体外微器官及其相关用途的制作方法

专利名称：体外微器官及其相关用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及体外微器官及其相关用途。
背景技术：
在二十世纪五十年代早期完成了真核细胞培养。从那时开始，使用各种广泛的 培养基和明确的补充物，如生长因子和激素，以及不明确的补充物，如血清和其它身体 提取物已经培养了广泛的转化和原代细胞。例如，可通过很多细胞传代如核型双倍体细 胞或无限如建立的细胞系，常规培养由动物皮肤得到的成纤维细胞。然而，上皮细胞具 有与成纤维细胞不同的形态学和增生性能，更难于培养。而且，当上皮细胞和成纤维细 胞在相同培养物中生长，成纤维细胞通常使上皮细胞生长过度。虽然细胞二维生长是制备、观察和研究培养物中的细胞、允许细胞高速度增生 的方便方法，但是它缺乏体内整个组织的细胞-细胞和细胞-基质之间相互作用的特性。为了研究这种功能和形态学相互作用，少数研究者已经探究了使用三维基底 如胶原凝胶(Douglas et al.，(1980) In Vitro 16 306-312 ； Yang et al.，(1979) Proc.Natl. Acad.Sci. ； 76: 3401 ； Yang et al. (1980) Proc.Natl.Acad.Sci.77 2088-2092 ； Yang et al., (1981)Cancer Res.41 1021-1027)；纤维素海绵，单独(Leighton et al.，(1951) J.Natl Cancer Inst. 12 545-561)或胶原包裹的(Leighton et al., (1968) Cancer Res.28 286-296)；明胶海绵，Gelfoam(Sorouretal.，(1975) J.Neurosurg.43 742-749)。为了使上皮细胞以克隆竞争模式生长，已采用了各种培养条件。例如，已在致 命照射成纤维细胞的饲养层上(Rheinhardt etal. (1975) Cell6 331-343)和半合成胶原基质 上(美国专利5,282,859;欧洲专利申请0361957)培养了上皮细胞，尤其是皮肤上皮细胞 (角质细胞)。有些情况下，用于这种细胞生长的培养基可以添加生物提取物，包括垂体 提取物和血清，和生长补充物，如表皮生长因子和胰岛素(Bosseau etal. (1992) J.Dermatol. Sci 3 (2) 111-120 ；美国专利 5,292,655)。已经进行了皮肤在体外生长的很多尝试。这些尝试典型地包括将表皮中的角 质细胞与真皮中的成纤维细胞和脂肪细胞分离开来的步骤。分离之后，通常角质细胞 以允许分层表皮形成的方式生长。然而，这种方式制备的表皮缺乏毛囊和汗腺。而 且，在这种培养中，表皮和真皮之间的天然关系不再保留。已经采取的培养方法包括 角质细胞在无活力的成纤维细胞上生长(Rheinwald etal. (1975) Cell 6 : 331-343)或将角 质细胞放置于合成或由表皮胶原和成纤维细胞的可替换来源得到的胶原和成纤维细胞的 真皮基底上(Sugihara et al. (1991) Cell.Dev.Biol.27 142-146 ； Parenteau et al. (1991) J.Cell Biochem.45(3) 245-251)。然而，有些情况下，不实施角质细胞的分离，整个器官放置 于培养中。体外培养器官的尝试限于在含血清的培养基中培养器官(Li et al. (1991)Proc.
4Natl.Acad.Sci.88 (5) 108-112)。多数现存体外表皮模型缺乏毛囊、汗腺和皮脂腺(对于表皮细胞培养的综述， 见 Coulomb et al. (1992)Pathol.Biol.Paris 40(2) 139-146)。例外的包括 Li et al.((1992) Proc.Natl.Acad.Sci 89 8764-8768)的凝胶支撑的皮肤模型，其中直径&5mm2和2.0mm
厚的皮肤外植块，在含血清的培养基存在下，活力保持几天。除了细胞损害的缺陷外，生物反应器和培养哺乳动物细胞的其它方法提供允许 细胞装配为组织，模拟三维空间形式的完整生物体内真实组织的条件的能力也非常有 限。由于类似原因，传统组织培养方法限制了培养组织表现出认为对哺乳动物细胞分化 以及研究和制药兴趣的专门生物活性分子分泌很关键的功能高度专门化或分化状态的能 力。与微生物不同，较高级生物如哺乳动物的细胞自身形成高级的多细胞组织。尽管不 知道这种自身装配的确切机制，但是在研究至此的情况下，已经发现细胞发育为组织依 赖于细胞彼此(相同或不同细胞类型)的定位或其它固定基底和/或某些底物(因子)的 存在或缺乏，如激素、自分泌或旁分泌。总之，常规培养方法不能同时达到足够低的剪 切压力，足够的三维空间自由度，和临界细胞相互作用(彼此或底物)足够长的时期，以 允许体内组织结构的极佳建模。因此，需要在培养中产生和维持器官各部分的体外方法，其中培养的细胞天然 的细胞间关系保持延长一段时间。模拟整个组织在体内发现的细胞分化、细胞增生和细 胞功能的组织和器官模型将对理解器官维持健康状态和由此异常事件如何可以被逆反的 机制有实用性。

发明内容
本发明提供了满足上述需要的体外微器官培养物。微器官培养物主题的突出特 征包括在培养中维持相对长的一段时间的能力，如，至少大约二十四小时，优选至少七 天或更长，以及保持器官微体系结构(microarchitecure)的能力，它促进例如类似于来源 器官中发生的细胞_细胞和细胞_基质的相互作用。典型地，微器官培养物的细胞群中至少一个细胞具有增生能力。微器官培养物 中的细胞群总体上可以处于平衡状态，即细胞群中细胞增生与细胞损失的比率大约是1， 或微器官培养物中的细胞增生速度可以大于它们损失，导致细胞群中细胞增生与细胞损 失的比率大于1，如肿瘤组织得到的细胞群，或如，在外植块中被诱导增生的祖细胞群。可分离微器官培养物细胞的优选器官包括淋巴器官，如胸腺和脾脏；消化道器 官，如肠、肝脏、胰腺、胆囊和胆管；肺；生殖器官，如前列腺和子宫；乳房，如乳 腺；皮肤；泌尿道器官，如膀胱和肾脏；角膜；和血液相关器官如骨髓。在某些实施方 案中，分离的微器官培养物细胞群可以包裹在聚合装置中，如细胞或细胞产物如基因产 物传递给受试者。本发明也涉及本发明的微器官培养物中分离的条件培养基。在本发明的一个实施方案中，微器官培养物包括细胞群，它是器官的一部分。 优选，微器官外植块包括上皮和结缔组织细胞。在本发明的一个实施方案中，器官外植 块得自胰腺，如细胞群的微体系结构基本上与该外植块所来源的最初胰腺的微体系结构 相同，并包括胰腺上皮细胞，如胰岛细胞，和胰腺结缔组织细胞。在本发明的另一个实施方案中，微器官外植块得自皮肤，如细胞群的微体系结构基本上与体内皮肤的微体系结构相同，并包括皮肤上皮，如表皮细胞，和皮肤结缔组 织细胞，如真皮细胞。皮肤外植块得到的微器官培养物与可以包括支撑表皮细胞的基底 层，包括真皮细胞的细胞外基质，和至少一个内陷，如至少一个毛囊和腺体。本发明的另一个实施方案中，微器官培养物包括病毒感染的分离的细胞群，如 肝炎病毒，如乙型肝炎或丙型肝炎，或人乳头状瘤病毒(HPV)，如HPV-6，HPV-8或 HPV-33。当病毒感染时，微器官培养物可以用于鉴定病毒传染性的抑制剂的方法中。 这个方法包括根据本发明的方法分离微器官外植块，外植块来源于病毒感染的器官，或 后来病毒体外感染而在外植块中产生病毒感染的细胞群。该外植块接着可与候选试剂接 触，如测试抗病毒活性的试剂，和在候选试剂存在下测定传染性水平(如病毒负载，新 传染性等)并与不存在候选试剂下病毒传染性水平相比较。候选试剂存在下病毒传染性 水平降低是病毒传染性抑制剂的标志。本发明也涉及制备微器官培养物的方法。这个方法包括从哺乳动物供体受试者 中分离微器官外植块，该外植块具有给分离的细胞群提供在极限培养基中可维持至少大 约二十四小时的大小。微器官外植块放置于培养中。典型地，外植块包括具有分离该外 植块的器官的微体系结构的分离细胞群。在本发明的一个实施方案中，外植块的至少一 个细胞具有增生能力。主题微器官培养物的细胞可以处于平衡状态，即细胞群中细胞增 生与细胞损失的比率是1，或微器官培养物中的细胞可以大于它们损失的速度增生，导致 细胞群中细胞增生与细胞损失的比率大于1，如外植块包括肿瘤组织得到的细胞群。可分离微器官培养物细胞的优选器官包括淋巴器官，如胸腺和脾脏；消化道器 官，如肠、肝脏、胰腺、胆囊和胆管；肺；生殖器官，如前列腺和子宫；乳房；皮肤； 泌尿道器官，如膀胱；肾脏；角膜；和血液相关器官如骨髓。在每个实施例中，培养 的外植块维持器官的微体系结构。微器官培养物可以是组织的一部分，如胰腺组织的一 部分，包括β胰岛细胞，如皮肤的一部分，包括表皮和真皮细胞和其它皮肤特殊结构特 征，如毛囊。微器官外植块中的细胞可以被修饰以表达重组蛋白，该蛋白可以或可以不被该 外植块所来源的器官正常表达。例如，正常由胰腺产生并可被主题转基因方法增加而如 纠正缺乏的基因产物，包括胰岛素、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、胰蛋白酶原、糜蛋白酶 原、羧肽酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、甘油三酯酶、磷脂酶α2、弹性蛋白酶和淀 粉酶；同样，正常由肝脏产生并可被替代基因疗法补充的基因产物，包括凝血因子，如 凝血因子VIII和因子IX，UDP葡萄糖醛酸转移酶、鸟氨酸转氨甲酰酶和细胞色素ρ450 酶；正常由胸腺产生的基因产物包括血清胸腺因子、胸腺体液因子、胸腺生成素和胸腺 素α P本发明的微器官培养物可以用在将基因产物传递给受体受试者的方法中。这个 方法包括提供来自供体受试者的分离细胞群，该细胞群具有分离该细胞的器官或组织的 微体系结构和提供在极限培养基中可维持至少大约二十四小时的分离的细胞群的表面积 和体积的比率(a surface area to volume)。编码和直接表达期望基因产物的重组核酸接着 可导入细胞群，在微器官外植块中产生转基因细胞群，如转基因外植块。转基因外植块 可给予受体受试者。供体受试者和受体受试者可以是同种或不同种。本发明的微器官培养物也可以用在鉴定诱导给定器官的细胞，包括祖细胞增生的试剂的方法中。该方法包括产生根据本发明的微器官外植块培养，其中外植块至少包 括一个具有增生能力的细胞。当放置于培养中后，外植块接触候选化合物，如测试细胞 增生能力的化合物，并测定在候选化合物存在下细胞增生的水平。接着候选化合物存在 下细胞增生的测定水平与不存在候选化合物下细胞增生水平相比较。候选化合物存在下 细胞增生水平增加是细胞增生试剂的标志。使用类似方法可以鉴定细胞增生的抑制剂。 特别地，当使用上述方法确定候选化合物存在下细胞增生的测定水平时，它可以与不存 在候选化合物下细胞增生水平相比较。候选化合物存在下细胞增生水平降低时细胞增生 抑制剂的标志。本发明微器官培养物可用于的另一个方法是鉴定诱导或抑制给定器官的一个或 多个细胞类型分化的试剂，或维持特定分化状态(预防去分化)的试剂的方法。该方法 包括产生感兴趣的器官的微器官外植块，细胞群组成具有该器官微体系结构的外植块， 如此处和以下所述，aleph至少大约1.5mm1，包括至少一个具有分化能力或分化的和具 有去分化能力的细胞。一旦培养后，该细胞群接触候选化合物并测定该化合物存在下细 胞分化水平。候选化合物存在下细胞分化的测定水平与不存在候选化合物下细胞分化水 平相比较。候选化合物选择性细胞分化的水平增加是细胞分化试剂的标志。使用类似方 法可以鉴定细胞分化的抑制剂。尤其是，当使用上述方法确定候选化合物存在下细胞分 化的测定水平时，它可以与不存在候选化合物下细胞分化水平相比较。候选化合物存在 下细胞分化水平降低时细胞分化抑制剂的标志。本发明的另一个方面提供了鉴定和从器官分离干细胞或祖细胞群的方法。这个 方法通常在培养中提供从器官中分离细胞群外植块。如这里所述，外植块的特征是ω在 培养中，维持该外植块所来源的器官的微体系结构，Gi)至少大约1.55mm 1的表面积与 体积指数(aleph)，和(iii)至少一个具有增生能力的祖细胞或干细胞。为了扩充外植块中 分散的细胞群，该外植块接触诱导祖细胞或干细胞增生的试剂，如生长因子或其它促细 胞分裂剂。随后，可从外植块分离扩充的祖细胞。可以依靠它们的增生反应鉴定这种外 植块亚群。在其它实施方案中，该祖/干细胞会在培养中自发增生，甚至在不添加外源 试剂时。在其它实施方案中，可分离对该试剂发生反应而增生的来自外植块的祖细胞或 干细胞，如从剩余外植块的新生芽直接机械分离或溶解全部或部分外植块并随后分离扩 充的细胞群。本发明微器官培养物可以用于的另一个方法是促进受体受试者伤口愈合的方 法。这个方法包括从供体受试者分离细胞群，该细胞群具有至少大约1.5mm 1Waleph, 和将该细胞群应用于受体受试者的伤口。供体受试者和受体受试者可以是同种或不同 种。在一个实施方案中，分离出细胞的组织是皮肤且受体受试者的伤口是溃疡，如糖尿 病相关的溃疡。除非反向指出，本发明的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转 基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们在本领域技术内。文献 中完全解释了这种技术。见例如，MolecularCloning: A Laboratory Manual,第二版， Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis 主编(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) ； DNA Cloning, Volumes I 禾口 II (D.N.Glover 主编，1985) ; Oligonucleotide Synthesis (Μ.J.Gait 主编，1984) ； Mullis 等。美国专利 4,683,195 ； Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames& S.J.Higgins 主 编.1984) ； Transcription And Translation (B.D.Hames & S.J.Higgins 主 编.1984) ； Culture of Animal Cells (R.I.Freshney, Alan R.Liss, Inc., N. Y.) ； Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H.Miller 禾Π M.P.Calos 主编，1987，Cold Spring Harbor Laboratory) ； Methods in Enzymology，154 禾口 155 卷(Wu 等主编)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer 禾口 Walker 主编 Academic Press, London, 1987)； 禾口 Handbook of Experimental Immunology，Volumes I-IV (D.M.Weir and C.C.Blackwell,主编.，1986)。通过下列详细说明书和权利要求书，本发明的其它特征和优点将很明显。


图1是描述块定Aleph，其中χ =组织厚度和a =组织宽度的大小的微器官的图
式表不。图2是显示培养不同时间段后，BrdU标记测定的豚鼠微器官培养物中细胞增生 的直方图。图3是显示培养1-8天后，BrdU标记测定的人背部皮肤微器官培养物中细胞增 生的直方图。图4A-4D是显示对应于小鼠皮肤(放大50倍)(图4A)、豚鼠皮肤(放大75倍) (图4B)、人包皮(放大50倍)(图4C)和人包皮(放大75倍)(图4D)的复制细胞的免 疫荧光的显微照片。图5A-5C是人表皮微器官外植块的横断面(放大75倍)，显示了在培养零(图 5A)，三(图5B)和六(图5C)天时组织的体系结构。图6是证明使用BrdU掺入对不同厚度(χ)和其中(a)保持4mm不变的豚鼠微器 官培养物的表皮增生的影响的直方图。图7A-7B是显示对应于源于胰腺的微器官培养物中的增生细胞的免疫荧光的显 微照片(放大75倍)。图8是显示成年猪胰腺微器官培养物释放的胰岛素量的直方图。图9是显示在培养三天、四天和六天时，结肠、肝脏、肾脏、十二指肠和食管 的微器官培养物中的增生细胞中3H-胸腺嘧啶核苷掺入的直方图。图10A-10C是显示免疫荧光测定的微器官培养物中毛囊活跃增生的显微照片。 放大率40倍(图10A)，40倍(图10B)，和75倍(图10C)。图11是显示在微培养开始和结束时毛干大小分布的直方图。图12是显示在2.5ng/ml TGF-β存在下豚鼠皮肤培养物中的微器官培养中的有 丝分裂抑制的直方图。图13是慢性皮肤溃疡的治疗的微器官外植块的图式表示，显示了组织切片的不 完全切面使得维持可在体内容易操作的结构。图14是用微器官培养物代替一片正常皮肤后的小鼠表面的照片；可以观察到治 愈、植入物中产生新的毛干，和植入物并入正常小鼠皮肤(放大10倍)。图15是(用编码荧光素酶报道基因的质粒转染培养物)转染后，荧光素酶报道 基因在豚鼠皮肤微器官培养物中表达的图示。
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图16是用表明荧光素酶报道基因的质粒，阳离子脂质介导转染培养物后，荧光 素酶基因在大鼠肺脏和胸腺微器官培养物中表达的图示。图17是本发明的微器官培养物中用FGF处理后终期毛囊活化的图示。图18是转基因荧光素酶基因在本发明的微器官外植块中表达的图示。
具体实施例方式本发明涉及三维器官外植块培养系统。这个培养系统可以用于微器官外植块在 体外接近体内完整器官所发现的环境下长期增生。这里描述的该培养系统提供了增生和 适当细胞成熟以维持与体内器官副本(counterpart)类似的结构。本发明的微器官培养物提供了体外培养系统，它可以维持组织或器官的一部 分，和它们的功能保持延长的一段时间。这些培养系统提供了体外模型，可方便和准确 地检测细胞分化、细胞增生、细胞功能和改变这种细胞特征和功能的方法。所得培养物 具有各种应用，范围从体内移植或植入，到体外筛选细胞毒素化合物和药物组合物，和 在“生物反应器”中制备生物活性分子，和从组织分离祖细胞。例如，以不限制的方式，本发明的具体实施方案包括(i)微器官骨髓培养植入物 用于代替化疗过程中破坏的骨髓；Gi)微器官肝脏植入物用于增加肝硬化患者的肝脏功 能；Gii)在主题微器官培养物(如表达重组基因表达的胰岛素的胰腺微器官)中生长的遗 传学改变的细胞；和Gv)与口腔粘膜的微器官培养物连接的牙齿修补物。仍在其它示例的非限制性实施方案中，主题微器官培养物可以用于体外筛选各 种广泛的化合物，如细胞毒素化合物，生长/调节因子，药物制剂等。至此，微器官培 养物在体外维持并接触待检测的化合物。可以测定细胞毒素化合物的活性，例如，通过 其破坏或杀灭外植块中细胞的能力。通过重要的染色技术可以容易地估计此。通过分析外植块的细胞含量，如通过 总细胞量和分化细胞量可以估计生长/调节因子。这可以使用标准细胞学和/或组织学 技术来完成，包括使用采用限定特殊类型细胞抗原的抗体的免疫细胞化学技术。可以估 计各种药物对在三维系统中培养的正常细胞的作用。例如，可以检测增加红细胞形成的 药物对骨髓微器官培养物的作用。可以检测影响胆固醇代谢如降低胆固醇产生的药物对 肝脏微器官的作用。也可以采用异常组织的微器官培养物，如促进过度增生或新增生紊 乱的研究。例如，肿瘤细胞生长侵入器官的微器官外植块可以用作检测例如抗肿瘤试剂 的功效的模型系统。为了方便，这里收集了说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语。术语“外植块”是指来自器官的细胞集合，取自身体并生长在人工培养基中。 当提到具有基底和上皮成分的器官的外植块时，该术语通常是指那个器官的单一外植块 中的两种成分都含有。术语“组织”是指相似的专门细胞组或层，它们一起执行某些特殊的功能。术语“器官”是指两个或更多相邻组织层，其中组织层维持一些形式的细 胞-细胞和/或细胞-基质的相互作用，以产生微体系结构。在本发明中，微器官培养 物由这种器官制备，如哺乳动物皮肤、哺乳动物胰腺、肝脏、肾脏、十二指肠、食管、 膀胱、角膜、前列腺、骨髓、胸腺和脾脏。
术语“基质”是指支撑组织或器官基质。这里使用的术语“微器官培养物”是指分离的细胞群，如具有分离该细胞的器 官或组织的微体系结构的外植块。也就是说，分离的细胞一起形成模拟/保留空间相互 作用的三维结构，如细胞_细胞，细胞-基质和细胞-基质相互作用，和该外植块所来源 的真实组织和完整生物体的定位。因此，外植的组织中保留了如基质和上皮层之间的这 种相互作用，使得临界细胞相互作用提供了例如维持了外植块的生物功能的自分泌和旁 分泌因子和其它细胞外刺激物，并提供了样品中存在足够营养和废物运输的条件下的长 期存活力。主题微器官培养物具有细胞或组织外植块分离的器官或组织的微体系结构。这 里使用的术语“微体系”是指分离的细胞或组织外植块群，其中至少大约50%，优选至 少大约60%，更优选至少大约70%，仍更优选至少大约80%，和最优选至少大约90%或 更多的细胞群在体外维持了它们与它们在体内自然和/或功能联系的至少一个细胞或无 细胞基底的自然和/或功能联系，并形成至少大约一层，更优选至少大约五层，和最有 选至少大约十层或更多的细胞培养。优选，外植块的细胞维持至少一种分离它们的器官 或组织的生物活性。这里使用的术语“分离”是指已经从生物体的自然环境中分离出来的外植块。 这个术语包括从其自然环境的总自然分离，如从供体动物取出，如哺乳动物如人或小 猪。例如，术语“分离”是指外植块的细胞群，作为外植块的一部分培养，或以外植块 形式移植。当用于提及细胞群时，术语“分离”包括由本发明的微器官培养物的增生细 胞得到的细胞群。术语“外胚层”是指胚胎三个原始胚层的最外层；由它衍生真皮和表皮组织如 指甲、皮肤毛发和腺体、神经系统、外部感受器和口腔和肛门的粘膜。术语“上皮”是指内部和外部体表的细胞覆盖物(表皮的、粘液性的和浆液性 的)，包括从那里衍生的腺体和其它结构，如角膜、食管、表皮和毛囊上皮细胞。其它示 例的上皮组织包括嗅上皮，它是鼻腔的嗅区的假复层被覆上皮，并且含有嗅觉的受体； 腺上皮，是指分泌细胞组成的上皮；鳞状上皮，是指扁平样细胞组成的上皮。术语上皮 也可以指过渡上皮，它是特别发现的由于收缩和肿胀而遭受巨大机械改变的内凹器官， 如代表分层鳞状和柱状上皮之间过渡的组织。术语“上皮形成”是指上皮组织生长覆盖 剥脱表面而愈合。术语“皮肤”是指身体外部保护性覆盖物，由真皮和表皮组成，应理解为包括 汗腺和皮脂腺，以及毛囊结构。贯穿本申请，可以使用形容词“表皮的”，并且当用于 使用它们的内容时，应该理解为通常指皮肤的属性。术语“表皮”是指皮肤的最外和无血管层，衍生于胚胎外胚层，厚度为 0.07-1.4mm。在手掌和足底表面，从内向外它包括五层由垂直排列的柱状细胞组成的 基底层；由扁平多面细胞组成的带短的-突起或棘突的棘细胞或棘突层；由扁平粒细胞 组成的粒细胞层；由基层透明细胞组成的透明层，透明细胞中的核不清楚或缺乏；和由 扁平角质无核细胞组成的角质层。一般身体表面的表皮中，通常缺乏透明层。“表皮 样”是与表皮类似的细胞或组织，但也可以用于指无表皮部位存在的和包埋表皮成分而 形成的任何肿瘤。
“真皮”或“真皮”是指深至表皮下方的皮肤层，由脉管结缔组织的密层组 成，并含有感觉的神经和终末器官。发根和皮脂腺和汗腺是深埋在真皮中的表皮结构。术语“腺体”是指专门分泌或排泄与其平常代谢需要无关的物质的细胞集合 体。例如，“皮脂腺”是真皮中分泌油脂物质和皮脂的全分泌腺体。术语“汗腺”是 指分泌汗液的腺体，位于真皮或皮下组织，通过体表上的导管开口。普通和外分泌汗腺 在体表分布最多，并通过分泌物的蒸发促进降温；顶分泌汗腺排出到毛囊上部，而不是 直接排到皮肤上，仅在某些身体区域发现，如肛门周围和腋窝。术语“毛发”(或“毛”)是指丝状结构，特别是由角蛋白组成的专门表皮结 构并由真皮中的乳头凹陷发育而来，仅由哺乳动物产生，是那类动物的特征。该术语也 指这种毛发的集合体。“毛囊”是指包绕毛发的表皮管状内陷，头发由此处长出来；和
“毛囊上皮细胞”是指毛囊中真皮围绕的上皮细胞，如干细胞、外根鞘细胞、基质细胞 和内根鞘细胞。这种细胞可以是正常非恶性细胞，或转化/无限增殖化细胞。术语“脱发”通常是指秃发，如正常存在毛发的皮肤区没有毛发。本领域已知 各种形式的脱发。例如，脱发是指毛发丧失，通常可逆，在严格限定的区域，通常包括 胡子或头皮；药物性(mediacamentosa)脱发是指由于摄入药物造成的毛发丧失；男性模 式脱发，或男性模式秃发，是指异常块定和雄激素依赖性的头发丧失，通常从额头退衰 开始并对称进展为最终仅留下稀疏的头发周缘。贯穿本申请，术语“增生性皮肤紊乱”是指以皮肤组织多余或异常增生为标志 的皮肤的任何疾病/紊乱。这些情况典型的特征是表皮细胞增生或细胞分化不完全，包 括例如X连锁的鳞屑、牛皮癣、特异性皮炎、过敏性接触性皮炎、表皮松解性角化过度 症(epidermolytic hyperkeratosis)和脂溢性皮炎。例如，表皮发育不良是一种形式的表皮 发育缺陷，如“疣状表皮发育不良(dermodysplasia verruciformis)”，它是由于与普通疣 的病毒等同或密切相关的病毒所引起的情况。另一个实例是“表皮松解”，它是指自发 或在创伤部位形成疱和大疱的表皮松弛状态。这里使用的术语“牛皮癣”是指改变皮肤调节机制的过度增生性皮肤紊乱。尤 其是，形成了损害，它包括原发和继发表皮增生改变，皮肤炎症反应和调节分子如淋巴 因子和炎性因子的表达。牛皮癣皮肤的形态学特征是表皮细胞更新更加，表皮增厚， 异常角化，炎性细胞浸润真皮层和多形核白细胞浸润表皮层引起基底细胞周期增加。另 外，存在角化过度和角化不全。这里使用的“增生的”和“增生”是指细胞经历有丝分裂。术语“祖细胞”是指一种未分化细胞，它能够增生和产生更多具有产生大量母 细胞的能力的祖细胞，其中母细胞可依次产生分化或可分化的子细胞。这里使用的术语
“祖细胞”也意欲包括本领域有时称作“干细胞”的细胞。在优选的实施方案中，术语 “祖细胞”是指一般化母细胞，它的子孙(后代)专门分化，通常方向不同，如获得完全 个体特性，如同发生在胚胎细胞和组织的进行性多样化。例如，“造血祖细胞”(或干 细胞)是指骨髓和其它血液相关器官出现的和产生例如红细胞、淋巴细胞和其它血细胞 的分化后代的祖细胞。这里使用的“转化细胞”是指自发转变为无限生长状态的细胞，即它们获得了 在培养中通过无限次分裂生长的能力。关于它们的生长控制受损，可以用如瘤形成的，
11退行发育的和/或增生的术语来描述转化细胞的特征。这里使用的“无限增殖化细胞”是指通过化学和/或重组方法而改变使得细胞 具有在培养中通过无限次分裂生长的能力的细胞。术语“癌”是指恶性新生长组成的倾向于浸润周围组织和倾向于发生转移的上 皮细胞。示例的癌包括“基底细胞癌”，它是很少发生转移，具有局部侵犯和破坏潜 在性的皮肤上皮肿瘤；“鳞状细胞癌”，它是指鳞状上皮产生的和具有立方细胞的癌；
“癌肉瘤”，它包括由癌和肉瘤组织组成的恶性肿瘤；“腺囊肿性癌”，以被小上皮细 胞巢或带分隔或环绕的玻璃样或粘蛋白基质柱或带为标志的癌，发生在乳腺和唾液腺， 和呼吸道粘液腺；“表皮样癌”，它是指倾向于以表皮分化方式相同的方式分化的癌细 胞，即它们倾向于形成棘细胞和经历角化；“鼻咽癌”，它是指鼻后空间的被覆上皮发 生的恶性肿瘤；和“肾细胞癌”，它属于排列多变的肾小管细胞组成的肾实质癌。另一 种癌上皮生长是“乳头状瘤”，它是指来源于上皮的良性肿瘤并且乳头瘤病毒作为成因 物;和“表皮样瘤”，它是指在中间沟(neutral groove)关闭时包埋了外胚层成分而形成 的脑和脑脊膜肿瘤。这里使用的“转基因动物”时任何动物，优选非人哺乳动物，鸟或两栖动物， 其中一个或多个动物细胞含有依靠人为干预而导入的异种核酸，如本领域熟知的转基因 技术。通过故意遗传操作，如通过纤维注射(microinjection)或通过注射重组病毒，导入 细胞前体而直接或间接将核酸导入细胞。术语遗传操作不包括经典的杂交育种，或体外 受精，但宁可是直接导入重组DNA分子。这个分子可以整合到染色体内，或它可以是非 染色体上复制的DNA。这个术语也包括转基因动物，其中该重组基因是沉默基因，例如 本领域所述的FLP或CRB重组酶依赖性构建体。转基因动物与包括组成型和有条件的
“剔除”动物。本发明的“非人动物”包括脊椎动物如啮齿动物、非人灵长目、猪、绵 羊、狗、母牛、小鸡、两栖动物、爬行动物等。优选的非人动物是小猪，或选自啮齿动 物家族包括大鼠和小鼠，最优选小鼠。这里使用的术语“杂合动物”是指其中发现重组 基因，或其中重组体在动物的一些但不是全部细胞中表达的动物。I.微器官培养物的建立根据本发明的微器官培养物和方法的突出特征是保持特定组织在体内发现的细 胞环境的能力。本发明部分基于一种发现，该发现是在定义的环境下，器官外植块的不 同组织层如间质和上皮层的细胞的生长可以在培养中被活化而增生和成熟。而且，外植 块本身提供的细胞-细胞和细胞-基质相互作用足够支持细胞内稳态，如外植块培养中细 胞的成熟，分化和分隔，因此支持组织的微体系结构和功能延长一段时间。细胞和非细胞基底(基质)之间的物理接触的实例是上皮细胞和其基底层之间的 物理接触。一个细胞和另一个细胞之间的物理接触的实例包括例如细胞间连接如缝隙连 接和紧密连接所维持的真实物理接触。一个细胞和另一个细胞功能性接触的实例包括细 胞间电子和化学通讯。例如，心肌细胞通过电脉冲与其它心肌细胞通讯。此外，许多其 它细胞通过化学信使，如局部扩散(旁分泌信号和自分泌信号)或通过血管系统传输到更 远部位(内分泌信号)的激素，与其它细胞通讯。细胞间旁分泌信号的实例是消化道各 种细胞(已知是肠内分泌细胞)产生的信号，如分泌生长抑素，依次抑制附近幽门胃(G) 细胞释放胃泌素的幽门D细胞。
12
不希望受任何特定理论的限制，这个微体系结构可能对极限培养基中，如不含 外源血清或生长因子，的外植块的维持非常重要，因为通过外植块内特殊细胞间的相互 作用产生的旁分泌和自分泌因子，该组织可以保持在这种极限培养基中。此外，术语“维持，体外，它们的物理和/或功能性接触”不包括分离的细 胞群，其中至少一个细胞发育为与至少一个细胞或非细胞基底发生物理和/或功能性接 触，这种物理和/或功能性接触在体内并没有。这种发育的实例是至少一个细胞或分离 的细胞群增生。在优选实施方案中，组成外植块的细胞群以保持一个细胞与另一个之间的自然 亲和力方式分离自器官，例如保持不同细胞的层，如果外植块中存在的话。例如，在皮 肤微器官培养物中，表皮的角质细胞保持与基质相关并保持正常组织的微体系结构包括 毛囊和腺体。这个基础结构是所有器官普遍的，例如，含有上皮成分。此外，这种关系 促进细胞间的通讯。动物细胞之间发生很多类型的通讯。这在正分化的细胞中是非常重 要的，这里诱导定义为一种(诱导)和另一种(应答)组织或细胞间的相互作用，结果应 答细胞经历分化方向改变。此外，诱导的相互作用发生在胚胎和成熟细胞并可以作用于 建立和维持形态形成模式以及诱导分化(Gurdon (1992) Cell 68 185-199)。此外，根据本发明制备的微器官培养物保持正常组织的微体系结构，甚至当培 养延长的一段时间时。这包括根据它们在体内的正常发生情况，维持体外皮肤微器官中 的毛囊、汗腺和皮脂腺(见实施例VIII和图10A-10C)，或根据在体内的正常发生情况， 维持胰腺中郎格罕氏胰岛细胞(见实施例IV，V和VI)。因为这些培养可以维持在受控制 和统一条件下并且仍接近体内组织，它们提供了观察、测定和控制自然现象和由疾病、 衰老或创伤产生的自然现象紊乱的独特机会。而且，研究培养中确定部位的各个细胞的 技术的备用性为组织的各个成分在它们彼此之间以及与整个组织之间相互作用时的功能 提供了见识。所附实施例中描述了根据本发明制备的微器官培养物的实例，并可包括以可包 括多层使得保持了一个细胞与另一个之间自然亲和力的方式聚集的细胞群。放射自显影 法或免疫荧光法可观察和追踪各个细胞或细胞组的增生。如仅仅进一步示例，所附实施例证明了主题培养系统提供了上皮和基质成分在 可与生理条件比较的系统中体外复制。重要地是，在这个系统中复制的细胞被适当分隔 形成形态学和组织学正常的表皮和真皮成分。除了分离保持了原始组织的细胞-细胞，细胞-基质和细胞-基质微体系结构的 外植块，外植块的大小对于其中的细胞的活力很重要，如微器官培养物倾向于保持延长 的一段时间，如7-21天或更长。因此，组织外植块具有选择提供足够营养和气体如O2 扩散至三维微器官中的每个细胞，以及细胞废物扩散出外植块使得细胞毒性和由于微器 官中局部废物伴发的死亡最小化的大小。因此，外植块的大小由缺乏专门的传递结构或 合成基底时可接近每个细胞的最低水平的需要来块定。如这里所述，已经发现如果由外 植块厚度和宽度计算得到的指数-Aleph是至少大于约1.5mm S可以维持这种可接近性。这里使用的“Aleph”是指公式l/x+l/Gl.5mm 1得到的表面积与体积的比率； 其中χ =组织毫米厚度和a =组织毫米宽度。在优选实施方案中，外植块的aleph在1.5 至25mm 1的范围内，更优选在1.5至15mm1的范围内，和甚至更优选在1.5至IOmm1的范围内，虽然也包括aleph在1.5至6.67mm1，1.5至3.33mm 1的范围内。因此，本发明提供了组织外植块的表面积和体积指数维持在选择的范围内。这 个表面积和体积指数的选择范围提供了细胞通过与单层中的细胞类似方式的扩散接近营 养和废物处理的途径。如果表面积和体积指数，这里定义为“Aleph或Aleph指数”是 至少大约1.5mm1的话，可以达到这个可接近性水平。在确定表面积和体积指数时已经 忽略了第三维，因为第三维的变异引起体积和表面积的放射分析都变异。然而，当确定 Aleph时，a和χ应该定义为组织片的两个最小维。表I提供了 Aleph的实例，其中例如具有0.1mm厚度(χ)和Imm宽度(a)的组 织将具有11的Aleph指数。在实施例I中，组织具有χ = 0.3mm和a = 4mm使得Aleph =3.48。在实施例III中，χ变化a恒定在4mm。如图6所示，随外植块厚度的增加， 增生活性实质上降低。因此，900 μ m厚度下，微器官培养物中增生细胞的数量大约比 具有300 μ m厚度的类似来源得到的组织低10倍。具有900 μ m厚度的组织的Aleph指 数是1.36mm S低于这里所述的最小值，然而具有300 μ m厚度的组织的Aleph指数是 3.58mm1，它很好落在这里限定的范围内。表1:作为毫米―1的a(宽度)和x(厚度)的函数-表面积和体积的比率指数 “Aleph”的不同值。宽度χ (mm)a = Imma = 2mma = 3mma = 4mma = 5i
0.11110.510.310.2510.2
0.265.55.335.255.2
0.34.33.833.673.583.53
0.43.532.832.752.7
0.532.52.332.252.2
0.62.662.1621.911.87
0.72.41.921.761.681.63
0.82.251.751.581.51.45
0.92.111.611.441.361.31
121.51.331.251.2
1.21.831.31.161.081.03
1.31.771.261.11.020.96
1.61.6251.130.960.880.83
21.510.830.750.7再次，不希望受任何特定理论的限制，三维培养系统提供的大量因素可能有助 于它的成功(a)适当选择的外植块大小，如使用上面的Aleph计算，三维基质提供了营养足 够扩散至外植块的所有细胞，和细胞废物足够扩散出外植块所有细胞的适当的表面积和 体积比率。(b)由于基质的三维性，与单层培养的细胞相比，各种细胞连续活跃生长，单层 培养的细胞的生长至汇合，表现出接触抑制，并停止生长和分裂。生长和调节因子对外植块中复制细胞的苦心经营可能部分负责刺激培养中的增生和调节细胞分化，如甚至负 责微器官培养物，该培养在总体体积方面是静止不变的。(c)三维基质保持了细胞成分的空间分布，它非常接近于体内副本组织中所发现 的空间分布。(d)细胞_细胞和细胞_基质相互作用可以允许有助于细胞成熟的局部化微环境 的建立。已经认识到分化细胞表型的维持不仅需要生长/分化因子，而且需要适当的细 胞相互作用。本发明有效模拟了组织微环境。如下面说明性实施例所述，已分离了来自动物(包括人)的微器官培养物，如来 源于皮肤、胰腺、肝脏、肾脏、十二指肠、食管、膀胱、骨髓、胸腺或脾脏，并在培养 中生长达到21天。然而，保持培养延长超过21天的一段时间也在本发明的范围内。II.微器官培养物的外植块来源使用从例如皮肤和粘膜(包括口腔粘膜、胃肠道粘膜、鼻腔、呼吸道、子宫 颈和角膜)；胰腺；肝脏；胆囊；胆管；肺脏；前列腺；子宫；乳腺；膀胱；和血液 相关器官如胸腺、脾脏和骨髓分离的外植块可得到主题微器官培养物。因此可以产生这 种器官的体外培养等同物。形成外植块的组织可以是病态的或正常的(如健康组织)。 例如，可分离本发明的微器官外植块的器官可以受下列的影响过度增生紊乱，如牛皮 癣或角化病；病毒感染的细胞增生，如肝炎感染或乳头瘤病毒感染；新增生紊乱，如基 底细胞癌、鳞状细胞癌、肉瘤或维耳姆斯肿瘤；或纤维化组织，如来自肝硬变的肝脏或 遭受胰腺炎的胰腺。可分离本发明的细胞的动物实例包括人和其它灵长目、猪，如完全或部分同系 繁殖猪(如小猪和转基因猪)、啮齿动物等。III.生长培养基有大量为培养来自动物的细胞而存在的组织培养基。这些中的一些复杂，一些 简单。尽管期望微器官培养物可以在复杂培养基中生长，但是这里已经表明培养物可以 保持在简单培养基中，如Dulbecco’ S极限必需培养基。此外，尽管培养物可以在含血 清或其它生物提取物如垂体提取物的培养基中生长，但是这里已经表明血清或其它任何 生物提取物都不需要。此外，器官培养物可以在缺乏血清下维持延长的一段时间。在本 发明优选的实施方案中，体外培养的维持过程中，培养基中不包括生长因子。关于极限培养基中生长的要点很重要。目前，延长哺乳动物细胞生长的多数培 养基和系统掺合了不明确的蛋白或使用饲养细胞来提供支持这种生长所需的蛋白。因为 这种不明确蛋白的存在可干扰主题微器官培养物的意欲终结使用，所以通常期望在不明 确蛋白存在减至最少的情况下培养外植块。这里使用的措辞“极限培养基”是指仅包括培养中的细胞存活和增生所需的营 养的化学上明确的培养基。典型地，极限培养基不含生物提取物，如生长因子、血清、 垂体提取物或不是支持培养中的细胞群存活和增生所需的其它物质。例如，极限培养 基通常包括至少一种氨基酸，至少一种维生素，至少一种盐，至少一种抗生素，至少一 种指示剂，如酚红，用于确定氢离子浓度，葡萄糖和细胞存活和增生所需的其它各种成 分。极限培养基不含血清。各种极限培养基可从Gibco BRL，Gathersburg, MD,以极 限必需培养基从商业上购得。
然而，尽管生长因子和调节因子不需要加入到培养基中，但是添加这种因 子，或接种其它专门的细胞可以用于增强、改变或调节培养中的增生和细胞成熟。培 养中的细胞生长和活性可以受各种生长因子的影响，如胰岛素、生长激素、生长肽激 素、集落刺激因子、红细胞生成素、表皮生长因子、肝红细胞生成因子(肝生成素 (hepatopoietin)),和肝细胞生长因子。调节增生和/或分化的其它因子包括前列腺素、 白介素和天然存在的反生长因子，成纤维细胞生长因子和转化生长因子β家族的成员。微器官培养物可以维持在任何合适的容器中如24或96孔微板，且可以维持在 37在5% CO2中。可以振荡培养物改善换气，振荡速度是例如12rpm。关于提供主题微器官培养物(任选)的培养容器，应该注意在优选的实施方案 中，这种容器通常可以是任何材料和/或性状。可以使用大量不同材料形成容器，包括 但不限于尼龙(聚酰胺)、涤纶(聚酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯化 合物(如聚氯乙稀)、聚碳酸酯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE; teflon)、thermanox (TPX) > 硝酸纤维素、棉花、聚乙二醇酸(PGA)、猫肠缝线(cat gut sutures)、纤维素、明胶、葡 聚糖等。这些物质中的任何一种可以被纺织成网。当微器官培养物本身待植入体内， 最好使用可生物降解的基质例如聚乙二醇酸、猫肠缝线材料或明胶。当培养物待长期保 存或冷冻保存，可以优选非可生物降解的材料如尼龙、涤纶、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、 聚乙烯、聚四氟乙烯、棉花等。可以依照本发明使用的方便尼龙网是Nitex-具有平均孔 径大小210μιη和平均尼龙纤维直径90ym(#3-210/36，Tetko, Inc.,纽约)的尼龙过滤 网。下面还讨论了其它实施方案。在示例的实施方案中，含郎格罕氏(Langerhans)胰岛细胞的胰腺微器官制备作 为本发明的培养物。接着提供胶囊形式的培养物使得避免免疫排斥。可以使用三个胶囊 化的一般(示例的)方法。第一个，管状膜盘绕含有微器官外植块的外壳。该膜与移植 聚合物连接，该装置依次与血管连接。通过对膜渗透性的操作，使得允许葡萄糖自由扩 散和胰岛素前后通过膜，然而阻断抗体和淋巴细胞通过，用这种装置治疗的胰腺切除动 物血糖量可以保持正常(Sullivan等(1991) Science 252 718)。在第二个方法中，含胰腺外植块的空纤维(任选)固定在多糖藻酸盐中。当 该装置通过腹膜内放置于糖尿病动物时，血液葡萄糖上皮可降低并可观察到好的组织相 容性(Lacey et al. (1991) Science 254 1782 ；也见实施例VI)。 因此，可以预先纺织纤 维并随后负载微器官外植块(Aebischer等的美国专利4,892,538; Aebischer等的美国专 利 5,106,627 ； Hoffman 等(1990)Expt.Neurobiol.ll0 39-44; Jaeger 等(1990) Prog.Brain Res.82 41-46 ；禾Π Aebischer 等(1991) J.Biomech Eng. 113 178-183)。第三个，微器官胰岛外植块可以放置于由藻酸盐或聚丙烯酸酯组成的微胶囊中 (见例如 Lim 等(1980) Science 210 908 ； O' Shea 等(1984)Biochim.Biochys.Acta 840 133 ； Sugamori 等(1989) Trans Am.Soc.Artif.Intern.Organs 35 791 ； Levesque 等(1992) Endocrinology 130 644 ；和 Lim 等(1992) Transplantation 53 1180)。最后，应该注意维持本发明微器官培养物的培养基可以收集作为条件培养基的 来源。术语“条件培养基”是指上清，如不含培养的细胞/组织，它是接触培养的细胞 一段时间后产生的使得培养基已经被改变包括细胞产生并分泌到培养中的某些旁分泌和/ 或自分泌因子。这种产物的实例是胰岛素、各种生长因子和激素。这种条件培养基可以用作其它类型的细胞和组织培养的培养基。可供选择地，可以采用条件培养基作为新细 胞产物的来源如生长因子。这种产物可以从条件培养基中分馏并纯化或基本纯化。IV.测定微器官培养物的生物性能已经表明来自正常组织的本发明的微器官培养物维持内稳态，伴构成的细胞增 生，组织整体不生长。测定细胞增生的方法是本领域熟知的且多数通常包括确定以细胞复制为特征的 DNA合成。本领域有测定DNA合成的很多方法，根据本发明可以使用任何一种。在本 发明的实施方案中，用放射性标记(3H-胸腺嘧啶核苷)或标记的核苷酸类似物(BrdU)， 用免疫荧光检测已经确定了 DNA合成。微器官培养物的形成和维持不仅可通过成熟细胞增生，还可以通过前体细胞的 活跃参与，包括在有些情况下是胚胎细胞。已经表明微器官培养物存在于这些前体细胞 的保存、鉴定、分离和促进自然进化的合适环境中。例如，观察到基底层的不成熟细胞 在皮肤微器官培养物中变为成熟角质细胞。类似地，胚胎胰腺细胞可提供微器官培养物 中的成熟胰腺上皮细胞。测定专门产物的分泌可监测前体细胞的成熟和它们随后如成熟 细胞的功能，如表皮细胞中的角蛋白，胰腺上皮中的Glut 2和高血糖素，肝微器官培养 物中的因子VIII。根据本发明制备的微器官培养物保持了体内呈现的在正常组织微体系结构。如 上陈述，这包括体外皮肤微器官中毛囊、汗腺和皮脂腺的维持，根据体内正常情况和胰 腺微器官中胰岛素和高血糖素分泌细胞的维持。因为这些培养物可维持在受控和统一条 件下和它们仍然非常类似于体内器官的微体系结构，所以它们提供了观察、测定和控制 自然现象和疾病、衰老或创伤产生的自然现象紊乱的独特机会。而且，研究培养中确定 部位的各个细胞的技术的备用性为组织的各个成分在它们彼此之间以及与整个组织之间 相互作用时的功能提供了见识。此外，主题微器官培养物可在培养中维持延长的一段时间。优选，微器官培 养物可在培养中维持至少大约二十四小时，更优选至少大约两天，仍更优选至少大约五 天，仍更优选至少大约七天，仍更优选至少大约两周或更长。本发明的微器官培养物典 型地可在培养中维持至少七天。为了说明，来自人、小鼠、豚鼠和大鼠皮肤的皮肤微器 官培养物在培养中维持大约至少二十一天。这里使用的措辞“在培养中可维持”是指组织外植块的细胞群中至少大约 60%,优选至少大约70%，更优选至少大约80%，仍更优选至少大约90%，最优选95% 或更多在培养一定时期后保持有活力。在优选实施方案中，微器官培养物中细胞的细胞增生与细胞损失如死亡或形成 腐肉的比率等于一，即细胞增生的数量等于细胞损失的数量。在另一个实施方案中， 微器官培养物中细胞的细胞增生与细胞损失的比率大于一，即细胞增生速度大于细胞损 失。在后一情况下，应理解为微器官培养物包括正在扩增的细胞群。V.微器官培养物的应用本发明微器官培养物的示例应用包括下列(a)鉴定组织和器官的正常内稳态中包括的因子；(b)研究关于改变环境包括改变营养和存在潜在有毒试剂对器官的组织和细胞的
17正常内稳态的作用；(c)理解发病或创伤开始和过程中触发的器官的组织和细胞改变的途径；(d)鉴定逆转发病或创伤相关的环境改变的不利作用的修复机制；(e)组织的正常内稳态过程中分化的细胞的发育规则；(f)器官内的专门结构，如毛囊的发育规则；(g)器官的补充/移植，其中保留了个体器官的各部分，但不足以替换或再生破 坏的组织如慢性皮肤溃疡、各种形式的糖尿病或慢性肝脏功能衰竭患者中发生的；(h)作为药物筛选和细胞毒性研究的组织/器官等同物；⑴作为增生紊乱的诊断方法；(j)作为新生长因子的来源；(k)作为干/祖细胞的来源；⑴作为诱导分子的来源；(m)作为诱导分子的筛选物；为了进一步说明，本发明可用于产生微器官培养物形式的皮肤等同物。通过背 景技术，应注意已经描述了为了伤口治疗，特别是烧伤治疗的目的，使上皮细胞以模拟 人皮肤的方式生长的很多尝试。皮肤由两种类型组织组成。这些是(1)基质或真皮， 包括松散分散在高密度胶原基质的成纤维细胞以及神经、血管和脂肪细胞；(2)表皮， 包括紧密包裹的表皮基底层，活跃增生的不成熟上皮细胞。当基底层细胞复制时，一些 年轻细胞保留在基底层，而另一些向外迁移，大小增加并最终发育为抗洗涤剂和还原剂 的包膜。在人类中，基底层长出的细胞花费大约2周到达边缘或外层，这个时间后细胞 死亡并脱落。皮肤含有各种结构包括毛囊、皮脂腺和汗腺。毛囊由浓密被覆表皮内陷的 分化角质细胞形成。这种内陷形成的开放末囊收集和浓缩分泌的角蛋白并产生发丝。可 替换地，被覆内陷的表皮细胞可以分泌流体(汗腺)或皮脂(皮脂腺)。这些结构的形成 和增生规则未知。新细胞生成和衰老细胞死亡的平衡过程完成健康皮肤的恒定更新。为 了阻碍衰老，以及破坏平衡的疾病和创伤发生的异常事件，需要理解这个精确规则如何 发生。在本发明的一个实施方案中，微器官培养物的微体系结构模拟体内皮肤的微体 系结构并与其基本相同，如它具有上皮组织/结缔组织结构。例如，皮肤微器官培养物 中，表皮的角质细胞保持与结缔组织相关并保留了这种组织微体系结构包括毛囊。得自 皮肤组织切片的微器官培养物也可以包括支撑表皮细胞的基底层，包括真皮细胞的细胞 外基质和至少一个内陷，如至少一个毛囊。皮肤上皮组织和皮肤结缔组织之间的关系促 进细胞间的通讯。而且，全厚度皮肤可以在允许空气接触的各种方式下生长。外植块的 角质细胞暴露于空气促进角质细胞更快分化和角质层更广泛分泌，它对于皮肤渗透研究 很重要。最后，应该注意近来研究表明皮肤是免疫系统固有和活跃的元件(Cooper等 (1987) The mechanobullous disease.In Dermatology in General Medicine, 3d.Ed.，McGraw Hill, NY(pp.610-626)。皮肤中负责各种免疫活动的主要细胞类型之一是郎格罕氏细 胞。这些细胞可以由新鲜皮肤样品制备并添加三维皮肤培养物产生免疫学完整的组织系 统。传统组织培养技术使这些细胞在培养中长时间生长很困难。这些细胞在三维系统中生长的能力将在研究包括移入、细胞毒性和疾病机制的所有方面中有极大重要性。这种 类型的皮肤培养系统将对研究包括直接或间接包括皮肤(系统性红斑狼疮、大疱类天疱 疮等)的自身免疫紊乱有最大影响。因此，本发明的微器官培养物可以用于研究在疾病 免疫学方面最小化的条件下的增生/分化紊乱。为了鉴定可抑制增生上皮细胞增生的试 剂，示例的药物筛选试验可以源于使用牛皮癣皮肤外植块。该皮肤仅仅使可如具有基质组织支撑的上皮组织的微器官培养物生长的组织实 例。其它组织包括上皮组织可以如本发明的微器官培养物生长。在身体每个部位都发 现上皮组织，在那里出现器官和环境的交界面。在未损伤体内，上皮细胞不断循环并形 成体内包括皮肤的所有游离表面的覆盖组织。有些情况下，如在胰腺中，上皮细胞被覆 各种内陷并将酶分泌到开放空间，使器官能够发挥功能。肺是高度内陷器官的另一个实 例，上皮细胞被覆肺中每个内陷，通过它空气从环境中扩散到身体。再一次，这些上皮 细胞具有特征性性能。肠的被覆也由专门的上皮细胞组成，这些上皮细胞不仅形成屏障 而且含有选择性吸收食物的专门结构。所有上皮由结缔组织支撑。仍包括重要细胞-基 质相互作用的另一个器官是骨髓。因此，在本发明的另一个实施方案中，微器官胰腺培养物的微体系结构模拟体 内胰腺来源的微体系结构或与其基本相同，如它具有上皮组织/结缔组织结构。例如， 胰腺微器官培养物包括胰腺上皮细胞，如胰岛细胞，保持与胰腺结缔组织相关。因此在 胰腺微器官培养物中，保留了正常组织的微体系结构并产生正常胰腺上皮细胞产物如胰 岛素和高血糖素。在另一个实施方案中，本发明提供了由骨髓产生微器官培养物，其中培养物保 留了体内器官的微体系结构。如实施例XV所述，已在培养中分离了骨髓微器官，得到 可与生理条件相比的系统。本发明的骨髓培养物可以用于治疗破坏健康骨髓细胞或降低它们的功能能力的 疾病或情况。主题微器官的植入在包括骨髓的血液学恶性肿瘤和其它瘤形成的治疗中可 能有效。本发明的这个方面在治疗骨髓已受环境因素(如射线、毒素等)不利影响的患者 中也有效。尽管通常优选再植入患者自己的骨髓得到外植块，但是应该注意这种外植块 可以是同种异体的，如来自同种类的另一个成员，或异种的，如来自另一个生物体。实 例的异种植入物可以是植入人的得自小猪的微器官培养物。此外，人造血的祖先的长期生长是可能的，如果给它们提供必需的基质来源的 生长/调节因子。这种相互作用由主题微器官提供，给出外植块作为干和祖细胞的来 源。通常，骨髓的造血祖细胞种植(“播种”)在骨髓微器官的基质形成的天然小包 中。骨髓基质细胞生长的原始速度限制性因素是骨髓基质细胞中包括的成纤维细胞有丝 分裂指数相对低。因此，在想要增加这些细胞的生长和细胞外基质成分对它们的处理的 地方，外植块可以接触这些试剂如氢化可的松或其它成纤维细胞生长因子。如果为了治疗某些转移疾病或血液学恶性肿瘤患者而培养骨髓，那么该患者得 到的骨髓应该在培养前用物理或化学疗法“清除”异常增生的细胞。来自本发明骨髓微器官培养物的条件培养基可以用作新的或已知淋巴因子的来 源，如作为白介素的来源。在一个方面，本发明包括主题微器官培养物在生物体中移植的用途。这里使用的术语“给予”、“导入”和“移植”可以互换使用，是指用导致细胞定位于期望部 位的方法或途径将本发明的细胞群放置于受试者中，如同种异体或异种受试者。可以用 任何适当途径将细胞群给予受试者，该途径导致细胞传递到受试者中的期望部位，在那 里至少一部分细胞保持有活力。优选至少大约5%，优选至少大约10%，更优选至少大 约20%，仍更优选至少大约30%，仍更优选至少大约40%，和最优选至少大约50%或更 多细胞在给予受试者之后保持有活力。给予受试者后细胞活力期可以短如几个小时，如 二十四小时，至几天，长如几周至几月。给予本发明细胞群的方法包括将细胞植入内脏 或体壁腹膜，例如大网膜袋，细胞植入到受体受试者器官的内或上，如胰腺、肝脏、脾 脏、皮肤。本发明的微器官也可以通过植入到如肾被膜下给予受试者。这里使用的术语“受试者”是指哺乳动物，如灵长目，如人。这里使用的“异 种受试者”是被导入或待被导入另一个物种细胞的受试者。“同种异体受试者”是被导 入或待被导入相同物种细胞的受试者。供体受试者是提供细胞、组织或器官的受试者， 它们待放置于培养中和/或移植给受体受试者。受体受试者可以是异种或同种异体受试 者。供体受试者也可以提供再导入它们自己的细胞、组织或器官，即自体移植。为了促进可能遭受宿主免疫学攻击的细胞群的移植，如使用异种移植，如 猪-人移植，微器官可以插入或包入到可充电或可生物降解装置，接着移植到受体受试 者。然后这种细胞产生的基因产物可通过例如为受控传递化合物如药物包括蛋白生物试 剂而设计的聚合装置来传递。各种可生物降解的聚合物(包括水凝胶)，包括可生物降 解或非生物可降解的聚合物，可用于形成在特定靶部位持续释放本发明细胞群基因产物 的植入物。这种植入物的产生时本领域通常所知的。见，例如，ConciseEncyclopediaof Medical & Dental Materials, ed.By David Williams (MIT Press Cambridge, MA, 1990)； the Sabel 等的美国专利 4,883,666 ； Aebischer 等的美国专利 4,892,538 ； Aebischer 等的美 国专利5,106,627 ； Lim的美国专利4,391,909 ；和Sefton的美国专利4,353,888。本发明 的细胞群可以在可接受载体或稀释剂中给予，如无菌盐水和含水缓冲液。这种载体的用 途是本领域熟知的。在一个实施方案中，可以采用本发明的微器官培养物治疗伤口愈合。已知皮肤 损害的修复是非常复杂的过程，包括最初上皮细胞移行以及对来自其下结缔组织的分子 信号应答产生的上皮细胞复制。皮肤微器官培养物这里描述作为伤口愈合的模型。在 受控培养条件下，可仔细监测因子控制的愈合。而且，因为微器官培养物分离自天然血 供，愈合过程分析可以不受血液承受因子或细胞的另外复杂性而进行。正常表皮有丝 分裂活动低，细胞周期是200-300小时。当表皮受伤后，发生有丝分裂活动突发使得 细胞分裂快达10倍，依赖于伤口的情况和严重性(Pinkus H. (1951) J.Invest.Dermatol.16 383-386)。如实施例II证明，皮肤微器官培养物显示增生增加几天达10倍。在这个实施例 中，伤口边缘可比作微器官培养物。这种增生增加模拟与伤害相关的事件并提供研究伤 口愈合过程的独特机会。而且，所附实施例证明在体外本发明的表皮外植块可应用于慢 性伤口(实施例IX)并可形成能够使头发生长的有活力植入物(实施例XI)。此外，主题表皮微器官可以用在烧伤患者的治疗中。烧伤患者的皮肤替换需要 是明显的。美国和欧洲的几个中心已经利用培养的人角质细胞同种移植物和自身移植物
20来永久覆盖烧伤伤 口和慢性溃疡(Eisinger et al.，(1980) Surgery 88 287-293 ； Green 等 (1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76 5665-5668; Cuono 等(1987) Plast.Reconstr.Surg.80
626-635)。这些方法通常不成功，最近研究表明在愈合的移植物中可能存在发疱和/或 皮肤脆性，因为在移植的表皮层下形成一种或多种结缔组织成分异常(Woodleyet al.， (1988) JAMA 6 2566-2571)。本发明的皮肤培养系统提供了表皮和真皮的皮肤等同物， 并且应该克服当前使用的培养的角质细胞移植物的问题特征。仍在另一个实施方案中，本发明的微器官培养物系统可以提供导入体内基因和 基因产物的载体用于基因治疗。例如，使用重组DNA技术，患者有缺陷的基因可以置于 病毒或组织特异性启动子的控制下。重组DNA构建体可以用于转化或转染主题微器官培 养系统中的所有或某些细胞。表达活性基因产物的微器官培养物可以植入那个产物有缺 陷的个体。主题微器官培养物在基因治疗中的用途具有大量优点。首先，由于培养物包含 真核细胞，所以基因产物会在培养中被正确表达和加工而形成活性产物。其次，只要转 染的细胞数量可大体上增加为临床值、相关性和实用性，基因治疗技术就有效；主题培 养物允许转染的细胞数量扩大和扩增。在本发明进一步的实施方案中，转基因微器官培养物可以用于促进基因转导。 例如，不以限制方式，包含重组病毒表达载体的微器官培养物可以用于将重组病毒转移 到接触培养物的细胞，如通过植入，由此模拟体内病毒转播。因此，这个系统可以是比 当前DNA转染技术更有效的完成基因转导的方法。因此，可以修饰本发明的微器官培养物细胞以表达基因产物。这里使用的短语 “基因产物”是指蛋白、肽和功能性RNA分子。通常，核酸分子编码的基因产物是待供
给受试者的期望基因产物。这种基因产物的实例包括受体受试者器官正常产生的蛋白、 肽、糖蛋白和脂蛋白。例如，依靠基因置换胰腺的缺陷器官可以提供的基因产物包括胰 岛素、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、羧肽酶、核糖核酸酶、脱 氧核糖核酸酶、甘油三酯酶、磷脂酶A2、弹性蛋白酶和淀粉酶；正常由肝脏产生的基因 产物包括凝血因子如凝血因子VIII和因子IX，UDP葡萄糖醛酸转移酶、鸟氨酸转氨甲酰 酶和细胞色素p450酶和进行血清腺苷加工或低密度脂蛋白胞吞的腺苷脱氨酶；由胸腺产 生的基因产物包括血清胸腺因子、胸腺体液因子、胸腺生成素和胸腺素α工；消化道细胞 产生的基因产物包括胃泌素、胰泌素、缩胆囊素、抑生长素和P物质。可替换地，所编 码的基因产物是诱导期望的基因产物被细胞表达的产物(如导入的遗传物质编码诱导待 供给受试者的基因产物转录的转录因子)。仍在另一个实施方案中，重组基因可提供异种 蛋白，如对表达它的细胞来说非天然的。例如，各种人MHC成分可以提供给非人器官 来支持人受体中的移入物。可替换地，转基因是抑制正常在微器官外植块中表达的供体 MHC基因产物表达或活动的基因。导入细胞的核酸分子在该核酸编码的基因产物的细胞中是适合表达的形式。因 此，该核酸分子包括编码和基因(或其一部分)转录所需的调节序列，和当基因产物是蛋 白或肽时，核酸分子的翻译包括启动子、增强子和聚腺苷酸信号，以及运输编码蛋白或 肽所需的序列，例如将蛋白或肽运输到细胞表面或分泌的N末端信号序列。调节基因产物表达的核苷酸序列(如启动子和增强子序列)基于待表达基因产物的细胞类型和基因产物的期望表达水平来选择。例如，可以使用已知提供与该启动子相 连的基因细胞类型特异性表达的启动子。成肌细胞基因表达特异性启动子可以与感兴趣 基因连接而提供那个基因产物的肌肉特异性表达。本领域已知的肌肉特异性调节元件包 括肌营养不良蛋白基因(Klamut等(1989)Mol.Cell Biol.9 : 2396)，肌酸激酶基因(Buskin and Hauschka, (1989)Mol.Cell Biol.9 2627)和肌钙蛋白基因(Mar 和 Ordahl，(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85 6404)上游区域，角蛋白基因中介导转录表达的负反应元件 (Jho Sh等(2001) J Biol Chem)。本领域已知其它细胞类型特异性调节元件(如，肝脏特 异表达的白蛋白增强子；胰岛细胞特异性表达的胰岛素调节元件；各种神经细胞特异性 调节元件，包括神经肌营养不良蛋白、神经烯醇化酶和A4淀粉样启动子)。可供选择 地，可以使用可指导基因在各种不同细胞类型中组成性表达的调节元件，如病毒调节元 件。病毒启动子的实例通常用于驱动基因表达包括得自多形瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病 毒和猿病毒40和逆转录病毒LTRs的那些。可供选择地，可以使用提供与其连接的基因 诱导型表达的调节元件。使用诱导型调节元件(如可诱导启动子)允许调节细胞中基因 产物的产生。用于真核细胞的潜在有效的诱导型调节系统的实例包括激素调节元件(如 见 Mader，S.和 White，J.H. (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 5603-5607)，合成配体调 节元件(如见Spencer，D.M.等1993) Science 262 1019-1024)和离子射线调节元件(如 见 Manome，Y.等(1993) Biochemistry 32 10607-10613 ； Datta, R.等(1992) Proc.Natl. Acad.Sci.USA 89 1014-10153)。根据本发明也可以使用可以开发的另外的组织特异性 或诱导型调节系统。有本领域已知将遗传物质导入细胞中可用于修饰本发明细胞的的大量技术。 在一个实施方案中，该核酸是裸核酸分子形式。在这种情况下，导入待修饰细胞的该 核酸分子仅由编码该基因产物的核酸和必需的调节元件组成。可供选择地，编码基 因产物的核酸(包括必需的调节元件)包含在质粒载体中。质粒表达载体的实例包括 CDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329 840)和 pMT2Pc (Kauftnan，et al. (1987) EMBO J.6 187-195)。在另一个实施方案中，待导入细胞的核酸分子包含在病毒载体中。在这种情 况下，编码该基因产物的核酸插入病毒基因组(或部分病毒基因组)。指导基因产物表达 的调节元件可包括插入病毒基因组(即与插入到病毒基因组的基因连接)中的核酸或可由 病毒基因组本身提供。可以使用磷酸钙介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、脂质体介导 的转染、直接注射和受体介导的摄入将核酸导入细胞。通过形成含核酸和磷酸钙的沉淀可以将裸核酸如DNA导入细胞。例如， HEPES缓冲盐溶液可以与含氯化钙和核酸的溶液混合形成沉淀，然后沉淀与细胞温育。 可以添加甘油或二甲基亚砜振荡步骤来增加某些细胞接纳的核酸量。CaPO4介导的转 染可以用于稳定(或瞬时)转染细胞且仅适用于体外细胞修饰。在Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M 等(主编)Greene Publishing Associates, (1989), 9.1 节禾口 Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版，Sambrook 等 Cold Spring Harbof Laboratory Press, (1989)，16.32-16.40节或其它标准实验室手册中可以找到CaPO4介导 的转染方案。通过形成核酸和DEAE-葡聚糖的化合物和化合物与细胞共同温育可以将裸核酸导入细胞中。可以添加二甲基亚砜或氯喹振荡步骤来增加核酸摄入量。DEAE-葡聚糖 转染仅适用于体外修饰细胞并可用于将DNA瞬时导入细胞，但是对于产生稳定的转染细 胞不是优选。因此，这个方法可以用于短期产生基因产物，但不是长期产生基因产物的 选择方法。在 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M.等(主编)Greene Publishing Associates, (1989), 9.2 节禾口 Molecular Cloning : A Laboratory Manual,第二 版，Sambrook 等 Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989), 16.41_16.46 节或其它标准 实验室手册中可以找到DEAE-葡聚糖介导的转染方案。细胞和核酸在适当缓冲液中共同温育并且细胞接受高压电脉冲也可以将裸核酸 导入细胞。核酸导入细胞的效率受施加电场的强度、电脉冲长度、温度、DNA构象和 浓度和培养基的离子组分的影响。电穿孔可以用于稳定(或瞬时)转染各种广泛的细 胞类型。在 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M.等(主编)Greene Publishing Associates, (1989), 9.3 节禾口 Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二 版，Sambrook 等 Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989), 16.54_16.55 节或其它标准 实验室手册中可以找到电穿孔细胞的方案。裸核酸导入细胞的另一个方法包括脂质体介导的转染(脂质转染)。核酸与含阳 离子脂质的脂质体悬液混合。DNA/脂质体复合体接着与细胞温育。脂质体介导的转染 可用于稳定(或瞬时)转染体外培养的细胞。在Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M.等(主编)Greene Publishing Associates, (1989)，9.4 节和其它标准实验 室手册中可以找到方案。另外，使用脂质体已经完成了体内基因传递。见例如Nicolau 等(1987) Meth.Enz. 149 157-176; Wang 和 Huang (1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84 7851-7855 ； Brigham 等(1989) Am.J Med.Sci.298 278 ；和 Gould-Fogerite 等(1989) Gene 84 429-438。裸核酸也可以通过将核酸直接注射到细胞而导入细胞。对于体外培养的细胞， 可以通过显微注射导入DNA。由于每个细胞逐个进行显微注射，因此当修饰大量细胞 时，这个方法是劳动高度密集型。然而，显微注射是一个选择方法的情况是在制备转基 因动物时(下面更详细讨论)。在这种情况下，DNA被稳定导入受精卵母细胞，它接着 允许发育为动物。所得动物含有携带导入该卵母细胞的DNA。直接注射也已经用于将裸 NDA 导入体内细胞(如见 Acsadi 等(1"1)Nature 332 815-818 ； Wolf 等(I99O)Science 247 1465-1468)。也可以使用将DNA注射到体内细胞的传递装置(如“基因枪”)。 这种装置商业上可以获得(如从BioRad)。裸核酸也可以与阳离子复合，如聚赖氨酸，它与细胞-表面受体的配体偶联被 受体介导的胞吞而摄入(见例如Wu，G.和Wu，C.H. (1988) J.Biol.Chem.263 14621 ； Wilson 等(1992) J.Biol.Chem.267 963-967 ；和美国专利 5,166,320)。核酸-配体复合 物与受体的结合促进DNA被受体介导的胞吞摄入。与DNA-配体复合的受体对准包括 转铁蛋白受体和脱唾液酸糖蛋白受体。DNA-配体复合物连接自然破坏内体的腺病毒壳 体，因此将材料释放到细胞质可用于避免复合物被细胞内溶酶体降解(见例如Curiel等 (1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 8850 ； Cristiano 等(1993) Proc.Natl.Acad Sci.USA90 2122-2126)。受体介导的DNA摄入可用于将DNA导入体外或体内的细胞，并且另外， 具有增加的特征，即使用结合选择性在感兴趣靶细胞上表达的受体的配体，DNA可以选择性对准特定细胞类型。通常，当裸DNA导入培养中的细胞时(如用上述转染技术之一)，仅小部分细 胞(大约IO5分之一)被典型地在它们的基因组中整合了转染的DNA(即DNA在细胞中 保持游离型)。因此，为了鉴定已接纳外源DNA的细胞，将编码选择性标记的核酸与感 兴趣核酸一起转染细胞有好处。优选的选择性标记包括提供药物如G418、勻霉素和氨甲 喋呤抗性的那些。选择性标记可以导入到与感兴趣基因相同的质粒上或可以导入到分开 的质粒上。将编码基因产物的核酸导入细胞的优选方法是使用含编码基因产物的核酸如 cDNA的病毒载体。病毒载体感染的细胞具有大部分细胞接受核酸，可除去选择已接受核 酸的细胞的需要的优点。另外，病毒载体内编码的分子，如病毒载体内所含的cDNA， 在已接纳病毒载体核酸的细胞中有效表达并且病毒载体系统可以在体外或体内使用。缺陷型病毒具有为基因治疗目的用于基因转移的很好特性(综述见Miller， A.D. (1990)Blood 76 271)。可以构建重组逆转录病毒使其具有编码感兴趣基因产物的 核酸插入该逆转录病毒基因组中。另外，逆转录病毒基因组的一部分可以去除而得到复 制缺陷型逆转录病毒。接着复制缺陷型逆转录病毒被包装到病毒粒体，通过使用辅助病 毒用标准技术它可用于感染靶细胞。在Molecular Biology，Ausubel, F.M.等(主编) Greene Publishing Associates, (1989)，9.10-9.14节和其它标准实验室手册中可以找到制 备重组逆转录病毒和用这种病毒感染体外或体内细胞的方案。合适的逆转录病毒的实例 包括本领域技术人员熟知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。合适的包装病毒系的实例包括 Ψ Crip, Ψ2和ΨΑιη。逆转录病毒可以用于将各种基因导入很多不同的细胞类型，包括 体外和/或体内上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞、骨髓细胞(见例 如 Eglitis，等(1985) Science 230 1395-1398 ； Danosand Mulligan (1988) Proc.Natl.Acad. Sci.USA 85 6460-6464 ； Wilson 等(1988) Proc.Natl.Acad.Sci USA 85 3014-3018; Armentano 等，(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 6141-6145; Huber 等(1991) Proc.Natl. Acad.Sci.USA 88 8039-8043 ； Feri 等(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA88 8377-8381; Chowdhury 等(1991) Scienee 254 1802-1805; van Beusechem 等(1992) Proc.Natl.Acad. Sci USA 89 7640-7644 ； Kay 等(1992) Human Gene Therapy 3 641-647; Dai 等(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA89 10892-10895 ； Hwu 等(1993) J.Immunol.150 4104-4115; 美国专利 4,868,116 ；美国专利 4,980,286 ； PCT 申请 WO 89/07136 ； PCT 申请 WO 89/02468 ； PCT申请WO 89/05345 ；和PCT申请WO 92/07573)。为了整合到宿主基因 组的逆转录病毒基因组(和插入其中的外源核酸)将核酸稳定导入细胞，逆转录病毒载体 需要分裂靶细胞。因此，可能必需刺激靶细胞复制。可以对腺病毒基因组进行操作使得它编码和表达感兴趣基因产物，但其在正 常溶菌病毒生活史中复制的能力方面失活。见例如Berkner等(1988)BioTechniques 6 616 ； Rosenfeld 等(1991) Science 252 431-434 ；禾Π Rosenfeld 等(1992) Cell 68 143-155。本领域技术人员熟知来自腺病毒株Ad的5dl324型或其它腺病毒株(如Ad2， Ad3，Ad7等)的合适的腺病毒载体。重组腺病毒的优点在于它们不需要分裂有效的 基因传递载体的细胞并可以用于感染各种广泛的细胞类型，包括呼吸道上皮(Rosenfeld 等(1992)前面引用)，内皮细胞(Lemarchand 等(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 6482-6486)，肝细胞(Herz 和 Gerard (1993) Proc.Natl.Acad Sci.USA 90 2812-2816)和肌 细胞(Quantin 等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 2581-2584)。另外，导入的腺病毒 DNA(和其中含有的外源DNA)不整合到宿主基因组中，但是保持游离型，因此避免了在 导入的DNA变得整合到宿主基因组(如逆转录病毒DNA)的情况下，可发生插入性诱变 的结果的潜在问题。而且，腺病毒基因组对外源DNA的携带能力相对于其它基因传递 载体更大(达到8千碱基)(Berkner等，前面引用；Haj-Ahmand和Graham(1986) J.Virol 57 267)。当前使用的多数复制缺陷型腺病毒载体删除了全部或部分病毒El和E3基 因，但保留多达80%的腺病毒遗传物质。腺病毒相关病毒(AAV)是天然存在的缺陷型病毒，需要另一种病毒，如腺病 毒或疱疹病毒作为辅助病毒进行有效复制和有生产力的生活史。(综述见Muzyczka et al.Curr.Topics In Micro.And Immunol. (1992) 158 97-129)。它也是其 DNA 可以整合到 非分裂细胞并显示高频率稳定整合的少数病毒之一(见例如Flotte等(1992)Am.J.ReSpir. Cell.Mol.Biol.7 349-356 ； Samulski 等(1989) J.Virol.63 3822-3828 ；和 McLaughlin 等 (1989)J.Virol.62 1963-1973)。含少如300个碱基对的AAV载体可以被包装并可以整 合。外源 DNA 的空间限于大约 4.5kb。如 Tratschin 等(1985) Mol.Cell.Biol.5 3251-3260 中描述的AAV载体可以用于将DNA导入细胞。使用AAV载体已将各种核酸导入不 同的细胞类型(见例如 Hermonat 等(1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 6466-6470 ； Tratschin 等(1985) Mol.CellBiol.4 2072-2081; Wondisford 等(1988) Mol.Endocrinol.2 32-39 ； Tratschin 等(1984) J.Virol.51 611-619 ；和 Flotte 等(1993) J.Biol.Chem.268 3781-3790))。可以使用本领域常规使用的标准方法估计特定表达载体系统的功效和将核酸导 入细胞的方法。例如，用筛选杂交技术(如Southern印迹)可检测导入细胞的DNA和 例如用Northern印迹、Rnase保护或逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)可以检测导入 DNA转录产生的RNA。用适当的试验可以检测基因产物，例如用所产生蛋白的免疫学检 测，如用特异性抗体，或用功能性试验检测基因产物的功能性活动，如酶学试验。如果 感兴趣待被细胞表达的感兴趣的基因产物不容易检测，可使用与调节元件连接的报道基 因和待使用的载体首先优化表达系统。报道基因编码可容易检测的基因产物，并因此可 用于估计该系统的功效。本领域使用的标准的报道基因包括编码半乳糖苷酶、氯霉 素乙酰转移酶、荧光素酶、GFP/EGFP和人生长激素。当用于将核酸导入细胞群的方法导致大部分细胞修饰和细胞有效表达该基因产 物时(如通常如使用病毒表达载体的情况)，可以使用修饰的细胞群，不进一步分离或群 中各个细胞的亚克隆。即，有足够的细胞群所产生的基因产物，使得不需要进一步细胞 分离。可替换地，可能最好使来自单一修饰细胞的等同修饰同源细胞群生长来分离有效 表达基因产物的细胞。限制性稀释分离单一修饰细胞，随后在培养中用标准技术将单一 细胞扩充为细胞克隆群可制备这种统一细胞群。这里使用的短语“转基因细胞”是指其中插入了部分或完全异种，即外源的核 酸序列的一种细胞，指已经被插入或导入的细胞。转基因细胞也可以是已插入与细胞内 源基因同源的核酸的细胞。然而在这种情况下，设计同源核酸以使得它所插入的细胞基 因组改变的方式待插入或插入到细胞基因组。例如，同源核酸插入到与自然基因不同的位置或同源核酸的插入导致特定表型剔除。插入该细胞的核酸可以包括一种或更多转录 调节序列和任何其它核酸，如内含子，它们可以是所选择核酸的最佳表达所需的。仍在本发明另一个方面，主题微器官培养物可以用于辅助恶性肿瘤和疾病的诊 断和治疗。例如，器官(如皮肤、肾脏、肝脏等)活检可以取自怀疑具有增生或新增生 紊乱的患者。如果根据本方法培养活检的外植块，培养过程中外植块的增生细胞将无性 扩充。这将增加检测这种紊乱的机会，并因此增加诊断的准确度。而且，为了鉴定最有 效的化合物，即杀死恶性肿瘤或病变细胞，而赦免正常细胞的那些，患者的微器官培养 物可以用于体外筛选细胞毒性和/或药物化合物。然后，这些试剂被用于患者的治疗性 处理。本发明更进一步的方面涉及使用主题微器官培养物筛选各种广泛化合物如细胞 毒性化合物生长/调节因子、药物试剂等的方法。例如，通常认识到彻底检测潜在有毒 性质的化学制剂的需要，并且开发估计药物、化妆品、食品添加剂和杀虫剂的敏感和可 重复短期体外试验的需要很明显。这里描述的微器官培养物允许使用组织等同物作为试 验底物并且提供了在非常类似于体内状态的系统中正常细胞相互作用的优点。在这点上，在体外维持培养物并接触待检测的化合物。可以通过其调节外植块 中细胞的表型(包括杀死)来测定细胞毒性化合物的活性。这可以通过重要的染色技术、 标记的表达等很容易地估计。例如，通过分析培养物的细胞含量如用总细胞计数和分化 细胞计数可以估计是指/调节因子的作用。这可以使用标准细胞学和/或组织学技术包 括使用采用限定特殊类型细胞抗原的抗体的免疫细胞化学可以完成。可以估计各种药物 对本发明细胞中培养的正常细胞的作用。例如，可以鉴定降低牛皮癣组织增生的药物。在这个方法的示例性实施方案中，为检测刺激外植块中细胞增生的试剂的得到 的，该方法包括从受试者分离组织外植块，其中外植块的细胞群保留分离该外植块的器 官或组织的微体系结构，如外植块的特征是Aleph至少大约1.5mm1，和包括至少一个具 有增生能力的细胞。培养外植块并接触候选化合物。接着测定候选化合物存在下细胞增 生的水平并与不存在候选化合物下细胞增生的水平相比较。候选化合物存在下细胞增生 水平统计学上显著增加是细胞增生试剂的标志。这里使用的短语“候选化合物”或“候选试剂”是指被检测或待检测增生、抗 增生、分化、抗分化或抗病毒活性的试剂。这种试剂可以是例如小器官分子、生物学提 取物和重组产物或组合物。测定细胞增生的方法是本领域熟知的并且多数通常包括确定细胞复制特性的 DNA合成。本领域有测定DNA合成的很多方法，根据本发明可以使用任何一种。在 本发明的一个实施方案中，用放射性标记(3H-胸腺嘧啶核苷)或标记的核苷酸类似物 (BrdU),用免疫荧光检测已经确定了 DNA合成。另一个实施方案仍提供了鉴定细胞增生抑制剂的方法。这个方法包括提供如上 的组织外植块，该外植块接触候选化合物，和测定候选化合物存在下细胞增生的水平。 候选化合物存在下细胞增生水平统计学上显著降低是细胞增生抑制剂的标志。在说明性的实施方案中，可以使用细胞增生的增强剂和抑制剂(这里也称作抗 增生试剂)，例如根据期望效果控制头发生长。坚硬的角蛋白纤维如绒毛和毛发的生长依赖于真皮鞘细胞增生。鞘的毛囊干细
26胞非常活跃，并通过快速增生和复杂分化产生毛发纤维。毛发周期包括三个不同的阶 段再生(生长)、退化(退化)和终期(静止)。毛囊的表皮干细胞在终期晚期由真皮 突起活化。这术语称作“膨胀活化”。而且，认为这种干细胞是多能干细胞，不仅产生 毛发和毛囊结构，而且产生皮脂腺和表皮。细胞增生神经和细胞增生抑制剂提供了改变 毛发生长周期动力学的方法，例如诱导毛囊细胞增生静止，特别是毛囊干细胞。毛囊细胞增生的抑制剂可以如减少人毛发生长的方法使用，与剪断、刮削或脱 发的方便去除相对。例如，使用本发明方法鉴定的毛囊细胞抑制剂可以用于治疗以毛发 异常快速或浓密生长，如多毛症为特征的毛发病。在说明性实施方案中，这种抑制剂可 以用于处理多毛症-以异常多毛为标志的紊乱。这种抑制剂的用途还能提供延长脱毛持 续期的方法。毛囊细胞增生的抑制剂也可以用于保护毛囊细胞不受发挥功效，如射线诱导死 亡，需要进入细胞周期S期的细胞毒性试剂的影响。用这种抑制剂治疗通过引起毛囊细 胞变得静止，如通过抑制细胞进入S期并因此阻止囊细胞经历有丝分裂突变或程序化细 胞死亡而提供了保护。例如，毛囊细胞增生抑制剂可以用于遭受化学或放射疗法通常引 起毛发损失的患者。这种治疗期间通过抑制细胞周期进展，抑制剂治疗可保护毛囊细胞 不受死亡的影响，否则细胞死亡程序活化引起可以死亡。治疗结束后，毛囊细胞增生抑 制伴发的缓解也可以去除抑制剂治疗。然而，为了开始描述毛发生长控制下的分子机制的特性，以及检测潜在影响毛 发的药物，需要适当的体外毛发生长模型。在本发明的一个方面，主题方法用于产生保 留毛囊微体系结构的毛囊微器官外植块，如毛囊上皮层和毛囊的基质成分(真皮突起)之 间相互作用，如一个或多个干细胞，外根鞘细胞，基质细胞和内根鞘细胞。如所附实施 例中证明，在这些微器官培养物中，甚至缺乏血清下如在极限培养基中可以观察到毛发 生长。重要地，本发明也提供了提供处于基本终期如静止期的毛囊的毛囊培养物。如下 证明，可以在体外培养中活化终期毛囊外植块使再生毛囊生长，和在某些实施方案中， 以同步方式。毛囊表皮干细胞的早期短暂增生提供了理解例如毛囊器官的各种组织产生 的旁分泌和/或自分泌因子介导的再生期活化的独特机会。此外，主题微器官培养物为鉴定调节毛囊活化或失活的试剂的系统，如鉴定可 促进或抑制毛发生长的试剂。在一个实施方案中，如下实施例XVIII所述，终期(静止 期)毛囊外植块接触各种检测试剂，并检测毛囊的刺激水平。例如，通过观察毛囊细胞 的有丝分裂指数，或检测增生的一些其它类似方法可以监测毛囊干细胞从终期至再生期 的转变。为了说明，图17显示了胸腺嘧啶核苷掺入可用于测定缺乏或存在检测化合物下 (图中FGF)外植块中干细胞活化的相对水平，增生增加是具有促进毛发生长活性的检测 试剂的标志。在相反试验中，提供了培养中的再生期微器官外植块，如所附实施例中所述活 化的Senear外植块，或生长因子刺激外植块(如FGF刺激)。相对于未处理的再生外植 块，抑制毛囊干细胞增生的检测试剂可进一步考虑用作抑制毛发生长的终期试剂。仍在其它实施方案中，主题试验鉴定的细胞增生的抑制剂可用于抑制瘤或增生 细胞的生长，如肿瘤形成和生长。本发明的优选实施方案涉及上皮肿瘤形成和生长的抑 制。对于皮肤上皮肿瘤形成的详细描述，见1995年2月7日申请的美国专利申请系列号08/385,185。引起侵犯和转移的细胞增生控制改变和细胞与其环境之间的相互作用紊乱 结果发生肿瘤形成。细胞分裂造成的细胞数量增加和由于分化或细胞死亡造成的细胞周 期退回之间的关系打破导致细胞增生控制紊乱。在正常组织中，通过确保当每个干细胞 分裂时，两个子细胞中仅一个保留在干细胞隔室中，而另一个进入分化途径而维持内稳 态(Caims，J. (1975) Nature 255 197-200)。因此细胞增殖的控制将是影响这些过程的信 号的结果。这些信号可以是阳性或阴性，肿瘤形成的获得是由影响这些控制点的遗传学 改变造成的。如实施例IX所述和图12所示，本发明的皮肤微器官培养物已经用于鉴定细胞 增生试剂和细胞增生抑制剂。如实施例IX所述，检测TGF-β并发现用作细胞增生抑制 剂。也已经表明TGF-β亚家族成员的蛋白-苯丙酸诺龙抑制上皮细胞增生。这些结果 表明可能有在抑制上皮细胞增生中起作用的TGF-β家族其它成员。资料提示TGF-β家 族中作为表皮内稳态的显著调节剂的蛋白在抑制体外上皮肿瘤形成和生长中的作用。本发明的另一个方面涉及鉴定细胞分化试剂即引起细胞分化的化合物的方法。 这个方法包括从受试者分离细胞群，其中细胞群具有分离该细胞的器官或组织的微体系 结构，表面积与体积指数至少大约1.5mm1，和包括至少一个具有分化能力的细胞。接着 该细胞在培养中放置至少大约二十四小时并接触候选化合物。然后测定候选化合物存在 下细胞分化水平并与不存在候选化合物下细胞分化水平相比较。候选化合物存在下细胞 分化水平统计学上显著增加是细胞分化试剂的标志。这里使用的分化是指获得与该细胞 原始具有的形态学和/或功能不同的和/或除它之外的形态学和/或功能的细胞。典型 地，这些形态学和功能是成熟细胞的特征。通过测定专门细胞产物的产生和/或分泌可 监测本发明细胞群的分化。以类似方式，本发明也涉及鉴定细胞分化抑制剂的方法。与上相同方案后，测 定在候选化合物存在下细胞分化的水平并与不存在候选化合物下细胞分化水平相比较。 候选化合物存在下细胞分化水平统计学上显著降低是细胞分化抑制剂的标志。仍在另一个实施方案中，主题培养物允许产生病毒感染的体外模型。例如，可 以分离表皮或鳞状组织，并用如疱疹病毒的病毒感染，如单纯疱疹病毒1，单纯疱疹病毒 2，水痘-带状疱疹病毒；或人乳头瘤病毒，如人乳头瘤病毒1-58任一种，如HPV-6或 HPV-S0类似地，可以为感染感染提供肝脏模型，如肝炎病毒感染的外植块，如甲型肝 炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。病毒感染的组织外植块可用于根据本发明方法 鉴定病毒传染性的抑制剂。如上，提供了特殊的微器官培养物，并接触(任选)感染细 胞产生病毒感染的细胞群的病毒。然后病毒感染的细胞接触候选化合物并在候选化合物 存在下测定病毒传染性的水平。候选化合物存在下病毒传染性水平统计学上显著降低是 病毒传染性抑制剂的标志。测定病毒传染性的方法是本领域已知的并且根据所使用的病毒类型而变化。例 如，可用于测定病毒传染性水平的一种方法是通过测定被检测的特定病毒特异性的基因 产物在微器官培养物或微器官培养物基中的感染细胞中的产量水平。例如，测定微器官 培养物中细胞的肝炎病毒传染性水平，如乙型肝炎病毒，肝炎蛋白产量和肝炎DNA可 定量。通常，微器官培养物基可以与抗所选择病毒蛋白和本领域已知的各种方法，如在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶，ELISA分析的免疫反应蛋白的抗体共同温育。例如，为测定乙型肝炎表面抗原的产量，可以以几天间隔抽样以前与乙型肝炎病毒共同温育的微器官的 微器官培养物基并用制造商所述的ELISA(Abbott)方法检测表面抗原。使用可连续稀释 标准表面抗原(CalBiochem)可改进定量这个方法。培养基中乙型肝炎表面抗原蓄积统计 学上显著降低表明被检测的候选化合物是肝炎病毒传染性的抑制剂。除了测定微器官培养物基中HbsAg的水平，可以用PCR扩增DNA，随后使用 HBV pre-S (编码HBsAg)中标记的引物对作为探针进行Southern印迹分析，可对微器官 培养物中的细胞提取物的新合成乙型肝炎病毒DNA进行检测和定量(见如Sambrook， J.等(1989) Molecular Cloning-Α Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,第二 版，第2卷，10.14-10.15页)。相对定量可以用测光密度术完成并用相应条带的闪烁计 数证实。新合成病毒DNA的水平降低表明测试的候选化合物是肝炎病毒传染性的抑制 剂。在另一个实施例中，使用上述和本领域已知的其它标准技术也可以测定逆转录 病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)的gag、pol和env蛋白。例如，通过细胞提取物与抗pol 抗体或混合的AIDS患者血清和SDS/聚丙烯酰胺凝胶上分析的免疫反应蛋白共同温育可 测定HIV感染的微器官培养物的细胞中表达的pol蛋白。为测定本发明微器官培养物中 的疱疹病毒如EB病毒(EBV)的传染性，使用这里所述方法可分析EBVDNA和EBV诱 导的核抗原产量。本发明的微器官培养物也可以用于促进受试者伤口愈合。因此，本发明进一步 涉及促进受体受试者伤口愈合的方法。这个方法包括从供体受试者分离表面积和体积指 数是至少大约1.5mm 1的细胞群。典型地，细胞群在培养中放置至少大约二十四小时。 接着细胞群可应用于受体受试者的伤口。在一个实施方案中，伤口或损害是缓慢愈合或 慢性的，如糖尿病伴发的伤口，如烧伤，如溃疡。如实施例X和XI证明，本发明的皮肤 微器官培养物可用作待应用于慢性伤口(实施例X)的微外植块并可形成能够使毛发生长 的有活力植入物(实施例XI)。仍在另一个实施方案中，在一个试验中主题微器官外植块提供了检测细胞毒性 或刺激性。在示例的实施方案中，主题方法提供了体外检测眼睛和皮肤刺激的技术。该 方法，非常象上面的，包括给本发明的微器官培养物局部应用液体、固体颗粒或凝胶样 材料(如化妆品)，随后检测培养中产生的作用。目前，通过直接应用于动物或人受试者来估计很多化学制剂、家庭清洁产品、 化妆品、涂料和其它材料的潜在眼睛和皮肤刺激。然而，如工业上多数认识的，这种方 法不满足无法抵抗的公众支持。本方法提供了可供选择的试验，它不需要牺牲动物或对 动物产生永久伤害，并且也提供了客观形式的数据。在说明性实施方案中，根据本发明 得到皮肤微器官培养物。培养的外植块接触测试试剂，如化妆品制剂，在接触后一段时 间估计细胞活力。在优选实施方案中，MTT试验(基于功能性线粒体还原四唑银染料) 用于活力评分。本发明的微器官培养物可另外用于鉴定组织和细胞正常内稳态中包含的因素， 研究细胞环境改变包括营养改变和存在潜在有毒试剂对组织的细胞正常内稳态的作用， 研究发病或创伤开始和过程中触发的组织和细胞改变的途径；鉴定逆转发病或创伤相关 的环境改变的不利作用的修复机制；研究组织的正常内稳态过程中分化的细胞的发育规则和组织内的专门结构(如毛囊)的发育规则；和器官补充，其中保留了个体器官的各部 分，但不足以替换或再生破坏的组织，如慢性皮肤溃疡患者中发生的，其中不适当血液 供应造成愈合缺陷，或局部皮肤不能愈合如已知I型或II型糖尿病的情况下。实施例参考下列实施例将更容易理解现在正在逐步描述的发明，包括的实施例仅仅为 了阐述本发明的某些方面和实施方案的目的，且没有意欲限制本发明。已经分离了来自动物的微器官培养物包括成年人皮肤，小鼠、豚鼠和大鼠皮肤 并在培养中生长达21天。然而，培养物维持超过21天的一段时间也在本发明的范围内。此外，由各种动物形成微器官培养物也在本发明的范围内。动物的范围仅仅是 示例，但不限于下面提供的样品。如所附实施例所述，微器官培养物由皮肤和由器官包括哺乳动物胰腺、肝脏、 肾脏、十二指肠、食管和膀胱制备。类似地，也可以使用本发明的方法制备来自哺乳动 物角膜、肾脏、乳房组织和除了食管的各种来自肠的组织如小肠和结肠的上皮的微器官 培养物。的确，分离和维持来自任何部位的含有体内上皮/基质微体系结构的微器官培 养物都在本发明的范围内。主题微器官培养技术已经用于在不具有上皮/基质微体系结构的组织的长期培 养中保存组织外植块，如某些淋巴组织，如胸腺和脾脏外植块。实施例I表皮微器官培养物的制备新鲜皮肤得自外科手术后，清除其下脂肪组织并切成0.4X5cm的皮瓣，接着使 用组织切碎机或其它合适的切断工具在无菌条件下横向切成300 μ m的切片，使得最后的 组织分段具有宽度4mm和厚度0.3mm的大小(见图1)。这些微器官置于24孔微板中， 在不含血清的400ylDMEM，5% CO2, 37°C中，以12rpm持续振荡一至八天的时间。每 孔生长二十个微外植块。实施例2小鼠、豚鼠和人表皮微器官培养物增生的测定根据实施例I制备微器官培养物，如下分析DNA合成量来测定细胞增生。小 鼠皮肤和豚鼠皮肤生长两天和人皮肤生长四天，之后以终浓度ΙΟΟμΜ向培养基中添加 BrdU三小时，随后将细胞固定在4%甲醛中。固定后，用山羊抗BrdU抗体，随后用抗 山羊FICT标记的IgG对培养物进行染色。组织学标本植入4%甲醛的下列固定液中并切 成3 μ m薄片并用亚甲基蓝染色。发现在体外培养两至四天后，合成DNA的细胞部分与体内观察到的值相比增 加达到10倍，之后DNA合成速度逐步增加但是在培养中保持高达10天(见图2、3和 4A-4D)。甚至在培养第六天，细胞维持稳定状态增生和分化，使保留了组织微体系结构 (图 5A-5C)。实施例III各种大小的微器官培养物中的细胞的增生如实施例I制备豚鼠微器官。宽度4mm的全厚皮肤条切成厚度变化的外植块包 括厚度300，450，600, 700, 900, 1200和3000 μ m。这些薄片逐个放置于含无血清培养基的孔中两天。添加BrdU四小时后，终浓度ΙΟΟμΜ停止。接着外植块固定在4% 甲醛中并用BrdU的山羊抗体，随后用抗山羊IgG FITC标记的二抗制剂染色。图6显示 了这个实验的结果。随外植块厚度增加，作为细胞/单位组织的数量作用的BrdU的掺入 量显著降低。实施例IV胰腺微器官培养物的制备和细胞增生的测定取出豚鼠胰腺，接着使用适当的组织切碎机并且以维持胰腺微体系结构的方式 切成300 μ m厚度、4mm宽度和2mm深度的切片。微外植块在培养中生长从二至八天的 几个时间。七个微器官置于96孔板的每个孔中，在150μ1无血清DMEM，5% CO2下， 37°C, 12rpm持续振荡下。BrdU添加三个小时后，终浓度100 μ M停止，外植块接着固 定在4%甲醛中并用BrdU的山羊抗体，随后用抗山羊FITC标记的IgG染色。图7Α-7Β 示出了来源于胰腺的微器官中的细胞正活跃增生。实施例V制备胰腺微器官培养物并测定分泌到培养基中的胰岛素如前对皮肤的实施例制备成年猪胰腺微器官培养物。取出胰腺，用剪刀切成大 约2mm深和切成300 μ m厚，4mm宽的切片。微器官培养物在无血清培养基中生长14 天。每隔两天，去除培养基并添加新鲜培养基。使用标准放射免疫测定方法检测收集的 培养基中胰岛素的含量。实施例VI猪胰腺微器官移植给异种受试者如前对皮肤的实施例制备成年猪胰腺微器官培养物。取出胰腺，用剪刀切成大 约2mm深和切成300 μ m厚，4mm宽的切片。接着微器官培养物在无血清培养基中生长 O至5天的不同时间段，培养后，从培养中取出胰腺微器官并移植给大鼠宿主的内脏和体 壁中胚层。微器官在体内存活至少一个月并且变得有很好的血管形成。体内三、五、七 和十四天后，可检测到广泛的细胞增生。此外，移植后体内四、七和三十天观察到阳性 胰岛素染色。实施例VII肝脏、肾脏、十二指肠、食管和膀胱微器官培养物的制备和微器官培养物中细胞增生的测定如前对皮肤的实施例制备含几种上皮组织的器官的豚鼠微器官培养物。取出该 器官，用剪刀切成大约2mm宽度，3mm长度，和切成300 μ m厚的切片。微培养物在无 血清培养基中培养三、四和六天。试验结束前十二小时，向外植块培养物中添加3H-胸 腺嘧啶核苷。结束后，固定组织，冲洗几次并用闪烁计数器计数。图9中示出了这个实 验的结果。如图9所示，所有组织显示活跃增殖，如3H-胸腺嘧啶核苷的摄入测定持续 六天。实施例VIII微器官培养物中的毛囊增生根据实施例I制备皮肤微器官培养物并温育两天。添加BrdU三小时后停止温 育。细胞固定在4%甲醛中并用山羊抗BrdU抗体，随后用抗山羊FITC标记的IgG染色。存在于体内正常环境中的完整毛囊可以维持在精确控制的培养条件下，不需要添加血清 或任何其它外源因子。发现在这些微器官中的毛囊在本发明的条件下茁壮增生几天，如 掺入BrdU的毛囊细胞数量大所表明(图10A-10C)。图11显示了豚鼠微器官培养物零 时间和两周后毛干的大小分布。每隔两天更换培养基。毛干大小任意分为小、中和大。 培养九天后，大小分布明确转移，使得小毛发的百分比从64%降低到28%，而在培养开 始时不存在的大毛干表现出30%毛干群。实施例IX测定候选化合物对细胞增生的影响的试验准备制备培养物并维持在如实施例I所述的类似生长条件下的定义培养基中。免疫 细胞化学方法分析对照样品确定微器官培养物维持于类似于体内发生的方式下。用TGF-β以2.5ng/ml处理皮肤微器官的副本样品。根据实施例II实施BrdU 标记的细胞/外植块数量的定量分析。与对照相比，在TGF-β存在下观察到DNA合成 抑制超过90% (图12)。实施例X促进慢性非愈合皮肤溃疡愈合的方法根据这个方法，从患者中取出小面积的正常、未包裹皮肤移植片，如实施例I所 述制备宽度4mm和厚度0.3mm的全厚微外植块。然而该标本与实施例I不同在于切成的 0.3mm薄片故意不完全使得一系列切片如图13所示聚集在一起，上面的表皮层包括角质 层。这个外植块的设计指向允许营养到达所有细胞，但是组织切片维持可操作形式。清 洁患者的伤口并去除周围皮肤边缘。接着用微外植块小心地覆盖缺乏皮肤的区域，外植 块置于伤口上使得非切割缘面向外和相对切割片悬浮于伤口内液体中。制备足够的微外 植块大体上覆盖受伤区域。接着用合适的敷料覆盖治疗的区域并允许愈合。实施例XI体内毛囊的增生受伤体内动物试验，从小鼠取出Icm2面积的皮肤并不完全显微切片，如上所 述使得完整皮肤区域的角质层保持完整。微器官再次植入其缝合小鼠的原始位置并允许 愈合。植入物保持有活力，变得并入动物组织并且培养两周后从植入物生长出新的毛干 (见图14)。实施例XII人牛皮癣皮肤微器官培养物使用植皮刀在尸体解剖后得到82岁老年患者的切开厚度的牛皮癣皮肤。接着皮 肤切成0.5X5cm皮瓣，然而使用组织切碎机或其它合适的切割器具横向切成300μιη的 切片。这些微器官切片置于微板中，在无血清DMEM，5% CO2, 37°C，持续振荡一至 十四天下。有些情况下，向培养基中添加生长因子。每隔两天更换培养基。人牛皮癣 皮肤如微器官培养物广泛增生。实施例XIII肝炎病毒感染的肝脏微器官培养物如实施例VII所述切开人、大鼠、小鼠和豚鼠肝脏并培养微器官培养物。使用 如这里所述的BrdU掺入来检测这些微器官培养物中的活跃增生。培养至少14天后，如尿素(SigmaChemical，尿素检测试剂盒)和白蛋白产物(ELISA)测定确定这些微器官培 养物中的肝细胞是有功能的。上面制备的人肝脏微器官培养物与乙型肝炎和丙型肝炎病毒阳性患者的血清 共同温育。24小时后，去除培养基并添加含和不含10%正常胎牛血清(FCS)的新鲜 DMEM。每隔两天，用新鲜培养基更换培养基并使用抗病毒蛋白HBs的抗体检测条件培 养基中的病毒颗粒。4天后，在这些微器官培养物中检测到病毒颗粒数量显著增加并在 FCS存在下培养。实施例XIV胸腺和脾脏微器官培养物基本上如前面对皮肤的实施例制备胸腺和脾脏的小鼠和大鼠微器官培养物。去 除器官并用剪刀切割成大约2mm的宽度和3mm的长度。接着使用适当组织切碎机以保 留器官本质的微体系结构的方式将这些样品切割成大约300 μ m厚的外植块。微器官接着 在无血清培养基中培养1，3，5和10天。如这里所述使用BrdU掺入检测到这些微器官 培养物的活跃增生。实施例XV骨髓微器官培养物从大鼠和小鼠的股骨小心地取出骨髓制备来自骨髓的微器官培养物。由于这种 外植块中的骨髓直径仅大约l_2mm，所以使用组织切碎机用300 μ m的厚度将骨髓直接切 成微器官外植块。这个方法确保骨髓在服从长期培养，保留表面积/体积指数的同时保 持微体系结构。微器官在无血清培养基中培养3天。如这里所述使用BrdU掺入检测到 这些微器官培养物中骨髓细胞的活跃增生。实施例XVI基因产物传递给皮肤微器官培养物本发明微器官培养物固有的高表面积比体积对各种基因传递技术来说都允许容 易进入组织。在这个实施例中，使用电穿孔和脂质体转染用外源基因转染微器官培养 物。该微器官培养物可移植给动物并在体内存活至少大约三十天和形成血管。这证明使 用组织MC培养在非体内基因治疗方案的可能性。MC培养更多优点是它可移植到体内 确定的位置，使得如果需要，将来可以很容易地取出它。这与细胞可在正常组织中移行 或“损失”的细胞悬浮液移植到身体形成对照。切割豚鼠皮肤并切成宽度2mm和厚度300 μ m的切片。在无血清极限必需培养 基中培养皮肤为微器官，青霉素和链霉素以供应商推荐的浓度。在37°0和5%032下培 养一天后，用不含抗生素的DMEM冲洗皮肤微器官培养物，并添加到0.4cm缝隙可处理 电穿孔比色杯中，500 μ 1培养基在冰上。如所示添加十微克含所示报道基因的质粒DNA(每个质粒具有驱动β -半乳糖苷 酶(对照)或荧光素酶报道基因的巨细胞病毒启动子)。荧光素酶质粒主链是框架中融合 萤火虫荧光素酶基因的pRC-CMV(Invitrogen)。样品在220mV和如图15所示变化的电容下电穿孔(高=900 μ F，中=500 μ F， 低=250 μ F)。ΝΙΗ3Τ3细胞在250 μ F下用BiO-Rad电穿孔装置处理。接着该样品进一
步在24孔培养皿中含10%牛血清、青霉素、链霉素和谷氨酸的DMEM中培养2天。去除培养基，样品悬浮于大约700 μ 1细胞培养裂解剂(Pramega)中。组织片勻浆化，接着 向100 μ 1荧光素酶检测试剂(Promega)中添加20 μ 1，用Packard Top Count 一式三份检测
荧光素酶。作为阳性对照，胰蛋白酶作用于来自75cm培养瓶的NIH3T3细胞，与微器官 培养物等同处理。如图15所示，在培养基(500 μ F)和低(250 μ F)电容设定下，检测到 明显的荧光素酶活性。为了对比，用相同的质粒在250 μ F下电穿孔类似量的ΝΙΗ3Τ3无 限培养细胞。在另一个实验中，用观察到比电穿孔更有效的脂质体转染完成微器官外植块的 转染。尤其是，用含有荧光素酶报道分子的质粒转染来自豚鼠皮肤、新生小鼠皮肤和大 鼠肺脏的微器官培养物。简言之，转染前，微器官培养物在37°C，5.5% CO2,含青 霉素/链霉素和L-谷氨酸盐的DMEN中生长1天。外植块放置于24孔板，每孔含 20个外植块和400 μ 1培养基。为了转染，用Optimem冲洗微器官培养物两次，向每孔 添加 10 μ 1 Lipofectin (Gibco BRL) +2 μ g DNA+Optimem,总体积 500 μ 1。根据脂质转染 制造商的指导制备Optimem/Lipofectin/DNA溶液。接着该培养物在37°C，5.5% CO 2中 温育5-6小时。接着Optimem/Lipofectin/DNA放置于含1 %青霉素/链霉素，1 % L-谷 氨酸盐和10% FCS的400 μ IDMEN中，培养物在37°C，5.5% CO2过夜温育。第二天早 晨，取出微器官培养物，用IXPBS洗涤两次，在手工操作的玻璃组织研磨器中，750 μ1 IX细胞培养裂解缓冲液(Promega)中研磨。使用荧光素酶检测系统(Pramega)检测转基 因的荧光素酶活性，结果在图18中报告。实施例XVII基因产物传递给微器官培养物如实施例XV所述切割八周龄雌性Lewis大鼠的肺脏和胸腺并加工进行微器官培 养物。微器官培养物放置于培养孔中并用阳离子脂质/编码荧光素酶的质粒DNA复合体 转染五至六小时，同时在37°C温育。抽出阳离子脂质/质粒DNA溶液，接着在加10%血 清的培养基中温育培养物两天，然后检测荧光素酶报道基因表达(在任意光单位表达)。 图16阐述了这个实验结果。如图16证明，肺脏，而不是胸腺，在这些情况下表达转染的 荧光素酶基因。如所期望的，阴性对照半乳糖苷酶转染的肺脏微器官培养物(10 μ 1 阳离子脂质浓缩物)的光产量(23光单位)接近机器背景。实施例XVIII毛干体外生长外科手术后得到新生小鼠皮肤，清除其下脂肪组织并切成0.4X5cm的皮瓣，然 后使用组织切碎机或其它任何合适的切割装置横向切成300 μ m的切片。微器官置于微板 中，缺乏血清的DMEM中，5% CO2, 37持续振荡1至14天的时间。某些外植块接 触添加到培养基中的生长因子如FGF。每隔2天更换培养基。当在MC培养中生长时，可诱导新生“无毛”皮肤产生毛干。在Ing/mlEGF存 在下，微器官培养物中生长3天的30小时龄小鼠的皮肤的显微照片显示外植块中毛干的 发育，在培养开始过程中没有出现生长。在另一组实验中，观察到终期毛囊的活化。Senear小鼠提供了研究毛囊活化的 有用模型，因为毛囊很好同步且已经很好描述循环阶段的特性。Senear小鼠提供了再生 期活化的体内模型。去除终期毛囊的棒节可诱导新的毛发形成，它的第一个指征已经很好描述了特性。外科手术后得到成年sencar小鼠的皮肤，清除其下脂肪组织并切成 0.4X5cm的皮瓣，接着使用组织切碎机或其它合适切割装置横向切成300μιη的薄片。微 器官置于微板中，无血清的DMEM，5% CO2, 37持续振荡1至14天的时间。毛囊 干细胞增生证明了无论去除棒节或生长因子处理诱导的终期毛囊的活化。图17示出了如 胸腺嘧啶核苷掺入检测的终期外植块的活化。实施例IXX制备移植的胰岛已经开发了几种技术制备了大量各种哺乳动物来源的胰岛细胞，此后它们组成 了可能移植的β细胞团，用它们治疗建立的I型糖尿病。迄今为止，已遭遇了两个主要 的缺点。已经证明获得制备ρ细胞的可复制可信方法是困难的。第二，这些细胞在体外 和体内的活力非常多变。部分由于第一个原因和部分由于β细胞很可能需要正常胰腺的 胰岛下基质的支撑的事实。迄今为止，非体内维持胰腺器官的过程尝试都不成功。使用 这里所述的MC培养技术，在确定的培养基中，体外建立小鼠、大鼠、豚鼠和猪胰腺的 微器官培养物已经达到成功。选择胰腺微器官培养物已经在体外生长达一个月的时期。培养物内，外植块维 持它们的组织微体系结构并且如BrdU掺入和标记测定某些细胞亚群活跃增生。此外，胰 岛细胞将胰岛素分泌到培养基中，甚至在体外培养一个月后。已经实施移植实验，其中猪微器官胰腺培养物植入大鼠宿主的内脏和体壁中胚 层。外植块在体内保持从几天至一个月的时期。外植块有了很好的血管形成且并入组织 宿主中。实施例XX人牛皮癣皮肤微器官培养物的制备使用植皮刀，尸体解剖后获得切开厚度患者的牛皮癣皮肤。皮肤切成0.4X5cm 的皮瓣，然后用组织切碎机横向切成300 μ m厚的切片。这些微器官外植块在DMEM(无 血清)中，微板上，37°C和5%032下培养1至14天。在各种时间点检测微器官外植块 表明外植块的细胞保持有活力，且发生增生。上面引用的所有参考文献和出版物并入这里作为参考。等同物本领域技术人员将认识到，或能够确定使用常规实验，这里所述的特殊试验和 试剂的很多等同物。认为这种等同物包括在本发明的范围内并且被下列权利要求覆盖。
权利要求
1.表达至少一个重组基因产物的基因修饰的微器官外植块，该微器官外植块包括细 胞群，该微器官外植块维持得到该器官的微体系结构以及同时具有经选择以使得允许足 够营养和气体扩散到该微器官外植块中的细胞且细胞废物从微器官外植块扩散出去的大 小，且其中至少一些所述细胞表达至少一个重组基因产物。
2.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，其中所述的至少一个重组基因产物选自重 组蛋白和重组功能性RNA分子。
3.权利要求2的基因修饰的微器官外植块，其中所述的重组蛋白正常由微器官外植块 所来源的器官产生的。
4.权利要求2的基因修饰的微器官外植块，其中所述重组蛋白正常不是由微器官外植 块所来源的器官产生的。
5.权利要求2的基因修饰的微器官外植块，其中所述的重组蛋白是标记蛋白。
6.权利要求2的基因修饰的微器官外植块，其中所述的重组蛋白选自胰岛素、淀粉 酶、蛋白酶、脂肪酶、胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、羧肽酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸 酶、甘油三酯酶、磷脂酶A2、弹性蛋白酶、淀粉酶、凝血因子、UDP葡萄糖醛酸转移 酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、细胞色素p450酶、腺苷脱氨酶、血清胸腺因子、胸腺体液因 子、胸腺生成素、胸腺素α 、生长激素、促生长因子、集落刺激因子、红细胞生成素、 表皮生长因子、肝红细胞生成因子(肝生成素)、肝细胞生长因子、白介素、反生长因 子、成纤维细胞生长因子、β家族的转化生长因子、胃泌素、胰泌素、缩胆囊素、生长 抑素、P物质和转录因子。
7.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，可在培养中维持至少大约二十四小时。
8.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，具有公式l/x+1/a> 1.5mm 1为特征的表 面积对体积指数；其中“X”是组织毫米厚度和“a”是所述组织毫米宽度。
9.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，其中所述器官选自淋巴器官、胰腺、肝 脏、胆囊、肾脏、消化道器官、呼吸道器官、生殖器官、皮肤、泌尿道器官、血液相关 器官、胸腺、脾脏。
10.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，包括上皮和结缔组织细胞。
11.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，其中所述器官是胰腺，且细胞群包括郎 格罕氏胰岛。
12.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，其中所述器官是皮肤，且外植块包括至 少一个毛囊和腺体。
13.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，其中所述器官是病变皮肤，且外植块包 括来自病变皮肤的过度增生或新增生的细胞群。
14.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，其中所述外植块可维持在极限培养基中。
15.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，其中所述微体系结构包括定位于分离该 外植块的器官的两个或更多组织之间的一个或多个细胞_细胞和细胞_基质。
16.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，其中至少一些所述细胞被携带编码所述 重组基因产物的重组基因的重组病毒感染。
17.权利要求16的基因修饰的微器官外植块，其中所述重组病毒选自重组肝炎病毒、重组腺病毒、重组腺相关病毒、重组乳头瘤病毒、重组疱疹病毒、重组慢病毒、重组逆 转录病毒、重组巨细胞病毒和重组猿病毒。
18.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，其中至少一些所述细胞通过选自磷酸钙 介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、脂质体介导的转染、直接注射和受体 介导的摄入的转化方法转化了外源核酸序列。
19.包含权利要求1的基因修饰的微器官外植块的药物制剂。
全文摘要
描述了包括具有特殊特性的分离的细胞群的微器官培养物。主题微器官培养物的突出特征包括在培养中维持相对长的一段时间的能力，以及保持促进例如类似于来源器官中存在的细胞-细胞和细胞-基质相互作用的器官微体系结构。本发明的微器官培养物可以用在将基因产物传递给受体受试者的方法中，来鉴定细胞增生和细胞分化试剂，以及祖和干细胞的鉴定和分离。另外，本发明的微器官培养物可以用于鉴定细胞增生、细胞分化和病毒传染性抑制剂的方法中。在其它实施方案中，微器官培养物可以用于移植。
文档编号C12N15/86GK102010851SQ20101051477
公开日2011年4月13日 申请日期2001年10月23日 优先权日2001年10月23日
发明者E·N·米特拉尼 申请人:耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司