专利名称：乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的方法及试剂盒。
背景技术：
由乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)引起的人类急、慢性肝炎的DNA病毒， 简称HBV。乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科(h印adnaviridae)，基因组长约3. 2kb，为部 分双链环状DNA。乙型肝炎病毒的抵抗力较强。HBV只有3200bp，是一个相当小的病毒。其基因组共有四个0RF，编码以下一些 蛋白Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白等。Core是核衣壳蛋白； Pre-core现在不知道有何功能，它对病毒的复制不是必要的，但是可能与抑制宿主的免疫 反应有关；X蛋白对病毒复制是重要的，还与引起肝癌的发生有关；S蛋白是病毒的包膜蛋 白，与病毒进入细胞有关。目前，我国的乙肝病毒感染率约60%_70% ；乙肝表面抗原携带率约占总人口的 7.18%。因此，对于乙肝病毒的诊断和治疗就越来越重要了。有效的抑制乙肝病毒的复制， HBV-DNA阴转、HBe-Ag的血清转化、肝组织学的改善、肝功能复常已成为现阶段抗病毒治疗 的主要目的之一。少部分患者也可出现HBs-Ag阴转、抗-HBs免疫性抗体的产生。但是，通 过长期的临床观察，发现同一种抗病毒药物用于不同乙肝患者时，治疗效果不同，且同一患 者使用不同抗病毒药物的治疗效果亦不同。随着HBV基因型的研究，众多临床资料显示，抗 病毒治疗乙型肝炎的效果，除了与患者自身免疫应答有关外，还与不同基因型HBV感染密 切相关。根据HBV全基因核苷酸序列异源性彡8%或者S基因区核苷酸序列异源性彡4 % 的原则，目前分为8个基因型即A，B，C，D，E，F，G和H基因型。我国A、B、C、D 4个基因型 都存在。北方城市以C基因型流行为主，由北方至南方，B基因型感染率逐渐增高，广州和 深圳B基因型和C基因型感染率比例相当，少数民族地区A、D基因型有较高的感染率，西藏 则以D基因型为主。总体来说在我国B和C基因型占了绝大多数，因此HBV B和C基因型 的分型对我们特别重要。目前越来越多的实验证明B、C基因型混合感染率增高，因此，这一 情况值得我们关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种乙型肝炎病毒B和C基因型基因分型和定量检测的方 法，它能在同一反应体系内检测最常见的乙型肝炎病毒B基因型和C基因型，而且可以同时 定量检测，操作简便、快速准确，重复性好、通用性好。本发明的另一目的是提供用于乙型肝炎病毒B和C基因型同时基因分型和定量检 测的试剂盒。在大量分析现有已分型的HBV DNA序列的基础上，找出中国人群大多数感染乙型 肝炎病毒B基因型、C基因型的特异性碱基的规律，采用荧光定量PCR的方法进行检测，既 具有较高的灵敏度，又达到了同时进行分型和定量检测的目的。
本发明所述的乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒，其特征是包括DNA 提取试剂和荧光定量PCR试剂；
其中的DNA提取试剂包括含6 mol/L异硫氰酸胍、30mol/L柠檬酸钠、体积为0. 58%的 十二烷基磺酸钠、1 mol/L乙二胺四乙酸钠、体积为2%的糖原的A液和B液一异丙醇； 其中的荧光定量PCR试剂包括
含 100 mmol/L pH8. 9 的 Tris_HCl、500 mmol/L KC1，体积为 50% 的甘油的 10XPCR 缓 冲液；
浓度为 25mmol/L 的 MgCl2 ；
浓度为5mmol/L的dNTP (三磷酸脱氧核糖核苷)；
浓度为5U/ μ 1的Taq DNA聚合酶；
浓度为IU/ μ 1为UDG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)；
(“U”是一个国际通用酶单位，指在25°C、最适条件下，Imin内能引起1 μ mol底物发生 反应的酶量)
荧光定量PCR试剂还包括下述探针和相对应的引物
乙型肝炎病毒B基因型的引物序列为
HBV B F :AGACTCGTGGTGGACTTC 浓度为 10 μ mol/L
HBV B R :ACAAGAAGATGAGGCATAGC 浓度为 10 μ mol/L
乙型肝炎病毒B基因型的探针序列为
HBV B P :5，TCGCAGTCCCAAATCTCCA 3， 浓度为 3 μ mol/L
荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光受体基因为BHQl的淬 灭基团；
乙型肝炎病毒C基因型的引物序列为 HBV C F :CTTGTTGGTTCTTCTGGACTAC 浓度为 10 μ mol/L L HBV C R :AGGATGATGGGATGGGAATAC 浓度为 10 μ mol/L 乙型肝炎病毒C基因型的探针序列为
HBV C P 5' CCTCTACTTCCAGGAACATCAAC 3' 浓度为 3 μ mol/L
荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是HEX，3’端标记的荧光受体基因为BHQl的淬
灭基团。所述的乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒，还包括乙型肝炎病毒B基因 型标准品(即乙型肝炎病毒B基因型DNA)、浓度IO3-IO9 copies/ml、共7管，乙型肝炎病C基 因型标准品(即乙型肝炎病毒C基因型DNA)、浓度IO3-IO9 copies/ml，共7管。所述的乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒，其所述的DNA提取试剂的A 液为15ml，所述的DNA提取试剂的B液为15ml。所述的乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒，其所述的PCR反应缓冲液为 10XPCR反应缓冲液为1. 25ml、所述的MgCl2为2ml、所述的dNTP为IOOul、所述的Taq DNA 聚合酶为500 μ 1、所述的UDG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)为100 μ 1。所述的乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒，其所述的乙型肝炎病毒B基 因型的引物HBV B F和HBV B R各为0. 1ml，所述的乙型肝炎病毒C基因型的引物HBV C F 和HBV C R各为0. Iml ；所述的乙型肝炎病毒B基因型的探针HBV B P和乙型肝炎病毒C基因型的探针HBV C P各为0. 2ml。本发明所述的乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的方法，其步骤如下
第一步，引物及探针的设计合成，从GenBank (美国国立卫生研究院维护的基因序列数 据库)中找出HBV B基因型和C基因型的全序列进行比对，发现HBV B基因型和C基因型均 在第100-600碱基之间存在型间特异和型内保守的区域，其中HBV B基因型在第321和第 324位点存在与其余基因型间特异的位点，HBV C基因型在第482和第491位点存在与其余 基因型间特异的位点；分别设计引物和对应的特异性探针，引物和各型探针序列分别为 针对乙型肝炎病毒B基因型，其型特异的引物序列为 HBV B F :AGACTCGTGGTGGACTTC HBV B R :ACAAGAAGATGAGGCATAGC 乙型肝炎病毒B基因型，其型特异的探针序列为 HBV B P :5，TCGCAGTCCCAAATCTCCA 3，
荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光受体基因为BHQl的淬 灭基团；
针对乙型肝炎病毒C基因型，其型特异的引物序列为
HBV C F CTTGTTGGTTCTTCTGGACTAC
HBV C R :AGGATGATGGGATGGGAATAC
乙型肝炎病毒C基因型，其型特异的探针序列为
HBV C P :5’ CCTCTACTTCCAGGAACATCAAC 3’
荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是HEX，3’端标记的荧光受体基因为BHQl的淬 灭基团；
引物及探针的合成根据设计好的引物及探针序列，送专业公司合成引物和探针(如上 海生工，英维捷基公司等商业化的引物和探针合成公司)。第二步，临床血清样本的获得，抽取受检者静脉血1ml，注入无菌1.5ml的离心管 中，于室温静置2小时后，取上清转入另一无菌离心管中，即为血清样本；
第三步，提取乙型肝炎病毒DNA，
(1)从本发明所述的乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒中取120μ1 DNA提 取A液注入0. 5ml离心管中，每管分别加入待测的血清样本60 μ 1，混勻，98°C加热10分钟
裂解；
(2)每管加入180μ 1 DNA提取B液，充分混勻，13000rpm/min离心3分钟，弃上清，开 盖室温放置5分钟晾干；
(3)每管加入15μ1双蒸水(即将经过一次蒸馏后的水，再次蒸馏所得到的水)稀释混 悬沉淀，此即获得的乙型肝炎病毒DNA，瞬时离心备用；
第四步，进行荧光定量PCR反应，
(1)在25μ 1 体系中，加入2. 5μ 1 的 10 X PCR 缓冲液，2. 5μ 1 的 25 mmol/L MgCl2,1 μ 1 的5 mmol/L dNTP，各1μ 1的10 μ mol/L的HBV B基因型和C基因型的引物，各2 μ 1的3 μ mol/L的B基因型和C基因型的探针，5 μ 1的5 U/μ 1 Taq酶，2. 5 μ 1的1 U/ μ 1 UNG, 2μ1的双蒸水，最后加入第二步获得的乙型肝炎病毒DNA 2μ 1 ；同时设置没有乙肝病毒 DNA的空白对照，B和C阳性标准品(用于标准曲线的制作)；(2)将上述25 μ 1体系加入PCR管中，盖上管盖，将反应管至于荧光定量PCR检测仪中 (如Bio-Rad公司的CFX96检测仪等)，设定空白对照、B和C阳性标准品、待测血清样本的参 数进行PCR反应；荧光定量PCR扩增条件为95°C 3min- 95°C 10s—退火温度62°C 30s, 其中95°C IOs — 55-65°C 30s之间进行40个循环； 第五步，结果的判定，
在PCR反应系统正常的情况下，即PCR反应结束后荧光定量检测仪在样本管中检测到 > 500个拷贝的乙型肝炎病毒，通过对照标准曲线获得待测样本的乙型肝炎病毒拷贝数， 拷贝数> 500的判定为乙型肝炎病毒感染，其余为阴性。如果只在B基因型的反应管里有 ^ 500个拷贝的荧光信号，那么该标本的基因型就是B型，如果只在C基因型的反应管里有 ^ 500个拷贝的荧光信号，那么该标本的基因型就是C型，如果在B基因型和C基因型的反 应管里同时均有信号，就说明该标本的基因型为B、C混合型。本发明所进行的荧光定量PCR反应可以在同一反应体系中进行，也可以分别进 行，即区分HBV B基因型和C基因型的探针及相对应的引物可以加在同一反应管中进行反 应，也可以分别加在各自的反应管中进行，均可以达到同时分型和定量的目的。本发明所进行的荧光定量PCR反应可以在5μ1以上任一体积体系中进行。本发明的有益效果经过上千份标本的验证，本发明分型准确率> 99%，比全序列 分析比对的方法简单便捷，同时又比常规的PCR及酶切鉴定的方法更准确；本发明还可以 在同一反应体系内同时检测中国人最常见的两个基因型(乙型肝炎病毒B基因型和C基因 型)并且同时可以定量检测，更加节约成本和降低工作量，创新性明显；同时本发明还可以 用于乙型肝炎病毒B基因型和C基因型混合感染情况的检测，为混合感染的鉴定提供快速、 可靠的方法。
具体实施例方式本发明所述的乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒，包括DNA提取试剂和 荧光定量PCR试剂；
其中的DNA提取试剂包括含6 mol/L异硫氰酸胍、30mol/L柠檬酸钠、体积为0. 58% 的十二烷基磺酸钠、1 mol/L乙二胺四乙酸钠、体积为2%的糖原的A液15ml和B液一异丙 醇 15ml ；
其中的荧光定量PCR试剂包括含100 mmol/L pH8. 9的Tris-HCl、500 mmol/L KC1，体 积为50%的甘油的10XPCR缓冲液，1. 25ml ；浓度为25mmol/L的MgCl2，2ml ；浓度为5mmol/ L的dNTP (三磷酸脱氧核糖核苷)，IOOul ；浓度为5U/ μ 1的Taq DNA聚合酶，500 μ 1 ； 浓度为IU/ μ 1为UDG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)，100μ 1 ； 荧光定量PCR试剂还包括下述探针和相对应的引物 乙型肝炎病毒B基因型的引物序列为
HBV B F :AGACTCGTGGTGGACTTC 浓度为 10 μ mol/L, 0. Iml ； HBV B R :ACAAGAAGATGAGGCATAGC 浓度为 10 μ mol/L, 0. Iml ； 乙型肝炎病毒B基因型的探针序列为
HBV B P :5，TCGCAGTCCCAAATCTCCA 3， 浓度为 3 μ mol/L, 0. 2ml ；
荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光受体基因为BHQl的淬灭基团；
乙型肝炎病毒C基因型的引物序列为
HBV C F CTTGTTGGTTCTTCTGGACTAC 浓度为 lOymol/L，0. Iml ； HBV C R :AGGATGATGGGATGGGAATAC 浓度为 10 μ mol/L,0. Iml ； 乙型肝炎病毒C基因型的探针序列为
HBV C P :5，CCTCTACTTCCAGGAACATCAAC 3， 浓度为 3ymol/L，0. 2ml ；
荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是HEX，3’端标记的荧光受体基因为BHQl的淬
灭基团。还包括乙型肝炎病毒B基因型标准品(即乙型肝炎病毒B基因型DNA)、浓度 IO3-IO9 copies/ml、共7管，乙型肝炎病C基因型标准品(即乙型肝炎病毒C基因型DNA)、浓 度 IO3-IO9 copies/ml，共 7 管。
下面是用上述试剂盒进行乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的实施例 实施例一乙型肝炎病毒B基因型和C基因型同时分型和定量检测的方法，其步骤如
下
第一步，引物及探针的设计合成，
引物及探针的设计从GenBank (美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库)中找出 HBV B基因型和C基因型的全序列进行比对，发现HBV B基因型和C基因型均在第100-600 碱基之间存在型间特异和型内保守的区域，其中HBV B基因型在第321和第324位点存在 与其余基因型间特异的位点，HBV C基因型在第482和第491位点存在与其余基因型间特 异的位点；分别设计引物和对应的特异性探针，引物和各型探针序列分别为 针对乙型肝炎病毒B基因型，其型特异的引物序列为 HBV B F :AGACTCGTGGTGGACTTC HBV B R :ACAAGAAGATGAGGCATAGC 乙型肝炎病毒B基因型，其型特异的探针序列为 HBV B P :5， TCGCAGTCCCAAATCTCCA 3，
荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光受体基因为BHQl的淬 灭基团；
针对乙型肝炎病毒C基因型，其型特异的引物序列为
HBV C F CTTGTTGGTTCTTCTGGACTAC
HBV C R :AGGATGATGGGATGGGAATAC
乙型肝炎病毒C基因型，其型特异的探针序列为
HBV C P :5’ CCTCTACTTCCAGGAACATCAAC 3’
荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是HEX，3’端标记的荧光受体基因为BHQl的淬 灭基团；
引物及探针的合成根据设计好的引物及探针序列，送专业公司合成引物和探针(如上 海生工，英维捷基公司等商业化的引物和探针合成公司)。
第二步，临床血清样本的获得，
抽取受检者静脉血Iml，注入无菌1. 5ml的离心管中，于室温静置2小时后，取上清转入另一无菌离心管中，即为血清样本；
第三步，提取乙型肝炎病毒DNA，
(1)从本发明所述的乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒中取120μ1 DNA提 取A液注入0. 5ml离心管中，每管分别加入待测的血清样本60 μ 1，混勻，98°C加热10分钟 裂解；
(2)每管加入180μ 1 DNA提取B液，充分混勻，13000rpm/min离心3分钟，弃上清，开 盖室温放置5分钟晾干；
(3)每管加入15μ1双蒸水(即将经过一次蒸馏后的水，再次蒸馏所得到的水)稀释混 悬沉淀，此即获得的乙型肝炎病毒DNA，瞬时离心备用；
第四步，进行荧光定量PCR反应，
(1)在25μ 1 体系中，加入2. 5μ 1 的 10 X PCR 缓冲液，2. 5μ 1 的 25 mmol/L MgCl2,1 μ 1 的5 mmol/L dNTP，各1μ 1的10 μ mol/L的HBV B基因型和C基因型的引物，各2 μ 1的3 μ mol/L的B基因型和C基因型的探针，5 μ 1的5 U/μ 1 Taq酶，2. 5 μ 1的1 U/ μ 1 UNG, 2μ1的双蒸水，最后加入第二步获得的乙型肝炎病毒DNA 2μ 1 ；同时设置没有乙肝病毒 DNA的空白对照，B和C阳性标准品(用于标准曲线的制作)；
检测B基因型和C基因型，用下面的反应体系
PCR反应液(每人份用量，按25 μ体系)
权利要求
乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒，其特征是包括DNA提取试剂和荧光定量PCR试剂；其中的DNA提取试剂包括含6 mol/L异硫氰酸胍、30mol/L 柠檬酸钠、体积为0.58%的十二烷基磺酸钠、1 mol/L 乙二胺四乙酸钠、体积为2%的糖原的A液和B液－异丙醇；其中的荧光定量PCR试剂包括含100 mmol/L pH8.9的Tris HCl、500 mmol/L KCl，体积为50%的甘油的10×PCR缓冲液；浓度为25mmol/L 的MgCl2；浓度为5mmol/L 的dNTP(三磷酸脱氧核糖核苷)；浓度为5U/μl 的Taq DNA聚合酶；浓度为1U/μl 为UDG酶(尿嘧啶 N 糖基化酶)；荧光定量PCR试剂还包括下述探针和相对应的引物乙型肝炎病毒B基因型的引物序列为HBV B FAGACTCGTGGTGGACTTC 浓度为10μmol/LHBV B RACAAGAAGATGAGGCATAGC浓度为10μmol/L乙型肝炎病毒B基因型的探针序列为HBV B P5’TCGCAGTCCCAAATCTCCA 3’浓度为3μmol/L荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光受体基因为BHQ1的淬灭基团；乙型肝炎病毒C基因型的引物序列为HBV C FCTTGTTGGTTCTTCTGGACTAC 浓度为10μmol/L LHBV C RAGGATGATGGGATGGGAATAC 浓度为10μmol/L乙型肝炎病毒C基因型的探针序列为HBV C P5’CCTCTACTTCCAGGAACATCAAC 3’ 浓度为3μmol/L荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是HEX，3’端标记的荧光受体基因为BHQ1的淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒，其特征是还 包括乙型肝炎病毒B基因型标准品(即乙型肝炎病毒B基因型DNA)、浓度IO3-IO9 copies/ ml、共7管，乙型肝炎病C基因型标准品(即乙型肝炎病毒C基因型DNA)、浓度IO3-IO9 copies/ml，共 7 管。
3.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒，其特征是所 述的DNA提取试剂的A液为15ml，所述的DNA提取试剂的B液为15ml。
4.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒，其特征是所 述的PCR反应缓冲液为10XPCR反应缓冲液为1. 25ml、所述的MgCl2为2ml、所述的dNTP为 100ul、所述的Taq DNA聚合酶为500 μ 1、所述的UDG酶(尿嘧啶_Ν_糖基化酶)为100 μ 1。
5.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒，其特征是所 述的乙型肝炎病毒B基因型的引物HBV B F和HBV B R各为0. lml，所述的乙型肝炎病毒C 基因型的引物HBV C F和HBV C R各为0. Iml ；所述的乙型肝炎病毒B基因型的探针HBV B P和乙型肝炎病毒C基因型的探针HBV C P各为0. 2ml。2
6.乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的方法，其步骤如下第一步，引物及探针的设计合成，从GenBank中找出HBV B基因型和C基因型的全序列 进行比对，发现HBV B基因型和C基因型均在第100-600碱基之间存在型间特异和型内保 守的区域，其中HBV B基因型在第321和第324位点存在与其余基因型间特异的位点，HBV C基因型在第482和第491位点存在与其余基因型间特异的位点；分别设计引物和对应的 特异性探针，引物和各型探针序列分别为针对乙型肝炎病毒B基因型，其型特异的引物序列为HBV B F :AGACTCGTGGTGGACTTCHBV B R :ACAAGAAGATGAGGCATAGC乙型肝炎病毒B基因型，其型特异的探针序列为HBV B P :5， TCGCAGTCCCAAATCTCCA 3，荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光受体基因为BHQl的淬 灭基团；针对乙型肝炎病毒C基因型，其型特异的引物序列为HBV C F CTTGTTGGTTCTTCTGGACTACHBV C R :AGGATGATGGGATGGGAATAC乙型肝炎病毒C基因型，其型特异的探针序列为HBV C P :5’ CCTCTACTTCCAGGAACATCAAC 3’荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是HEX，3’端标记的荧光受体基因为BHQl的淬 灭基团；引物及探针的合成根据设计好的引物及探针序列，送专业公司合成引物和探针； 第二步，临床血清样本的获得，抽取受检者静脉血1ml，注入无菌1. 5ml的离心管中，于 室温静置2小时后，取上清转入另一无菌离心管中，即为血清样本； 第三步，提取乙型肝炎病毒DNA，(1)从本发明所述的乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒中取120μ1 DNA提 取A液注入0. 5ml离心管中，每管分别加入待测的血清样本60 μ 1，混勻，98°C加热10分钟裂解；(2)每管加入180μ 1 DNA提取B液，充分混勻，13000rpm/min离心3分钟，弃上清，开 盖室温放置5分钟晾干；(3)每管加入15μ 1双蒸水稀释混悬沉淀，此即获得的乙型肝炎病毒DNA，瞬时离心备用；第四步，进行荧光定量PCR反应，(1)在25μ1 体系中，加入2. 5μ 1 的 10 X PCR 缓冲液，2. 5μ 1 的 25 mmol/L MgCl2,1 μ 1 的5 mmol/L dNTP，各1μ 1的10 μ mol/L的HBV B基因型和C基因型的引物，各2 μ 1的3 μ mol/L的B基因型和C基因型的探针，5 μ 1的5 U/μ 1 Taq酶，2. 5 μ 1的1 U/ μ 1 UNG, 2μ1的双蒸水，最后加入第二步获得的乙型肝炎病毒DNA 2μ 1 ；同时设置没有乙肝病毒 DNA的空白对照，B和C阳性标准品；(2)将上述25μ 1体系加入PCR管中，盖上管盖，将反应管至于荧光定量PCR检测仪中， 设定空白对照、B和C阳性标准品、待测血清样本的参数进行PCR反应；荧光定量PCR扩增条件为95°C 3min— 95°C IOs —退火温度 62°C 30s，其中 95°C IOs — 55_65°C 30s 之 间进行40个循环；第五步，结果的判定，在PCR反应系统正常的情况下，即PCR反应结束后荧光定量检测仪在样本管中检测到 ≥ 500个拷贝的乙型肝炎病毒，通过对照标准曲线获得待测样本的乙型肝炎病毒拷贝数， 拷贝数> 500的判定为乙型肝炎病毒感染，其余为阴性；如果只在B基因型的反应管里有≥ 500个拷贝的荧光信号，那么该标本的基因型就是 B型，如果只在C基因型的反应管里有≥ 500个拷贝的荧光信号，那么该标本的基因型就是 C型，如果在B基因型和C基因型的反应管里同时均有信号，就说明该标本的基因型为B、C 混合型。
全文摘要
本发明公开一种乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒，包括DNA提取试剂和荧光定量PCR试剂；荧光定量PCR试剂包括乙型肝炎病毒B基因型和C基因型的引物，还包括乙型肝炎病毒B基因型标准品和乙型肝炎病C基因型标准品。本发明还公开一种乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的方法，其步骤如下引物及探针的设计合成，临床血清样本的获得，提取乙型肝炎病毒DNA，进行荧光定量PCR反应，结果的判定。本发明分型准确率≥99%，比全序列分析比对的方法简单便捷，同时又比常规的PCR及酶切鉴定的方法更准确；可以在同一反应体系内同时检测中国人最常见的乙型肝炎病毒B基因型和C基因型，并且同时可以定量检测，更加节约成本和降低工作量，创新性明显。
文档编号C12Q1/70GK101956025SQ20101052417
公开日2011年1月26日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者单幼兰, 张秀瑜, 赵耀, 黄爱龙 申请人:重庆医科大学;黄爱龙;赵耀