专利名称：从α-酮酸生物合成双官能烷烃的制作方法
技术领域：
本发明各方面涉及在宿主细胞中生产双官能烷烃的方法。具体地，本发明的多个方面描述了与在宿主细胞中从碳水化合物原料生产双官能烷烃有关的基因组件。更具体地，本发明的多个方面描述了用于经由2-酮庚二酸生产己二酸、氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺的代谢途径。
背景技术：
原油是用于合成重要化学品和聚合物的第一原料。随着原油逐渐枯竭和昂贵，人们逐渐关注在化学品生产中使用活的微生物和它们纯化的酶对可再生原料进行生物加工。 使用生物加工特别是发酵来生产饮料已有几个世纪。在过去的50年中，商业上已经使用微生物来生产诸如抗生素、维生素和氨基酸等化合物。然而，目前用微生物生产工业化学品的普遍性很低。最近已认识到微生物能为常规化学方法难以生产或昂贵生产的某些化合物提供经济的途径。
发明内容
本发明各方面涉及用于从α -酮酸生产α，ω双官能Cn烷烃的代谢工程化的宿主细胞，其中α和ω末端官能团选自-OH、-COOH和-NH3的组，并且其中η是4-8范围内的整数，所述代谢工程化的宿主细胞被包含编码至少一种生物合成途径酶的至少一个核苷酸序列的核酸进行遗传修饰。在一些实施方式中，所述核酸包含编码两个或多个基因产物的核苷酸序列。所述代谢工程化的宿主细胞可以是原核细胞。例如，在一些实施方式中，所述代谢工程化的宿主细胞可以是厌氧型原核细胞。所述代谢工程化的宿主细胞可选自大肠杆菌(E. Coli)、谷氨酸棒杆菌(C. Glutanicum)、黄色短杆菌(B. Flavum)和乳糖发酵短杆菌 (B. Iactofermentum)组成的组。在优选的实施方式中，α-酮酸是α-酮戊二酸，并被转化成α-酮己二酸、α-酮庚二酸或α-酮辛二酸。在优选的实施方式中，宿主细胞包含编码高柠檬酸合酶、高乌头酸酶和同分异构高柠檬酸脱氢酶的核酸序列。高柠檬酸合酶可选自由AksA、NifV, hcs和 Lys20/21组成的组。高乌头酸酶可选自由AksD/E、LysT/U、Lys4, 3-异丙基苹果酸脱水酶大/小亚单位及其同源物组成的组。所述同分异构高柠檬酸脱氢酶可选自由AksF、Hicdh、 Lysl2，2-氧代辛二酸合酶、3-异丙基苹果酸脱水酶及其同源物组成的组。在优选的实施方式中，所述α，ω双官能Cn烷烃具有6个碳原子，并且选自由氨基己酸、己二酸、六亚甲基二胺、6-羟基六胺、1，6-己二醇、6-氨基己醛、6-氨基己醇和6-羟基己酸组成的组。本发明的方面涉及用于从α-酮庚二酸生产己二酸的代谢工程化宿主细胞，所述宿主细胞还包含编码脱羧酶和醛脱氢酶的核酸。在一些实施方式中，所述脱羧酶是2-酮脱羧酶，并且催化α-酮庚二酸向己二酸半醛的转化；所述醛脱氢酶催化己二酸半醛向己二酸的转化。所述2-酮脱羧酶可选自由2-酮戊二酸脱羧酶(kgd)、2_酮异戊酸脱羧酶(kivD)、促转氨的氨基酸脱羧酶(AR010)、苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)、2-酮精氨酸脱羧酶 (arul)、膦酰基丙酮酸脱羧酶(foM)、丙酮酸脱羧酶同工酶(PDC6、PDC1)、丙酮酸脱羧酶同工酶2$005、？0(1、？006、41~010、灯州)、吲哚丙酮酸脱羧酶(ipdC及其同源物组成的组。在一些实施方式中，所述脱羧酶与2-酮戊二酸脱羧酶(kgd)、2-酮异戊酸脱羧酶(kivD)、促转氨的氨基酸脱羧酶(AR010)、苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)、2-酮精氨酸脱羧酶(arul)、膦酰基丙酮酸脱羧酶(fom2)、丙酮酸脱羧酶同工酶$006、？0(1)、丙酮酸脱羧酶同工酶2( 0〇5、 PDC1、PDC6、Arol(KKivD)、吲哚丙酮酸脱羧酶(ipdC)及及其同源物具有至少30%同一性。 在优选的实施方式中，所述醛脱氢酶是6-氧代己酸脱氢酶(ChnE)及其同源物。在其他优选实施方式中，所述醛脱氢酶与6-氧代己酸脱氢酶(ChnE)具有至少30%同一性。本发明的方面涉及用于从α-酮庚二酸生产氨基己酸的代谢工程化宿主细胞，所述宿主细胞还包含编码氨基转移酶和脱羧酶的核酸。在一些实施方式中，所述氨基转移酶催化α -酮庚二酸向2-氨基庚二酸的转化；所述脱氢酶催化2-氨基庚二酸向氨基己酸的转化。所述氨基转移酶可选自由α -氨基己二酸氨基转移酶-1 (AADAT)、氨基己二酸氨基转移酶(LysN)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddb和dapdh)及其同源物组成的组。在一些实施方案中，脱羧酶是谷氨酸脱羧酶。在一些实施方式中，谷氨酸脱羧酶由选自Gad6/7、GadA, GadB 和IysA的组的基因或片段编码。在一些实施方式中，所述脱羧酶催化α-酮庚二酸向己二酸半醛的转化；所述氨基转移酶催化己二酸半醛向氨基己酸的转化。所述酮脱羧酶可选自由2-酮戊二酸脱羧酶(kgd)、2_酮异戊酸脱羧酶(kivD)、促转氨的氨基酸脱羧酶(AR010)、 苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)、2-酮精氨酸脱羧酶(arul)、膦酰基丙酮酸脱羧酶(fom2)、丙酮酸脱羧酶同工酶$006、？0(1)、丙酮酸脱羧酶同工酶2( 005、？0(1、？006、六1~010、灯州)、吲哚丙酮酸脱羧酶(ipdC)及其同源物组成的组。所述氨基转移酶可选自由GABA转氨酶、Lys6 脱氢酶、鸟氨酸-含氧酸转氨酶、赖氨酸氨基转移酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、酵母氨酸脱氢酶(LYS9和LYS1)或其任意同源蛋白组成的组。本发明的方面涉及用于从氨基己酸生产六亚甲基二胺的代谢工程化宿主细胞，所述宿主细胞包含编码醛脱氢酶和氨基转移酶的核酸。在一些实施方式中，所述醛脱氢酶催化氨基己酸向6-氨基己醛的转化；所述氨基转移酶催化6-氨基己醛向6-己二胺的转化。 在优选的实施方式中，所述醛脱氢酶是ALDH酶(EC 1. 2. 1_)。在一些实施方式中，所述氨基转移酶可选自由α-氨基己二酸氨基转移酶-I(AAADAT)、氨基己二酸氨基转移酶(LysN)、 二氨基庚二酸脱氢酶(ddb和dapdh)及其同源蛋白组成的组。本发明的方面涉及用于从α-酮庚二酸生产六亚甲基二胺的代谢工程化宿主细胞，所述宿主细胞包含编码氨基转移酶、还原酶、脱氢酶和脱羧酶的核酸。在一些实施方式中，所述氨基转移酶催化α -酮庚二酸向2-氨基庚二酸的转化；所述还原酶催化2-氨基庚二酸向2-氨基-7-氧代庚酸的转化，所述脱氢酶催化2-氨基-7-氧代庚酸向2，7- 二氨基庚酸的转化，且所述脱羧酶催化2，7- 二氨基庚酸向六亚甲基二胺的转化。所述氨基转移酶可选自由α-氨基己二酸氨基转移酶-I(AADAT)、氨基己二酸氨基转移酶(LysN)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddb和dapdh)及其变体组成的组。在一些实施方式中，所述还原酶是氨基己二酸还原酶或其同源物。在一些实施方式中，所述氨基己二酸还原酶由Sc-Lys2编码。在一些实施方式中，所述脱氢酶是酵母氨酸脱氢酶或其同源物，并且由s9或k-Lys 1或
8其变体编码。所述脱羧酶可选自由赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶及其变体组成的组。本发明的一些方面涉及用于从α-酮庚二酸生产6-羟基己酸的代谢工程化宿主细胞，所述宿主细胞包含编码醇脱氢酶的核酸。本发明的方面涉及用于从6-羟基己酸生产 1,6-己二醇的代谢工程化宿主细胞，所述宿主细胞包含编码醇脱氢酶或醛脱氢酶的核酸。 所述醇脱氢酶可选自6-羟基己酸脱氢酶、丁醇脱氢酶、ADHIV脱氢酶、丙二醇脱氢酶、ADH6 及其同源物。本发明的方面涉及用于从α-酮戊二酸生产α ω -双官能Cn烷烃的方法，其中α 和ω末端官能团选自-0H、-C00H和-NH3基团，其中η是4-7范围内的整数，所述方法包含在足以生产α，ω-双官能Cn烷烃的条件下培养所述宿主细胞，并分离α，ω-双官能Cn 烷烃。在一些方面，本发明涉及包含一个或多个外源核酸序列的宿主细胞，所述外源核酸序列编码选自高柠檬酸合酶(EC 2. 3. 3.-)、高乌头酸酶(EC 2.3.3. 14)、同分异构高柠檬酸脱氢酶(EC 1. 1. 1.-)及其组合的至少一个多肽。在一些实施方式中，代谢工程化的宿主细胞从α-酮戊二酸生产α-酮己二酸、α-酮庚二酸、α -酮辛二酸或其组合。在一些方面，本发明涉及包含一个或多个外源核酸序列的宿主细胞，所述外源核酸序列编码选自 α -酮酸脱羧酶(EC 4. 1. 1.-)和脱氢酶(EC 1. 1. 1.-)及其组合的至少一个多肽。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞生产Cn 二羧酸，其中η是4-7范围中的整数。例如所述工程化宿主细胞生产己二酸。在其他实施方式中，所述工程化宿主细胞生产Cn羟基羧酸，其中η是4-7范围中的整数。例如所述工程化宿主细胞生产6-羟基己酸。在另一些实施方式中，所述工程化宿主细胞生产Cn烷二醇，其中η是4-7范围中的整数，例如1，6_己二醇。在本发明的一些方面，本发明涉及从α-酮戊二酸生产α-酮己二酸、α-酮庚二酸、α-酮辛二酸或其组合的工程化宿主细胞，其包含编码选自α-酮酸脱羧酶(EC 4. 1. 1.-)、氨基转移酶(EC 1. 4. 1.-)、氨基转移酶(EC 2. 6. 1.-)及其组合的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列。在优选的实施方式中，所述工程化宿主细胞生产氨基己酸。 在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞还进一步包括一个或多个编码选自醛脱氢酶(EC 1.2. 1.3)的至少一个多肽的外源核酸序列，并且生产Cn氨基醛或Cn 二氨基烷烃，其中η是 4-7范围内的整数。例如，所述工程化宿主细胞生产六亚甲基二胺或6-羟基六胺。在一些方面，所述工程化宿主细胞包含一个或多个外源核酸序列，所述外源核酸序列编码选自氨基己二酸转移酶(EC 2. 6. 1. 39)、二氨基庚二酸脱氢酶(EC 1. 4. 1. 16)、谷氨酸脱羧酶(EC 4. 1. 1.-)及其组合的至少一个多肽。在一些实施方式中，所述宿主细胞生产Cn氨基-羧酸，其中η是4-7范围中的整数。例如所述工程化宿主细胞生产氨基己酸。本发明的一些方面涉及从α -酮酸生产α，ω -双官能Cn烷烃的工程化宿主细胞， 其包含编码选自α-氨基己二酸-氨基转移酶(EC 2.6. 1.39)、二氨基庚二酸脱氢酶(EC 1.4. 1. 16)、氨基己二酸还原酶(EC 1.2. 1.31)、酵母氨酸脱氢酶(EC 1. 5. 1.-)、赖氨酸脱羧酶(EC 4. 1. 1. 18)、鸟氨酸脱羧酶(EC4. 1. 1. 17)及其组合的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞生产Cn氨基醛或Cn 二氨基烷烃， 其中η是4-7范围中的整数。例如所述工程化宿主细胞生产六亚甲基二胺。在本发明的一些方面，所述工程化宿主细胞还包含一个或多个外源核酸序列，所述外源核酸序列编码 3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1. 1. 1. 100)、脂肪酸合酶(EC 2.3. 1.-)、脱水酶(EC 4.2. 1.59)、3_羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2. 1.59)、烯酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)及其组合的至少一个多肽。在一些优选实施方式中，所述工程化宿主细胞生产Cn 二羧酸，其中η是5-8范围中的整数。例如所述工程化宿主细胞生产己二酸。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞还包括编码选自醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列，并且生产Cn羟基羧酸，其中η是5-8范围内的整数，例如，6-羟基己酸。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞生产Cn烷二醇，其中η是5-7范围中的整数，例如1，6-己二醇。本发明的一些方面涉及从α-酮酸生产α，ω -双官能Cn烷烃的工程化宿主细胞，其包含编码选自α-氨基己二酸-氨基转移酶(EC2.6.1.39)、二氨基庚二酸脱氢酶(EC 1. 4. 1. 16)、氨基己二酸还原酶(EC 1. 2. 1. 31)、酵母氨酸脱氢酶(EC1. 5. 1.-)、赖氨酸脱羧酶(EC 4. 1. 1. 18)、鸟氨酸脱羧酶(EC4. 1. 1. 17)及其组合的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列，选自3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1.1. 1.100)、脂肪酸合酶(EC 2.3. 1.-)、脱水酶(EC 4.2. 1.59)、3_羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶 (EC 4. 2. 1. 59)、烯酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1. 3. 1. 9)及其组合的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列，选自醛脱氢酶的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列，和编码选自氨基转移酶(EC 1. 4. 1.-)和氨基转移酶(EC 2. 6. 1.-)的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞生产Cn氨基羧酸，其中η是5-8范围中的整数，例如氨基己酸。在一些方面，本发明涉及包含一个或多个外源核酸序列的宿主细胞，所述外源核酸序列编码选自醛脱氢酶(EC 1.2. 1.3)、氨基转移酶(EC
1.4. 1.-)和氨基转移酶(EC 2. 6. 1.-)及其组合的至少一个多肽。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞生产1，η- 二氨基烷烃，其中η是5-8范围中的整数，例如六亚甲基二胺。 在其他实施方式中，所述工程化宿主细胞生产η-氨基醇，其中η是5-8范围中的整数，例如 6-氨基己醇。本发明的一些方面涉及工程化宿主细胞，其包含编码选自氨基转移酶(EC
2.6. 1. 7)、醛脱氢酶(EC 1. 2. 1. 3)、谷氨酸半醛变位酶(EQ5.4.3.8)、3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1.1.1.100)、脂肪酸合酶(Ε 2.3.1.-)、脱水酶 (EC4.2.1.59),3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4. 2.1. 59)、烯酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1. 3. 1. 9)及其组合的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞生产η-氨基羧酸，其中η是5-8范围中的整数，例如氨基己酸。本发明的一些方面涉及用于从α-酮戊二酸生产α，ω -双官能Cn烷烃的方法， 其中α和ω末端官能团选自-OH、-COOH和-NH3基团，其中η是5-8范围中的整数，所述方法包含在足以生产α，ω-双官能Cn烷烃的条件下培养所述宿主细胞，并分离α，ω-双官能Cn烷烃。
参考形成本申请部分的具体实施方式
和附图可更充分地理解本发明。图1显示了己二酸的生物合成途径。通过1的步骤a描述了来自詹氏甲烷球菌 (Methanococcus jannaschii)的辅酶B生物合成途径的2_酮延长途径。标记步骤a、b、c、d、e、f、g、h、m和η代表下面描述的底物向产物的转化。图2代表用于从α -酮酸Cn开始生物生产双官能烷烃C(n_D的流程图,图3代表用于从α -酮庚二酸开始生物生产双官能己烷的流程图。图4代表用于从α -酮酸Cn开始生物生产双官能烷烃Cn的流程图。图5代表用于从α -酮己二酸开始生物生产双官能己烷的流程图。
具体实施例方式本说明书中使用的以下术语具有下文所述的含义。除非另有说明，本文使用的所有科技术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。除非文中清楚指明，否则单数形式(“a，” "an, ”和“the”)包括复数涵义。所使用的术语“包含”(“comprise”和“comprising”)为开放式的包括，是指还可包括其他元素。所使用的术语“包括”是指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可相互交
换使用。本说明书中提到的所有公开均通过引用并入本文。本文讨论的公开仅用于提供其在本发明申请日之前的公开。本文中不应有任何内容被解释为承认本发明没有依靠在先发明而先于此公开的资格。本发明一方面提供了以快速、便宜且环境响应的方式生产目标有机脂肪族化合物的方法和材料。因此，本发明满足了多种商业和工业需要。术语“有机分子”是指，例如主要由碳和氢构成的任何分子，例如烷烃。目标有机化合物，例如双官能烷烃、二醇、二羧酸等可用于合成塑料、尼龙和通常原子石油和烃的其他产物。本发明的一方面涉及双官能η-烷烃的合成，其中烃链Cn源自烃链Cn或Cn+Ι，其中η是从约1至约8的数，例如从约2至约 5，或从约3至约4。在优选的实施方式中，所述双官能η-烷烃源自α-(η+1)或η酮酸。本发明的一方面涉及在微生物中生产目标双官能烷烃，并且提供了在微生物中从碳水化合物源生产双官能烷烃的方法。本文使用的“双官能烷烃”是指具有两个官能团的烷烃。术语“官能团”是指，例如原子的排列方式决定了该基团以及与其相连分子的化学性质的基团。官能团的实例包括卤素原子，羟基(-0Η)、羧酸基(-C00H)和氨基(-ΝΗ2)等。“醇” 是指，例如其中一个或多个氢原子被-OH基团取代的烷基部分。术语“伯醇”是指，例如-OH 与末端或链末端碳原子结合的醇，例如1- 丁醇、1-己醇等。术语“仲醇”是指，例如-OH与结合一个氢原子和两个其他碳原子的碳原子结合的醇，例如2- 丁醇、2-己醇等。术语“叔醇”是指，例如-OH与结合三个其他碳原子的碳原子结合的醇，例如甲基丙醇(叔丁醇)等。 “氨基”是指，例如其中一个或多个氢原子被-NH2基团取代的烷基部分。“羰基化合物”是指，例如包含羰基C = O的有机化合物，例如具有通式RCOH的醛；具有通式RCOR'的酮；具有通式RCOOH的羧酸；和具有通式RCOOH的酯。所述方法引入了能够生产以下目标双官能烷烃中至少一种的微生物，特别是己酸、氨基己酸、HMD、6-羟基己酸。其他目标双官能烷烃包括1，3_丙二醇、丙三醇、丙烯酸、 尸胺、3-羟基丙酸、五亚甲基二胺、马来酸、琥珀酸、己二酸、癸二酸、戊二酸和辛二酸等。现已描述了多个化学合成途径，例如用于己酸及其中间产物，例如粘康酸和己二酸半醛；用于己内酰胺及其中间产物，例如6-氨基己酸；用于己烷，1，6 二氨基己烷或己烷亚甲基二胺；用于3-羟基丙酸及其中间产物，例如丙二酸半醛，但仅公开了用于这些有机化学品中一部分的少数生物途径。因此，本发明的方面提供了用于从可持续性给料生产双官能烷烃的工程化代谢途径、分离核酸或工程化核酸、多肽或工程化多肽、宿主细胞或基因工程化宿主细胞，方法和材料。适合作为起始点的碳源包括碳水化合物和合成的中间产物。细胞能够代谢的碳水化合物的实例包括糖、右旋糖、甘油三酸酯和脂肪酸。来自代谢途径的中间产物， 例如丙酮酸、草酰乙酸、2-酮戊二酸也可用作起始点。本发明的方面涉及工程化多肽和编码对天然或非天然底物具有活性或改进活性，或具有宽底物特异性(例如无差别催化，例如无差别底物)的酶的多核苷酸。在本文中可交换使用的术语“多肽”和属于“蛋白”和“肽” 是指氨基酸的多聚物，包括，例如基因产物、天然存在的蛋白、同源物、直向同源物、旁系同源物、片段以及上述的等效物、变体和类似物。属于“具有酶活性的多肽”是指催化其他物质的化学反应，而其本身在反应完成时不被破坏或改变的任何多肽。具有酶活性的多肽通常催化从一种或多种底物形成一种或多种产物。在本发明的一些方面，一些酶的催化无差别性可以与蛋白工程化组合，或者可用于新的代谢途径和生物合成应用。在一些实施方式中， 可修饰现有的酶以用于有机生物合成。在一些优选的实施方式中，参与目标双官能η-烷烃生产的酶包括但不限于2氨基-脱羧酶、2-酮脱羧酶、末端-氨基转移酶、2-氨基转移酶、 醇脱氢酶、醛脱氢酶、氨基-醛脱氢酶、脱氢酶和脱水酶。在一些实施方式中，可改变酶的反应机制以催化新反应、改变、拓展或改进底物特异性。应理解，如果酶结果(例如结晶结果)是已知的，则可通过合理的再设计修饰酶的性质(参见美国专利申请US20060160138、 US20080064610和US20080287320，其通过引用全文并入本文)。酶性质的修饰或改进可来自于向多肽链中引入修饰，其可有效干扰酶的结构-功能和/或与其他分子的相互作用 (例如底物和非天然底物)。本领域已知多肽的一些区域可能对酶活性至关重要。例如，对参与催化的和/或底物结合域中氨基酸组成的小干扰将对酶功能产生显著的影响。一些氨基酸残基可位于对于维持酶的二级或三级结构重要的位置，并因此在被修饰时产生显著变化的酶性质。在一些实施方式中，潜在的途径组分是上述任一种的变体。此类变体可通过随机突变产生，或通过合理设计产生以生产具有例如改变的底物特异性、增加的酶活性、较高的稳定性等酶活性。因此，在一些实施方式中，对参照母本酶进行的用于产生具有期望性质的修饰的数量可包括一个或多个氨基酸、2个或更多氨基酸、5个或更多氨基酸、10个或更多氨基酸，或20个或更多氨基酸，至氨基酸总数的10%、至氨基酸总数的20%、至氨基酸总数的30%、至构成所述参照酶的氨基酸总数的40%或至构成所述参照酶的氨基酸总数的 50%。本领域技术人员应理解，本文例示的工程化途径的描述涉及但不限于物种、特异基因，并且包括核酸或氨基酸序列的同源物或直向同源物。在使用本领域已知的方法比对时，同源物或直向同源物序列具有相对高度的序列同一性/类似性。本发明的一方面涉及新微生物或“基因修饰的”微生物或宿主细胞，其经工程化以具有新代谢能力或新代谢途径。本文使用的属于“基因修饰的”微生物是指具有通常不见于参照物种的野生型菌株中的至少一个基因变化。在一些实施方式中，基因工程化的微生物经工程化以表达或过表达位于代谢途径关键点和/或阻断其他酶合成的至少一个具体酶， 以克服或避开代谢瓶颈。术语“代谢途径”是指两个或更多连续的酶反应，其中一个酶反应的产物称为后一个酶反应的底物。在代谢途径的每一步，中间产物化合物形成或被用作后
12一步的底物。这些化合物可被称作“代谢中间产物”。每一步的产物也被称作“代谢物”。本发明的一方面提供了用于涉及和制造工程化代谢途径的方法。在本发明的一些方面，可在一个或多个宿主细胞或目标微生物中进行从一个或多个可得且可持续底物制备目标产物的可选途径。应理解，用于制造双官能烷烃的工程化途径可涉及多个酶，因此， 通过该途径的流可能不是最适宜用于生产目标产物。因此，在本发明的一些方面，任选通过调整途径酶相对于另一种途径酶的活性水平来平衡流。在整个申请中提供了此类调整的实例。本发明一方面提供了基因修饰的宿主细胞或微生物，以及使用所述基因修饰的宿主细胞或微生物从α -酮酸生产双官能η-烷烃的方法。本文使用的宿主细胞是指体内或体外的真核细胞，原核细胞，或来自作为单细胞实体的多细胞生物的细胞(例如细胞系)。宿主细胞可以为原核细胞(例如细菌，如大肠杆菌(E. Coli)或枯草杆菌(B. subtilis))或真核细胞(例如，酵母、哺乳动物或昆虫细胞)。例如，宿主细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌、枯草杆菌、分支杆菌属(Mycobacterium spp·)、结核分枝杆菌(M. tuberculosis)或其他适合的细菌细胞)、古核生物(例如，詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)或海沼甲烷球菌(Methanococcus Maripaludis)或其他适合的古核细胞)、酵母细胞(例如，酵母属(Saccharomyces)物种，例如，酿酒酵母(S. cerevisiae)、裂殖酵母(S. pombe)、毕赤酵母属(Picchia)物种、念珠菌属(Candida)物种，例如，白色念珠菌(C. albicans)或其他适合的酵母物种)。原核和真核宿主细胞可以是，或经过基因修饰(也称作“重组宿主细胞”、 “代谢工程化细胞”或“基因工程化细胞”)，并用作核酸的受体，例如包含编码一个或多个生物合成或工程化途径基因产物的核苷酸序列的表达载体。原核和真核宿主细胞还表示通过核酸进行基因工程化的初始细胞的后裔。在一些实施方式中，可根据其代谢性质选择宿主细胞。例如，如果选择或筛选涉及具体代谢途径，使用具有相关途径的宿主细胞是有帮助的。此宿主细胞可具有某些生理适应性，以允许其具有或输入或输出一种或多种中间产物或途径的产物。然而，在其他实施方式中，可选自不表达与目标具体途径相关的酶的宿主细胞，以能够使用适合的基因元件设置而不依赖于宿主细胞提供一个或多个缺失的步骤，从而鉴定出该途径所需的所有组分。在一些实施方式中，对厌氧细菌生物进行代谢工程化。本文使用的厌氧生物是生长不需要氧(即厌氧条件)的任何生物。有利地，细菌细胞可以是大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌(C. glutamicum)、黄色短杆菌(B. Flavum)或乳糖发酵短杆菌(B. Iactofermentum)细胞；目前这些菌株在工业上应用以使用细菌发酵法制造氨基化合物。例如，谷氨酸棒杆菌 (C. Glutanicum)广泛用于生产氨基酸(例如，L-谷氨酸，L-赖氨酸，参见Eggleging L et al. ,2005, Handbook for Corynebacterium glutanicum. Boca Raton, USA CRC Press)本发明的代谢工程化细胞是通过使用编码参与工程化代谢途径的酶的至少一个核苷酸序列转化宿主细胞而制成的。本文使用的术语“核苷酸序列”、“核酸序列”和“基因构建体”可互相交换使用，并且是指单链或双链的RNA或DNA聚合物，其任选包含合成、非天然或改变的核苷酸碱基。核苷酸系列可包含cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA的一个或多个片段。在优选的实施方式中，核苷酸序列经过密码子优化以反应宿主细胞的典型密码子使用，而不改变通过该核苷酸序列编码的多肽。在某些实施方式中，属于“密码子优化”或 “密码子优化的”是指修饰核酸序列的密码子含量，而不修饰通过该核酸编码的多肽序列，从而增强具体宿主细胞中的表达。在某些实施方式中，该属于是指包括修饰核酸序列的密码子含量，作为控制多肽表达水平的方式(例如，增加或降低表达水平)。因此，本发明的一方面包括编码参与工程化代谢途径的酶的核酸序列。在一些实施方式中，代谢工程化细胞可表达具有实施下述步骤所必须的酶活性的一个或多个多肽。例如，具体细胞可包含一个、两个、三个、四个、五个或多于五个的核酸序列，每个核酸序列编码实施α-酮酸向双官能烷烃转化所必须的多肽。或者，单个核酸分析可编码一个或多于一个的多肽。例如，单个核酸分析可包含编码两个、三个、四个，乃至五个不同多肽的核酸序列。用于本文所述发明的核酸序列可以从多种途径获得，例如cDNA序列的扩增、DNA文库、从头合成、基因组区段切除。随后，可使用标准分子生物学和/或重组DNA技术修饰由此来源获得的序列，从而产生具有期望修饰的核酸序列。核酸序列的修饰的示例方法包括，例如定点突变、PCR突变、删除、插入、取代、使用限制性酶交换序列部分，任选与连接、同源重组、位点特异性重组或其各种组合进行组合。在其他实施方式中，核酸序列可以是合成的核酸序列。可以使用美国专利7, 323，320、共同待审申请No. 11/804，996，和美国专利公开Nos. 1006/0160138和 2007/0269870中描述的多种方法生产合成的多核苷酸序列。用于转化细菌、植物和动物细胞的方法是本领域熟知的。常见的细菌转化方法包括电穿孔和化学修饰。在一些实施方式中，基因修饰的宿主细胞经过基因修饰，从而在适合的培养基中进行体外培养时，产生水平在至少0. lg/Ι，至少lg/Ι或至少10g/l的目标产物或中间产物。 应理解，可通过多种方式控制基因修饰的宿主细胞产生的目标产物或其代谢中间产物的水平。在一些实施方式中，通过编码参与工程化途径的一种或多种酶的核酸序列的拷贝数量控制表达的水平(例如，高拷贝表达载体与中或低拷贝表达载体)。优选使用载体将核酸序列引入细胞。地拷贝表达载体通常提供少于每细胞20个载体拷贝(例如每个细胞1至约5个，5至约10个，10至约15个，15至约20个拷贝的表达载体)。用于原核细胞的(例如大肠杆菌)适合的低拷贝表达载体包括但不限pAYC184、pBeloBacll、pBR332、pBAD33、 pBBRlMCS及其衍生物、pSC101、SuperCOS (粘粒)和pTO15(粘粒)。中拷贝数量的表达载体通常提供每细胞约20至约50个表达载体拷贝，或每细胞约20至80个表达载体拷贝。用于原核细胞的(例如大肠杆菌)适合的中拷贝表达载体包括但不限pTrc99A，pBADM和包含ColEl复制起点及其衍生物的载体。高拷贝表达载体通常提供每细胞约80至约200或更多的表达载体拷贝。用于原核细胞的(例如大肠杆菌)适合的高拷贝表达载体包括但不限 pUC、PCV1、pBluescript、pGEM 和 pTZ 载体。本发明的一方面提供了表达编码参与工程化途径的多肽的核酸或其子序列的表达盒。在一些实施方式中，所述表达盒可包含操作性地连接到转录元件(例如启动子)和终止子的核酸。本文使用的术语“盒”是指如果将具体基因插入以操作性地连接到存在于所述核苷酸序列中的一个或多个调控序列，即能够给表达所述基因的核苷酸序列。因此，例如表达盒可包含期望在宿主细胞中表达的杂合基因。在一些实施方式中，可通过已知的重组技术向载体中引入一个或多个表达盒。启动子是启动并控制RNA聚合酶转录期望核酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子可以是诱导型。在一些实施方案中，启动子可以是组成型。用于原核宿主生物的适合的启动子的非限定性实例包括噬菌体T7RNA聚合酶启动子、trp启动子、Iac操作子启动子等。用于原核宿主生物的适合的强启动子的非限定性实例包括lacUV5启动子3537，1^(，1^(3等。用于真核宿主生物的适合的启动子的非限定性实例包括CMV立即早期启动子、HSV早期或晚期启动子、胸腺嘧啶激酶启动子等。终止控制区也可源自原产于优选宿主的多种基因。在一些实施方式中，工程化途径的第一酶可以受到第一启动子的控制，而工程化途径的第二酶受到第二启动子的控制，其中所述第一和第二启动子具有不同的强度。例如， 第一启动子可强于第二启动子，或者第二启动子可强于第一启动子。因此，通过增加第一酶的拷贝数量和/或通过提高与第一酶操作性连接的启动子的强度相对于与第二酶操作性连接的启动子的强度，可提高工程化途径中第一酶的水平相对于第二酶的水平。在一些其他实施方式中，工程化途径的多个酶受相同启动子的控制。在其他实施方式中，改变核糖体结合位点影响途径中不同酶的相对翻译和表达。改变核糖体结合位点能够单独使用，以控制途径中酶的相对表达，或者可以与同样影响基因表达水平的上述启动子修饰和密码子优化一起使用。在示例性实施方式中，潜在途径酶的表达可依赖于反应混合物中途径酶作用底物的存在。例如，可通过培养基中A的存在诱导催化A向B转化的酶的表达。可通过添加导致诱导的化合物，或通过所述化合物在生物合成途径过程中的天然装配(例如，诱导物可以是生物合成过程中产生的中间产物，以产生期望的产物)诱导此途径酶的表达。在一些实施方式中，可使用计算机参与的设计技术以产生用于产生目标有机分子的可选途径。在一些实施方式中，可使用包含有关基因组及其连接的信息的数据库来设计新的代谢途径。数据库的实例为MetaCyc (代谢途径和酶的数据库)、明尼苏达大学生物催化/生物降解数据库(微生物催化反应和有机化学化合物的生物降解途径的数据库)、 LGAND (提供有关代谢物和其他化学化合物、体现代谢和其他反应的底物-产物相关性的信息，以及有关酶分子信息的复合数据库)。途径成分数据库还可包含预期的、假定的或未知功能的成分。其还可包含具有限定功能的假组分，其可具有不定的组成。在一些实施方式中，程序可设计位于公共域(例如，未被专利权覆盖和/或需要执照费的域)中调控和/或功能元件的组合。可产生可自由获得的基因元件的数据库和/或将其用作可组合的核酸序列的来源以产生可选途径。可设计、组装和/或测试包含已知的功能和/或调控元件(例如来自不同物种)的不同组合的可选途径。可使用包括酶元件区中变量的文库以确定不同类型的酶或相同酶的不同变体的相对作用。可使用包括酶元件区中变量的文库以确定一系列基因中的最优表达水平或调控水平。可组装编码不同途径的核酸。在一些实施方式中，可通过使用适合的组装核酸转化宿主细胞或生物，并分析工程化生物的性质，从而在体内测试不同工程化途径的功能性质。在一些实施方式中，可通过分离由组装核酸表达的成分，并在体外系统中测试成分的适合组合，从而在体外测试不同工程化途径的功能性质。I.用于生产2-酮酸(C5至C8)的工程化辅酶B合成途径本发明的多个方面提供了经由辅酶B生物合成中α-酮酸链延长反应生产双官能正烷烃的新型工程化途径(参见图1)。如本文所用，α -酮酸或2-氧代酸或2-酮酸可互换使用，且设计包含靠近羧酸基团的酮官能团的有机酸。本文所用的辅酶B生物合成中的 α -酮酸链延长反应(也称为2-氧代酸延长)是指将α -酮戊二酸(C5链)和乙酰辅酶A 转化为α-酮辛二酸(C8链)、辅酶B的前体(7-巯基庚酰苏氨酸磷酸)和可能的生物素的
15生物合成途径。许多生物体可经由草酰乙酸合成α-酮戊二酸，此草酰乙酸经由酶PEP羧化酶从PEP产生或经由生物素依赖的酶丙酮酸羧化酶从丙酮酸产生。α -酮戊二酸是三羧酸循环(Krebs cycle)中重要的中间产物，且起到α -酮酸延长途径中原料的作用。α-酮酸延长辅酶B途径包括催化以下步骤的酶(1) α -酮戊二酸和乙酰辅酶A缩合形成高柠檬酸(通过高柠檬酸合成酶如AksA、 NifV, Hcs, Lys 20/21 的作用)(2)通过起到中间产物作用的顺式高乌头酸的脱水和水合变为(2R，3S)高异柠檬酸(通过高乌头酸酶如AskD/E、LysT/U、Lys4, 3-异丙基苹果酸脱水酶的作用)(3) (2R,3S)高异柠檬酸氧化脱羧为α -酮己二酸(通过同分异构高柠檬酸脱氢酶如AksF、Hicdh、Lysl2, 2-氧代辛二酸合成酶、3-异丙基苹果酸脱水酶的作用)。所得的α -酮己二酸(C6链)随后经历两个连续的α _酮酸链延长反应，以产生作为中间产物的α-酮庚二酸和α-酮辛二酸。由此一系列反应产生的α-酮辛二酸随后经历非氧化脱羧作用，以形成7-氧代庚酸(辅酶B的前体)。α -酮酸延长途径的一个特征实例为詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii) 的辅酶B生物合成途径。在此途径中，图1中有三种酶催化步骤a-1。AksA(催化步骤a、e 和i)是高柠檬酸合酶；AksD/E (催化步骤b、c、f、g、j、k)是AksD和AksE的异四聚体，且为高乌头酸酶;AksF (催化步骤d、h和1)是同分异构高柠檬酸脱氢酶。这些酶全部显示出催化反应步骤，且詹氏甲烷球菌AksD/E是目前唯一显示出催化两种水解酶反应的高乌头 SISI (Howell et al. , Biochem. ,1998 ；Howe11 et al. , J.Bacteriol. ，2000 ；Drevland et al. , JBC, 2008).应注意詹氏甲烷球菌是嗜热的产甲烷菌，且全部Aks酶已经在50_60°C 得到表征。在一些实施方式中，可使用来自在37°C繁殖的其它产甲烷菌的Aks同源物。 此类Aks同源物已被鉴定且包括海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis) S2基因 aksA(MMP0153) ,MMP1480.MMP0381 和 aksF(MMP0880)。从α-酮戊二酸(C5)起始的途径具有依赖于延长循环的数目的不同的以下中间产物α -酮己二酸(C6)、α -酮庚二酸(C7)和α -酮辛二酸(C8)。因此，在本发明的一些方面中，依据所需产物的烃链长度(如C4、C5、C6、C7)，可能需要不延长(用于生产双官能丁烷)、仅单次延长循环(如步骤a至d，用于生产双官能戊烷)、两次延长(如步骤a至h， 用于生产双官能己烷)或三次延长(如步骤a至1，用于生产双官能庚烷)。因此，应理解， 根据烃链的长度，可希望最大化2-酮己二酸中间产物或酮庚二酸中间产物的利用率。在一些实施方式中，希望保持步骤a至d且消除步骤e至1，以最大化2-酮己二酸中间产物的利用率。在其它实施方式中，希望保持步骤a至h且消除步骤i至1，以最大化酮庚二酸中间产物的利用率。如上所述，每个延长步骤包括三组酶酰基转移酶或酰基转移酶同源物、高乌头酸酶或高乌头酸酶同源物，和同分异构高柠檬酸脱氢酶或同分异构高柠檬酸脱氢酶同源物。 每个延长步骤的第一次反应由将酰基转化为烷基的酰基转移酶在转移时催化。在一些实施方式中，酰基转移酶是高柠檬酸合酶(EC 2. 3. 3. 14)。催化下列化学反应的高柠檬酸合酶
乙酰辅酶A+ H2O+ 2-酮戊二酸卢(R)-2-羟基丁烷-1，2，4-三羧酸+CoA
产物(R) -2-羟基丁烷-1，2，4-三羧酸也称为高柠檬酸。现已显示一些高柠檬酸合酶如AksA具有宽的底物范围且催化氧代己二酸和氧代庚二酸与乙酰辅酶A的缩合(Howell et al.，1998，Biochemistry, Vol. 37，ppl0108_10117)。本发明的一些方面提供了对酮戊二酸或酮戊二酸和酮己二酸具有底物特异性的高柠檬酸合酶。已知的优选高柠檬酸合酶为 EC编号2. 3. 3. 14。通常，用于选择适合的酶的方法可包括通过检索来自其它生物体的同源物在天然多样性中检索酶，和/或构建和检索人工多样性并选择具有所选酶特异性和活性的变体。候选高柠檬酸合酶、候选高乌头酸酶和候选同分异构高柠檬酸脱氢酶列在表1中。表 权利要求
1.一种用于从α-酮酸生产α，ω双官能Cn烷的代谢工程化宿主细胞，其中α和ω 末端官能团选自-OH、-COOH和-NH3的组，其中η为4至8的整数，其中所述代谢工程化宿主细胞通过包括编码至少一种生物合成途径酶的至少一个核苷酸序列的核酸来进行遗传修饰。
2.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述核酸包括编码两种或更多种基因产物的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述细胞为原核细胞。
4.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述细胞为厌氧型原核细胞。
5.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述细胞选自由大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌组成的组。
6.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述α-酮酸为α-酮戊二酸，且被转化为α -酮己二酸、α -酮庚二酸或α “酮辛二酸。
7.如权利要求6所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞包括编码高柠檬酸合酶、高乌头酸酶和同分异构高柠檬酸脱氢酶的核酸序列。
8.如权利要求7所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述高柠檬酸合酶选自由AksA、 NifV、hcs 和 Lys20/21 组成的组。
9.如权利要求7所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述高乌头酸酶选自由AksD/E、 LysT/U、Lys4, 3_异丙基苹果酸脱水酶大/小亚基和它们的同源物组成的组。
10.如权利要求7所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述同分异构高柠檬酸脱氢酶选自由AksF、HiCdh、Lysl2，2-氧代辛二酸合酶、3-异丙基苹果酸脱氢酶和它们的同源物组成的组。
11.如权利要求7所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述α，ω双官能烷具有6个碳原子，且选自由氨基己酸、己二酸、六亚甲基二胺、6-羟基六胺、1，6-己烷二醇、6-氨基己醛、 6-氨基己醇和6-羟基己酸组成的组。
12.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其用于从α-酮庚二酸生产己二酸，所述宿主细胞进一步包括编码脱羧酶和醛脱氢酶的核酸。
13.如权利要求12所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述脱羧酶为催化α-酮庚二酸向己二酸半醛转化的2-酮脱羧酶和催化己二酸半醛向己二酸转化的醛脱氢酶。
14.如权利要求12所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述2-酮脱羧酶选自2-酮戊二酸脱羧酶(kgd)、2-酮异戊酸脱羧酶(kivD)、促转氨的氨基酸脱羧酶(AR010)、苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)、2-酮精氨酸脱羧酶(arul)、膦酰基丙酮酸脱羧酶(fom2)、丙酮酸脱羧酶同工酶$006、？0(1)、丙酮酸脱羧酶同工酶2( 005、？0(1、？006、41~010、灯州)、吲哚丙酮酸脱羧酶(ipdC)和它们的同源物。
15.如权利要求14所述的代谢工程化宿主细胞，其中与2-酮戊二酸脱羧酶(kgd)、 2-酮异戊酸脱羧酶(kivD)、促转氨的氨基酸脱羧酶(AR010)、苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)、 2-酮精氨酸脱羧酶(arul)、膦酰基丙酮酸脱羧酶(fom2)、丙酮酸脱羧酶同工酶(PDC6、 PDC1)、丙酮酸脱羧酶同工酶2(PDC5、PDCl、PDC6、Aro 10, KivD)、吲哚丙酮酸脱羧酶(ipdC) 和它们的同源物相比，所述脱羧酶具有至少30 %的同一性。
16.如权利要求12所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述醛脱氢酶为6-氧代己酸脱氢酶(ChnE)和它们的同源物。
17.如权利要求12所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述醛脱氢酶与所述6-氧代己酸脱氢酶(ChnE)具有至少30%的同一性。
18.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其用于从α-酮庚二酸生产氨基己酸， 所述宿主细胞进一步包括编码氨基转移酶和脱羧酶的核酸。
19.如权利要求18所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述2-氨基转移酶催化α-酮庚二酸向2-氨基庚二酸的转化，且其中所述脱羧酶催化2-氨基庚二酸向氨基己酸的转化。
20.如权利要求19所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述氨基转移酶选自由α-氨基己二酸氨基转移酶-I(AADAT)、氨基己二酸氨基转移酶(LysN)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddb 和dapdh)和它们的同源物组成的组。
21.如权利要求19所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述脱羧酶为谷氨酸脱羧酶。
22.如权利要求20所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述谷氨酸脱羧酶由选自由 Gad6/7、GadA, GadB和IysA组成的组的基因或基因片段编码。
23.如权利要求18所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述脱羧酶催化α-酮庚二酸向己二酸半醛的转化，且所述氨基转移酶催化己二酸半醛向氨基己酸的转化。
24.如权利要求23所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述酮脱羧酶选自2-酮戊二酸脱羧酶(kgd)、2-酮异戊酸脱羧酶(kivD)、促转氨的氨基酸脱羧酶(AR010)、苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)、2-酮精氨酸脱羧酶(arul)、膦酰基丙酮酸脱羧酶(fom2)、丙酮酸脱羧酶同工酶$006、？0(1)、丙酮酸脱羧酶同工酶2( 005、？0(1、？006、41~010、灯沖)、吲哚丙酮酸脱羧酶(ipdC)和它们的同源物。
25.如权利要求23所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述氨基转移酶选自由GABA转氨酶、Lys6脱氢酶、鸟氨酸-氧代酸转氨酶、赖氨酸氨基转移酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、酵母氨酸脱氢酶(LYS9和LYS1)或它们的任何同源蛋白质组成的组。
26.如权利要求18所述的代谢工程化宿主细胞，其用于从氨基己酸生产六亚甲基二胺，所述宿主细胞进一步包括编码醛脱氢酶和氨基转移酶的核酸。
27.如权利要求沈所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述醛脱氢酶催化氨基己酸向6-氨基己醛的转化，且所述氨基转移酶催化所述6-氨基己醛向6-六亚甲基二胺的转化。
28.如权利要求27所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述醛脱氢酶为ALDH酶(EC 1. 2. 1-)。
29.如权利要求27所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述氨基转移酶选自由α-氨基己二酸氨基转移酶-I(AADAT)、氨基己二酸氨基转移酶(LysN)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddb、 dapdh)和它们的同源蛋白质组成的组。
30.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其用于从α-酮庚二酸生产六亚甲基二胺，所述宿主细胞进一步包括编码氨基转移酶、还原酶、脱氢酶和脱羧酶的核酸。
31.如权利要求30所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述氨基转移酶催化α-酮庚二酸向2-氨基庚二酸的转化，所述还原酶催化2-氨基庚二酸向2-氨基-7-氧代庚酸的转化，所述脱氢酶催化2-氨基-7-氧代庚酸向2，7- 二氨基庚酸的转化，且所述脱羧酶催化2，7-二氨基庚酸向六亚甲基二胺的转化。
32.如权利要求31所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述氨基转移酶选自由α-氨基己二酸氨基转移酶-I(AADAT)、氨基己二酸氨基转移酶(LysN)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddb、 dapdh)和它们的变体组成的组。
33.如权利要求31所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述还原酶为氨基己二酸还原酶或其同源物。
34.如权利要求33所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述氨基己二酸还原酶由 Sc-Lys2 编码。
35.如权利要求31所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述脱氢酶为酵母氨酸脱氢酶或其同源物。
36.如权利要求35所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述酵母氨酸脱氢酶由Sc-Lys9 或义-Lysl或其变体编码。
37.如权利要求30所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述脱羧酶选自由赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和它们的变体组成的组。
38.如权利要求6所述的代谢工程化宿主细胞，其用于从α-酮庚二酸生产6-羟基己酸，所述宿主细胞进一步包括编码醇脱氢酶的核酸。
39.如权利要求38所述的代谢工程化宿主细胞，其用于从6-羟基己酸生产1，6_己烷二醇，所述宿主细胞进一步包括编码醇脱氢酶或醛脱氢酶的核酸。
40.如权利要求38所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述醇脱氢酶选自6-羟基己酸脱氢酶、丁醇脱氢酶、ADHIV脱氢酶、丙二醇氧化还原酶、ADH6和它们的同源物。
41.一种用于从α-酮戊二酸生产α，ω双官能Cn烷的方法，其中α和ω末端官能团选自-OH、-COOH和-NH3的组，其中η为4至7的整数，包括在足以生产α，ω双官能Cn 烷的条件下培养权利要求1的宿主细胞；和分离所述双官能Cn烷。
42.—种工程化宿主细胞，包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自高柠檬酸合酶(EC 2. 3. 3.)、高乌头酸酶(EC 2. 3. 3. 14)、同分异构高柠檬酸脱氢酶(EC 1. 1. 1.-)和它们的组合的至少一种多肽。
43.如权利要求42所述的工程化宿主细胞，所述细胞从α-酮戊二酸生产α-酮己二酸、α-酮庚二酸、α-酮辛二酸或它们的组合。
44.如权利要求43所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述核酸序列编码选自α -酮酸脱羧酶(EC 4. 1. 1.-)和脱氢酶(EC 1. 1. 1.-)和它们的组合的至少一种多肽。
45.如权利要求44所述的工程化宿主细胞，所述细胞生产Cn二羧酸，其中η为4至7 的整数。
46.如权利要求44所述的工程化宿主细胞，所述细胞生产Cn羟基羧酸，其中η为4至 7的整数。
47.如权利要求45所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生己二酸。
48.如权利要求46所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生6-羟基己酸。
49.如权利要求44所述的工程化宿主细胞，所述细胞产生Cn烷二醇，其中η为4至7 的整数。
50.如权利要求49所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生1，6_己烷二醇。
51.如权利要求43所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自α -酮酸脱羧酶(EC 4. 1. 1.-)、氨基转移酶(EC 1. 4. 1.-)、氨基转移酶(EC 2. 6. 1.-)和它们的组合的至少一种多肽。
52.如权利要求51所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生氨基己酸。
53.如权利要求43所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自氨基己二酸转移酶(EC 2. 6. 1. 39)、二氨基庚二酸脱氢酶(EC 1. 4. 1. 16)、 戊二酸脱羧酶(EC4. 1. 1.-)和它们的组合的至少一种多肽。
54.如权利要求53所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生Cn氨基羧酸， 其中η为4至7的整数。
55.如权利要求M所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生氨基己酸。
56.如权利要求51所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自醛脱氢酶(EC 1. 2. 1. 3)的至少一种多肽。
57.如权利要求56所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生Cn氨基醛或Cn二氨基烷，其中η为4至7的整数。
58.如权利要求57所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生六亚甲基二胺。
59.如权利要求57所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生6-羟基六胺。
60.如权利要求43所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列， 所述序列编码选自α-氨基己二酸-氨基转移酶(EC 2.6. 1.39)、二氨基庚二酸脱氢酶 (EC1. 4. 1. 16)、氨基己二酸还原酶(EC 1.2. 1.31)、酵母氨酸脱氢酶(EC 1. 5. 1.-)、赖氨酸脱羧酶(EC 4. 1. 1. 18)、鸟氨酸脱羧酶(EC4. 1. 1. 17)和它们的组合的至少一种多肽。
61.如权利要求60所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生Cn氨基醛或Cn二氨基烷，其中η为4至7的整数。
62.如权利要求60所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生六亚甲基二胺。
63.如权利要求43所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1. 1. 1. 100)、脂肪酸合酶 (EC 2.3. 1.-)、脱水酶(EC 4.2. 1.59)、3_羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4. 2. 1. 59)、烯酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1. 3. 1. 9)和它们的组合的至少一种多肽。
64.如权利要求63所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生Cn二羧酸，其中η 为5至8的整数。
65.如权利要求63所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生己二酸。
66.如权利要求63所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自醛脱氢酶(EC 1. 2. 1. 3)的至少一种多肽。
67.如权利要求66所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生Cn羟基羧酸，其中 η为5至8的整数。
68.如权利要求66所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生Cn烷二醇，其中η 为5至8的整数。
69.如权利要求67所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生6-羟基己酸。
70.如权利要求68所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生1，6_己烷二醇。
71.如权利要求66所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自氨基转移酶(EC 1. 4. 1.-)和氨基转移酶(EC 2. 6. 1.-)的至少一种多肽。
72.如权利要求71所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生Cn氨基羧酸， 其中η为5至8的整数。
73.如权利要求72所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生氨基己酸。
74.如权利要求73所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列， 所述序列编码选自醛脱氢酶(EC 1.2. 1.3)、氨基转移酶(EC 1.4. 1.-)和氨基转移酶(EC 2. 6. 1.-)和它们的组合的至少一种多肽。
75.如权利要求74所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生l，n-二氨基烷，其中η为5至8的整数。
76.如权利要求75所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生六亚甲基二胺。
77.如权利要求74所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生η-氨基醇，其中η 为5至8的整数。
78.如权利要求77所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生6-氨基己醇。
79.如权利要求43所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自氨基转移酶(EC 2.6. 1.7)、醛脱氢酶(EC 1.2. 1.3)、谷氨酸半醛变位酶 (EC 5. 4. 3. 8)、3_氧代酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1. 1. 1. 100)、脂肪酸合酶 (EC 2.3. 1.-)、脱水酶(EC 4.2. 1.59)、3_羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4. 2. 1. 59)、烯酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1. 3. 1. 9)和它们的组合的至少一种多肽。
80.如权利要求79所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生η-氨基羧酸，其中 η为5至8的整数。
81.如权利要求79所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生氨基己酸。
82.一种用于从α-酮戊二酸生产α，ω双官能Cn烷的方法，其中α和ω末端官能团选自-OH、-COOH和-NH3的组，其中η为5至8的整数，包括在足以生产α，ω双官能Cn 烷的条件下培养权利要求42的宿主细胞；和分离所述α，ω双官能Cn烷。
全文摘要
本发明各个方面涉及在宿主细胞中生产双官能烷烃的方法。具体地，本发明的各个方面描述了与在宿主细胞中从碳水化合物原料生产双官能烷烃有关的基因组件。更具体地，本发明的各个方面描述了用于经由2-酮庚二酸生产己二酸、氨基己酸、己内酰胺和六亚甲基二胺的代谢途径。
文档编号C12P7/26GK102317464SQ200980156694
公开日2012年1月11日 申请日期2009年12月14日 优先权日2008年12月12日
发明者布莱恩·M·拜内斯, 约翰·迈克尔·杰雷米亚 申请人:塞莱西翁有限公司