基酸序列，且在与含有序列号8的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质；及(c)含有与序列号10的氨基酸序列具有60%以上序列同源性的氨基酸序列，且在与含有序列号8的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质。
3.—种核酸，其对权利要求1所述的蛋白质进行编码。
4.如权利要求3所述的核酸，其从由以下所构成的组中选择(a)含有序列号7的核苷酸序列的核酸；(b)与含有序列号7的核苷酸序列的核酸在严格的条件下进行杂交，且对在与含有序列号10的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质进行编码的核酸。
5.一种核酸，其对权利要求2所述的蛋白质进行编码。
6.如权利要求5所述的核酸，其从由以下所构成的组中选择(a)含有序列号9的核苷酸序列的核酸；(b)与含有序列号9的核苷酸序列的核酸在严格的条件下进行杂交，且对在与含有序列号8的氨基酸序列的蛋白质组合时具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质进行编码的核酸。
7.一种硒酸的还原方法，其中，包括使宿主细胞表达权利要求1所述的蛋白质及权利要求2所述的蛋白质的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其中，通过将权利要求3所述的核酸及权利要求4所述的核酸导入宿主细胞，来进行权利要求1所述的蛋白质及权利要求2所述的蛋白质的表达。
9.如权利要求7所述的方法，其中，还包括使宿主细胞表达含有序列号2的氨基酸序列的蛋白质、含有序列号4的氨基酸序列的蛋白质及含有序列号6的氨基酸序列的蛋白质。
全文摘要
通过本发明，提供具有增强硒酸还原活性的能力的蛋白质、对其进行编码的基因、使用它们的硒酸的还原方法。
文档编号C12P3/00GK102245768SQ20098015009
公开日2011年11月16日 申请日期2009年10月5日 优先权日2008年12月19日
发明者山下光雄, 池道彦 申请人:学校法人芝浦工业大学