专利名称：检测黄连属道地药材的基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种利用寡核苷酸探针检测黄连属道 地药材的基因芯片。
背景技术：
按照新医改方案，今后中药将由国家负责招标、直接配送，以减少不必要的中间环 节；在价格上，国家还将在合理确定利润水平的基础上，统一制定零售价。但是现有的中药 流通领域鱼目混珠、乱象丛生，中药造假、价格虚高等现象早已是业内公开的秘密。目前，假药材充满市场。譬如说，宁夏的银柴胡，被山银柴胡代替。除假药之外，中 药材常常有一名多药现象。例如说，黄柏就有两种来源，其所含小檗碱数量相差数倍。又如 外形相似的鬼白被误为龙胆，致使患者误服而昏迷。这说明了鉴定药材真伪的重要性。目前，四川的黄连等用量较大的药品存在品种较多，假药泛滥的情况，比如黄连， 有雅连，岩连，味连，云连等品种，而且常有用玄参科植物胡黄连(Picrorhize Kurrooaoyle et Bentham)冒充四川道地黄连的现象。另外，像四川省的川贝母等名贵药更存在着识别困 难，以次充好的现象。而道地品种的真伪鉴定困难重重，因此，开发一套快速、便捷的鉴定技 术和方法势在必行。中国药典2005版，黄连(Coptidis Rhizoma)为毛茛科(Ranunculaceae)植物黄连 属(Coptis)的黄连Coplis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或云连Coptisteeta Wall.的干燥根茎，以上三种分别习称“味连”、“雅连”、“云 连”。一股认为的黄连属地道药材在植物分类学上包括峨眉黄连Coptis omeiensis，云 南黄连 Coptis teeta，三角叶黄连 Coptis deltoidea，黄连 Coptis chinensis，五叶黄连 Coptisquinquefolia, 0本黄连Coptis japonica，五裂黄连Coptis quinquesecta等禾中类。药材不道地，有效成分在质量上就会靠不住。因此，自古以来，中药材是否道地，代 表有效成分的是否可靠。简而言之，就是药材的真假问题。如何辨别真伪，历来都有一套依 据和做法，那就是用眼来看外形，用口来尝味道，此外再加上用手摸外表的绉纹和粗细来鉴 别药材的真伪。不过，这种做法的时代已经不合时宜。随着DNA分子生物学的发展，在分子 水平上用DNA来鉴定有效材料，才会万无一失。在现有的中药材真伪品分子鉴定手段中，DNA条形码技术具有应用开发前景。DNA 条形码(DNA barcoding)是根据对一段标准的DNA序列的分析来鉴定物种，已成为生物物 种鉴定的新方向。本领域目前需要开发出一套快速、简单的鉴定黄连属地道中药生药材、饮 片及制品的真伪品的技术方案。
发明内容
本发明要解决是现有技术无法快速、准确地确定黄连生药、饮片或者粉末状态的 具体种类的技术问题。本发明为了解决这一技术问题，提供了检测黄连属道地药材的基因
-H-* I I心片。
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该检测黄连属道地药材的基因芯片包括固相载体，所述固相载体的表面固定有检 测黄连属植物的寡核苷酸探针组所包含的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针可分别与待测 样品进行杂交反应；所述寡核苷酸探针组含选自表1中的至少一种寡核苷酸探针序列表1检测黄连属道地药材的第1号寡核苷酸探针序列
权利要求
检测黄连属道地药材的基因芯片，其特征在于包括固相载体，所述固相载体的表面分别固定有检测黄连属植物的寡核苷酸探针组所包含的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针可分别与待测样品进行杂交反应；所述寡核苷酸探针组包含如下所示的至少一种第1号寡核苷酸探针序列 对应的黄连种名 探针序列 峨眉黄连 CTTTCCAGGGGCCGCCCCATGGTAT 云南黄连 ACTTTCCAGGGGCCGCCCCATGGTA 三角叶黄连 ACTACTTAACAGGGGGATTCACCG 黄连 ACTTTCCAGGGGCCGCCCCATGGTAT 五叶黄连 GAACTACGGCAGAGCGGTTTA 日本黄连 TGGAGTTCCGCCGGAAGAAGC 五裂黄连 ACTTTCCAGGGACCGCCCCATGGTA所述黄连属植物为峨眉黄连Coptis omeiensis，云南黄连Coptis teeta，三角叶黄连Coptis deltoidea，黄连Coptis chinensis，五叶黄连Coptis quinquefolia，日本黄连Coptis japonica，五裂黄连Coptis quinquesecta中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的检测黄连属道地药材的基因芯片，其特征在于所述的寡核 苷酸探针组还包含选自如下所示各序列中相应黄连种类的第2号寡核苷酸探针序列
3.根据权利要求2所述的检测黄连属道地药材的寡核苷酸探针组，所述的寡核苷酸探 针组还包含选自如下所示的各序列中的相应黄连种类的第3号寡核苷酸探针
4.根据权利要求1所述的检测黄连属道地药材的基因芯片，其特征在于 体的表面还固定有阳性参照探针和阴性参照。
5.根据权利要求4所述的检测黄连属道地药材的基因芯片，其特征在于 针的序列为5’ -GCTGCTGTAGCTGCCGAATCTTCTA-3，。
6.根据权利要求4所述的检测黄连属道地药材的基因芯片，其特征在于 体的表面固定有1 5个下表所示寡核苷酸探针阵列
7.根据权利要求6所述的检测黄连属的基因芯片，其特征在于所述固相载体为醛基 化的载体片，所述阵列中的每条核苷酸探针重复2 5次。
8.一种检测黄连属道地药材的基因芯片试剂盒，其特征在于包括权利要求1 7任一 项所述的基因芯片和用于从待测样品总DNA中扩增其核酮糖1. 5- 二磷酸羧化酶/加氧酶 大亚基(ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit, rbcL)基 因的特异性引物对·5 ’ -ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’ 5’ -CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC-3’。所述固相载 阳性参照探 所述固相载
9.一种检测黄连属道地药材的方法，其特征在于包括以下步骤a、提取待检黄连样品的总DNA；b、从提取的总DNA中扩增待检黄连样品rbcL基因；C、用扩增得到的rbcL基因与权利要求1 7任一项所述基因芯片进行杂交实验，杂交 实验结果为阳性的探针所对应的黄连种名即为待检黄连样品的种名。
10.根据权利要求9所述的检测黄连属道地药材的方法，其特征在于步骤b中扩增待 检黄连样品rbcL基因的引物对为5’ -ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’ 5’ -CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC-3，。
全文摘要
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种检测黄连属道地药材的基因芯片。本发明要解决是现有技术无法快速、准确地确定黄连属道地药材的种类的技术问题。本发明为了解决这一技术问题，提供了检测黄连属道地药材的基因芯片，其包括固相载体，所述固相载体的表面固定有黄连属7个道地药材的寡核苷酸探针组所包含的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针可分别与待测样品进行杂交反应。本发明在黄连属道地药材的检测鉴别方面具有很好的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK101962681SQ20101052449
公开日2011年2月2日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者孟爱国, 杨楠, 熊铁一, 莫邦辉, 谷海燕, 鲁松 申请人:四川省自然资源科学研究院