人的产生il-17的辅助性t细胞的检测用标记物及试剂、以及人的产生il-17的辅助性t细...的制作方法

专利名称：人的产生il-17的辅助性t细胞的检测用标记物及试剂、以及人的产生il-17的辅助性t细 ...的制作方法
人的产生IL-17的辅助性T细胞的检测用标记物及试剂、以及人的产生IL-17的辅助性T细胞的检测方法
技术领域：
本发明涉及用于检测人的产生IL-17的辅助性T细胞(以下，也称为“Thl7细胞”) 的标记物及试剂、以及检测人Thl7细胞的方法。
背景技术：
慢性类风湿性关节炎(以下，称为“RA”)是以关节炎作为主要的临床症状的全身性的炎症性自身免疫疾病。RA基于如关节的疼痛一样的自觉症状及肿胀的程度、由骨X线的见解等，通过视觉的方法判断其病势，但未确立定量的指标。从而，目前也未确立继续监控治疗效果的定量的方法。RA的发症原因的详细虽不明了，但认为，细菌感染等成为诱因，经免疫细胞群及细胞因子组的复杂的网络，发生关节组织的炎症。担负免疫反应之中心的是辅助性T细胞群。未成熟的辅助性T细胞(幼稚T细胞)一旦从抗原呈递细胞被呈递抗原，则分化成辅助性T细胞，但此时由特定的细胞因子存在，幼稚T细胞分化诱导成4种的细胞种。4种的细胞种是产生干扰素(IFN)-Y的辅助性T细胞(Thl细胞)、产生白细胞介素(IL)-4的辅助性T细胞(Th2细胞)、产生IL-17的辅助性T细胞(Thl7细胞)及有免疫抑制效果的控制性T细胞(Treg细胞)。在这些的辅助性T细胞之中，越来越明了 Thl7细胞可与RA的发症相关。例如，在特开2000-186046号公报(专利文献1)中示，在RA患者的关节滑液中， 相比变形关节炎的患者的关节滑液，IL-17的量更显著地高，RA患者来源的滑液组织中的T 细胞中存在IL-17阳性细胞，因此示IL-17与RA的病态形成、特别是关节-骨破坏深深相关。再者，专利文献1记载，可将IL-17作为RA的诊断标记物来使用。另外，在特开2007-506100号公报(专利文献2)记载，当分析自RA患者的末梢血血清中的细胞因子时，IFN- y、IL-I β、TNF- α、G-CSF, GM-CSF、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、 IL-5及IL-7的水平在RA患者中是显著地高的值，IL_2、CXCL8/IL_8、IL-12及CCL2/MCP-1 是不算高的值。另一方面，对于Thl7 细胞而言，通过 Ivanov 等(Cell, 2006,126,p. 1121-1133 # 专利文献 1) > Stumhofer 等(Nature Immunology, 2006, vol. 7，ρ· 937-945 非专利文献 2)、 Wilson 等(Nature Immunology，2007，vol. 8，ρ· 950-957 非专利文献 3)等的研究，明白了以下的事实。 被称为RORYt的核内受体在Thl7细胞的分化中发挥重要的作用。·*Ι -6、Ι -23&Τ6Ρ-β诱导从未成熟的辅助性T细胞(幼稚T细胞)向Thl7 细胞的分化。 表达 IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-22、IL_26、TNF、IFN-γ、CCL20。 在Thl7细胞的表面存在IL-23受体或IL-12受体β。专利文献1 特开2000-186046号公报
专利文献2 特开2007-506100号公报非专利文献 1 :Ivanov等，"The Orphan Nuclear Receptor RORyt Directs the Differentiation Program of Proinflammatory IL-17+THelper Cells " , Cell,2006, 126，p.1121-1133# 专禾I」JC ^ 2 Stumhofer‘‘ Interleukin 27negatively regulates the development of interleukin 17-producing T helper cells during chronic inflammation of the central nervous system " Nature Immunology,2006, vol.7, p.937-945非专利文献 3 :Wilson 等，"Development, cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T cells" Nature Immunology,2007, vol.8, p. 950-95
发明内容发明要解决的技术课题在上述的非专利文献1 3中，使用利用对于IL-17特异性的抗体的酶联免疫吸附法(ELISA法)来测定IL-17的量。但是认为，通过确立不仅测定IL-17的量，还检测Thl7细胞自体的方法，可更深理解自身免疫疾病、优选是RA和Thl7细胞的关联。本发明人以发现可特异性地检测人Thl7细胞的分子标记物作为目的。解决课题的技术方案本发明人通过从健康的成人的末梢血分离Thl7细胞，鉴定在得到的Thl7细胞中特异性地表达的基因而完成本发明。从而，本发明是人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物，其为有选自下列的至少1种基因的碱基序列的多核苷酸、其变异型及片段由下列组成的编码膜蛋白质的基因ADAM12(ADAM金属肽酶域12)、ANKSlB (锚蛋白重复子及不育α基序域含1B)、ATP6V0A4(ATP酶，H+运输，溶酶体VO亚基a4)、ATP9A(ATP 酶，II类，9A型)、BVES (血管心外膜物质)>C5orf40 (第5染色体开放阅读框40)、CDH4 (钙粘蛋白4，1型，R-钙粘蛋白(视网膜))、DI02(脱碘酶，碘甲状腺原氨酸，II型)、DMD(肌营养不良蛋白)、GPR34(G蛋白-偶联的受体34)、IRS2(胰岛素受体底物2)、KCNE3(钾电压_选通的通道，Isk-相关的家族，成员3)、LlCAM(Li细胞粘着分子)、MCAM(黑色素瘤细胞粘着分子)、MFAP3L(微原纤维-相关的蛋白3-样)、MY07A(肌球蛋白VIIA)、PTPRM(蛋白酪氨酸磷酸酶，受体类型，M)、SHR00M2(shrOOm家族成员2)、SLC16A4 (溶质载体家族 16，成员4( 一元羧酸转运蛋白5))、SLC02B1(溶质载体有机阴离子转运蛋白家族，成员 2B1)、TANC2(三十四肽重复子，锚蛋白重复子及卷曲螺旋含2)、TJPl (紧密连接蛋白1 (闭锁小带1))、TMEM163(跨膜蛋白163)、TNS3(张力蛋白3)、UPKlB(尿路血小板溶素1B)、 WDFY3 (WD重复子及FYVE域含3)、DRD2 (多巴胺受体D2) ,GJCl (缝隙连接蛋白，Y 1，45kDa)、 PGBD5(L0C100134440) (piggyBac可转座元件来源的5 (类似于PGBD5蛋白))、MS4A7(跨膜 4-域，亚家族A，成员7)、0DZ4(odz，odd 0z/ten-m同系物4)、PHKA1 (磷酸化酶激酶，α 1)、 RGSl (G-蛋白信号转导调节物1) ,SHB (Src同源性2域含衔接子蛋白B)、SLC44A3 (溶质载体家族44，成员3)、SLC6A15 (溶质载体家族6 (中性氨基酸转运蛋白)，成员15)、SYNGR3 (突触循环蛋白3)、AKAP12 (A激酶(PRKA)锚蛋白12)、C9orf 125 (第9染色体开放阅读框 125)、DPY19L2 (dpy-19-样2)、HRH4 (组胺受体H4)、MUC20 (粘蛋白20，细胞表面相关的)、 P0PDC3 (popeye域含3)、SORBSl (山梨糖及SH3域含1)、TANCl (三十四肽重复子，锚蛋白重复子及卷曲螺旋含1)、TMEM44(跨膜蛋白44)及UNC13C (imc-13同系物C)；由下列组成的编码分泌蛋白质的基因CXCL13(趋化因子(C_X_C基序)配体13)、 PC0LCE2 (原胶原C-内肽酶增强子2)、PNOC (前原痛敏肽)、SMPDL3A (鞘磷脂磷酸二酯酶， 酸-样3A)、TGFBI (转化生长因子，β -诱导型)、C17orf99 (第17染色体开放阅读框99)、 EBI3 (Epstein-Barr病毒诱导型3)、ILlA (白细胞介素1，α)及WNT3 (无翅-M型MTV整合位点家族，成员3)；由下列组成的编码细胞内蛋白质的基因BCAT1 (支链氨基转移酶1，细胞溶质)、 BHLHE22 (碱性螺旋-环-螺旋家族，成员e22)、C13orfl8 (L0C728970)(第13染色体开放阅读框18 (假定L0C728970))、CA2 (碳酸酐酶II)、CCDC3 (卷曲螺旋域含3)、CDSl (CDP- 二酰甘油合酶(磷脂酸胞苷酰转移酶)1)、CHN1 (嵌合素(嵌合素)1)、CLIC5 (L0C100131610) (氯细胞内通道5(类似于氯细胞内通道5))、CTSH(组织蛋白酶H)、CYP7B1 (细胞色素 P450，家族7，亚家族B，多肽1)、DAPK2 (死亡-相关的蛋白激酶2)、DMRTl (双性及mab-3相关的转录因子1)、DSE (硫酸皮肤素表异构酶)、FBXL17 (F-盒及亮氨酸-富含的重复子蛋白17)、FBXL21 (F-盒及亮氨酸-富含的重复子蛋白21)、FH0D3 (成蛋白同源性2域含3)、 H2AFY2(H2A组蛋白家族，成员Y2)、HLX(H2. 0-样同源异形盒)、IRAK3(白细胞介素_1受体_相关的激酶3)、MACCl (转移相关的in结肠癌1)、MAML3 (策划者-样3)、MY010 (肌球蛋白X)、0TUB2 (0TU域，泛素醛结合2)、PAPSS2 (3 ‘-磷酸腺苷5 ‘-磷酰硫酸合酶2)、 PCBP3(Poly(rC)结合蛋白3 (PCBP3)，转录物变体2)、PDE4DIP (磷酸二酯酶4D相互作用蛋白)、PLDl (磷脂酶Dl，磷脂酰胆碱-特异性)、PPARG (过氧化物酶体增殖子-活化的受体Y)、PTPN13(蛋白酪氨酸磷酸酶，非-受体13型(AP0-1/CD95 (Fas)-相关的磷酸酶))、 RGS18(G-蛋白信号转导调节物 18)、SIMl (single-minded 同系物 1)、SNAI2 (snail 同系物 2)、S0X2(SRY(性别决定区 Y)-盒 2)、SPIREl (spire 同系物 1)、TBC1D12(TBC1 域家族， 成员12)、TGM5(转谷氨酰胺酶5)、TMODl (原肌球调节蛋白1)、TUBB6 (微管蛋白，β 6)、 DDIT4L(DNA-损伤-诱导型转录物4-样)、DHRS9 (脱氢酶/还原酶(SDR家族)成员9)、 ERC2 (ELKS/RAB6-相互作用 /CAST 家族成员 2)、FERMT2 (fermitin 家族同系物 2)、HHEX (造血性地表达的同源异形盒)、HS3ST1 (硫酸乙酰肝素(葡萄糖胺)3-0-磺基转移酶1)、 NR5A2 (核受体亚家族5，组A，成员2) ,PHLDAl (组同源性-样域，家族A，成员1)、RBM20 (RNA 结合基序蛋白 20)、NINL (ninein-样)、RTN2 (reticulon2)、SH3RF2 (SH3 域含环指 2)、 TSHZ2(teashirt锌指同源异形盒2) ,EMLl (棘皮动物微管相关的蛋白样1)、HIST1H2BC (组蛋白簇l，H2bc)、MAP3K4 (丝裂原-活化的蛋白激酶激酶激酶4)、PDK4 (丙酮酸脱氢酶激酶， 同工酶4)、RGS2(G-蛋白信号转导调节物2)及RGS20(G-蛋白信号转导调节物20)；由下列组成的基因Clorfl06(第1染色体开放阅读框106)、C6orf 145 (第6 染色体开放阅读框145)、L0C401097(类似于L0C166075)、MAMLD1(策划者-样域含1)、 ZC3H12C (锌指CCCH-类型含12C)、C12orf64(第1染色体2开放阅读框64)、C6orfl68(第 6染色体开放阅读框168)、CAMSAP1L1 (钙调素调节的血影蛋白-相关的蛋白1_样1)及MAGED4 (MAGED4B)(黑色素瘤抗原家族D，4，(黑色素瘤抗原家族D，4B))、以及包含选自SEQ ID NO 147 151、157 162及167 174的至少一个碱基序列的基因。本发明也提供人Thl7细胞检测用蛋白质标记物，其为由至少1种上述的基因编码的蛋白质、其功能上同等的变异型及片段。再者，本发明提供检测人Thl7细胞的方法，包括在包含人来源的细胞的样品中， 检测至少1种人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物或至少1种人Thl7细胞检测用蛋白质标记物的存在。另外，本发明提供人Thl7细胞检测用试剂，其包含选自下列的至少1种与上述的多核苷酸标记物特异性地杂交的核酸探针；及与上述的蛋白质标记物特异性地结合的，核酸适体、抗体、配体或受体。发明效果通过检测至少1种本发明的人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物或蛋白质标记物， 可特异性地检测人Thl7细胞。另外认为，可检测该患者罹患被认为Thl7细胞相关的疾病、 例如RA等的自身免疫疾病的可能性。

图1是示在1111、1112、1^叩及11117的各细胞中，已知的Thl7细胞特异性表达基因(IL23R、IL17A、IL17F、IL22、IL26&R0RC)的表达量的坐标图。图2是示从MCAM测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。图3是示从PTPRM测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。图4是示从GPR34测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。图5是示从CCR6测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。图6是示从IL-17A测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。图7是示从IFN-Y测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。图8是示从IL-4测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。图9是示从F0XP3测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。实施方式本发明的人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物是有选自上述的基因的至少1种基因的碱基序列的多核苷酸、其变异型及片段。优选是，上述的多核苷酸是有选自下列的至少1种基因的碱基序列的多核苷酸由下列组成的编码膜蛋白质的基因ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES, C5orf40、CDH4、DI02、GPR34、L1CAM、MCAM, PTPRM、SHR00M2、ΤΜΕΜ163、UPK1B、DRD2、 PGBD5 (L0C100134440)、0DZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orfl25、P0PDC3 及 UNC13C ；由下列组成的编码分泌蛋白质的基因PC0LCE2、PNOC, TGFBI及ILlA ；以及由下列组成的编码细胞内蛋白质的基因BHLHE22、PPARG, SIMl及SNAI2。本发明的人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物是发现相比人末梢血来源的其他辅助性T细胞(Thl、Th2及Treg细胞)，在Thl7细胞中特异性地存在的多核苷酸、其变异型或片段。
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从而，通过检测至少1种上述的多核苷酸标记物，可将Thl7细胞与Thl、Th2及 Treg细胞区别而特异性地检测，及检查被认为Thl7细胞相关的疾病的在活体中的活动性指标。在本说明书中，基因与所述技术中一般地使用的用语具有同等的含义，是转录成 mRNA而翻译成蛋白质的基因组上之一部分。在本说明书中，包括选自SEQ ID NO :147 151、157 162及167 174的至少 1个碱基序列的基因是包括各序列编号所示的至少1个碱基序列或与其碱基序列互补的碱基序列的转录成mRNA的基因。S卩，在包含选自SEQ ID NO 147 151、157 162及167 174的至少1个碱基序列的基因中包括包含与选自SEQ ID NO :147 151、157 162及 167 174的至少1个碱基序列互补的碱基序列的基因。在本说明书中，膜蛋白质是指存在于细胞膜，包括在细胞的膜级分的蛋白质。分泌蛋白质是指在细胞内合成，向细胞质膜外分泌的蛋白质。细胞内蛋白质是指其所在位置主要在细胞内的蛋白质。在本说明书中，某多核苷酸在Thl7细胞中“特异性地表达的”是指相比在Thl7细胞以外的细胞的该多核苷酸的表达，在Thl7细胞内的该多核苷酸的表达显著地高。具体而言是指，在Thl7细胞内该多核苷酸的表达是在Thl7细胞以外的细胞的该多核苷酸的表达的约2倍以上。优选是，在Thl7细胞内的该多核苷酸的表达是在Thl7细胞以外的辅助性T细胞(Thl细胞、Th2细胞、Th22细胞及Treg细胞)的该多核苷酸的表达的约2倍以上。本发明的多核苷酸标记物的碱基序列已经公知。这些可知，例如Unigene (由美国国立医学图书馆的国立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information =NCBI)提供的数据库)。本发明的多核苷酸标记物的碱基序列的Unigene编码示于表9。在本说明书中，多核苷酸的“变异型”是指导入了不变化由上述的基因编码的蛋白质的性质的变异的多核苷酸。这样的变异包括在上述的基因的碱基序列中的1或多个核苷酸的缺失或取代、或者1或多个核苷酸的附加。在本说明书中，多核苷酸的“片段”是指连续具有上述的基因的碱基序列之一部分，可与后述的人Thl7细胞检测用核酸探针特异性地杂交的长度的多核苷酸。作为本发明的人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物的多核苷酸的变异型与上述的各基因的碱基序列有通常至少80%、优选是至少85%、更优选是至少90%、特别更优选是至少95%的序列相同性。在本说明书中，碱基序列及氨基酸序列的序列相同性是将BLASTN、BLASTP、BLASTX 或TBLASTN(例如，可从http://www. ncbi.nlm.nih. gov利用)用标准设定使用而算出。上述的多核苷酸标记物是DNA或RNA之任何也可，是上述的基因本身(DNA)、mRNA、 cDNA或cRNA之任何也可。通过检测至少1种由上述的基因编码的蛋白质，也可检测人Thl7细胞。从而，作为由至少1种上述的基因编码的蛋白质、其功能上同等的变异型及片段的人Thl7细胞检测用蛋白质标记物也是本发明之一。优选是，上述的蛋白质是由选自下列的至少1种基因编码的蛋白质
由下列组成的编码膜蛋白质的基因ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES, C5orf40、CDH4、DI02、GPR34、L1CAM、MCAM, PTPRM、SHR00M2、ΤΜΕΜ163、UPK1B、DRD2、 PGBD5 (L0C100134440)、0DZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orfl25、P0PDC3 及 UNC13C ；由下列组成的编码分泌蛋白质的基因PC0LCE2、PNOC, TGFBI及ILlA ；以及由下列组成的编码细胞内蛋白质的基因BHLHE22、PPARG、SIM1及SNAI2。更优选是，上述的蛋白质是由选自下列的至少1种基因编码的膜蛋白质GPR34、 MCAM 及 PTPRM。这样的蛋白质标记物的氨基酸序列可基于从上述的Unigene等得到的多核苷酸标记物的碱基序列知。另外，也可从由如上所述的NCBI提供的数据库知。对于本发明的人 Thl7细胞检测用蛋白质标记物的氨基酸序列的NCBI的编码编号示于表9。上述的人Thl7细胞检测用蛋白质标记物是由至少1种上述的基因编码的蛋白质、 其功能上同等的变异型及片段。在本说明书中，蛋白质的“功能上同等的变异型”是指导入了不变化蛋白质的功能的变异的蛋白质。这样的变异包括在公知的蛋白质的氨基酸序列中1或多个氨基酸的缺失或取代、或者1或多个氨基酸的附加。在本说明书中，蛋白质的“片段”是指连续具有由上述的基因编码的蛋白质或其功能上同等的变异型的氨基酸序列之一部分，可与后述的人Thl7细胞检测用的核酸适体、抗体、配体或受体特异性地结合的蛋白质。作为本发明的人Thl7细胞检测用蛋白质标记物的蛋白质的功能上同等的变异型与由上述的基因编码的蛋白质的公知的氨基酸序列有通常至少80%、优选是至少85%、更优选是至少90%、特别更优选是至少95%的序列相同性。可与本发明的人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物特异性地杂交的分子由于可为了检测该标记物而使用，所以作为人Thl7细胞检测用探针有用。该探针是可与上述的多核苷酸标记物特异性地杂交的DNA、RNA等的核酸探针、肽探针之任何也可。人Thl7细胞检测用探针而言，优选为用于检测多核苷酸标记物的核酸探针、特别是DNA探针。在本说明书中，“可特异性地杂交”是指在严格的条件下可与目标核酸分子(上述的多核苷酸标记物)杂交。在本说明书中，严格的条件是指人Thl7细胞检测用探针可与目标多核苷酸标记物，以相比该目标多核苷酸标记物以外的多核苷酸更可检测的大的程度(例如，超背景的至少2倍)杂交的条件。再有，严格的条件通常是序列依赖性的，然后在各种的环境中不同。一般而言，严格的条件选择为相比在规定的离子强度及PH的特定的序列的热的熔点(thermal melting point)更低约5°C。此Tm是(以规定的离子强度、pH及核酸组成之下)与上述的目标序列互补的探针的50%平衡而杂交的温度。这样的条件是以往公知的多核苷酸的杂交法、例如PCR法、微阵列法、DNA印迹法等中，在多核苷酸的杂交中使用的条件也可。具体而言，pH 7. 0 9. 0而，盐浓度相比约1. 5M Na离子更低，更具体而言，可例举是约0.01 l.OMNa离子浓度(或者其他盐)，至少约30°C的条件。例如，在微阵列法中的严格的条件包括于37°C在50%甲酰胺、IM NaClU % SDS中的杂交、及在60 65°C的在0. IXSSC中的清洗。另外，在PCR法中的严格的条件可例举pH7 9、0. 01 0. IM的Tris HC1、0.05 0. 15MK离子浓度(或者其他盐)、至少约55°C的条件。上述的人Thl7细胞检测用核酸探针的序列可由本领域技术人员适宜确定为，基
于所述技术常识及上述的多核苷酸标记物的序列，可与上述的多核苷酸标记物特异性地杂 、-父。上述的人Thl7细胞检测用核酸探针可使用例如，从一般而言利用可能的引物设计软件(例如，可禾1J 用 Primer3 (http//frodo. wi. mit. edu/cgi-bin/primer3/primer3. cgi)或DNASIS Pro(日立软件工程股份公司))来确定。上述的人Thl7细胞检测用核酸探针可通过所述技术中公知的多核苷酸的合成方法来制备。上述的人Thl7细胞检测用核酸探针用所述技术中通常使用的标记物质标记也可。通过使用标记的该探针，可简便地进行人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物的检测、即人Thl7细胞的检测。上述的标记物质可为32P等的放射性同位素、荧光素等的荧光物质、碱性磷酸酶、 辣根过氧化物酶等的酶、生物素等的所述技术中通常使用的标记物质。上述的人Thl7细胞检测用核酸探针可通过使用仅1种，或者将多种组合使用而特异性地检测人Thl7细胞。例如，通过使用所述技术中公知的方法将该探针1种以上固定化到基板上，可制备用于检测人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物的DNA芯片或微阵列。上述的人Thl7细胞检测用核酸探针可为用于通过例如PCR法等的核酸扩增法扩增上述的多核苷酸标记物的2种以上的引物的组。可与本发明的人Thl7细胞检测用蛋白质标记物特异性地结合的分子由于可为了检测该标记物而使用，所以在检测人Thl7细胞中有用。这样的分子也可为可与人Thl7细胞检测用蛋白质标记物特异性地结合的DNA、RNA等的核酸适体、抗体、配体或受体等之任何， 但优选是抗体。另外，在人Thl7细胞检测用蛋白质标记物是酶时，通过使该酶与底物作用而发色、发光、发生荧光等而可检测该标记物。上述的人Thl7细胞检测用抗体可例如，通过如下所述的以往公知的顺序来制备。 基于上述的人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物的碱基序列或蛋白质标记物的氨基酸序列，将编码有蛋白质标记物的氨基酸序列的蛋白质的DNA分子导入适宜的表达载体。将得到的表达载体导入适宜的宿主细胞，培养得到的转化细胞，得到目的的蛋白质。将得到的蛋白质纯化而作为免疫原，使用免疫原和根据需要佐剂，免疫适宜的哺乳动物、例如大鼠、小鼠等。从免疫的动物的脾脏细胞等，通过筛选选择产生针对目的的免疫原的抗体的抗体产生细胞。将得到的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合而得杂交瘤，通过将其筛选，可得产生与由上述的基因编码的蛋白质有特异性结合性的抗体的产生抗体的杂交瘤。通过培养得到的抗体产生杂交瘤，可得目的的抗体。可为了检测上述的人Thl7细胞而使用的核酸适体可通过例如，如下所述的以往公知的顺序来制备。通过公知的方法制成有随机的核酸的碱基序列的核酸库，通过试管内进化法(SELEX法)等可选择可与目标的蛋白质(上述的蛋白质标记物)特异性地结合的适体。可与上述的人Thl7细胞检测用蛋白质标记物特异性地结合的分子也可通过所述技术中通常使用的标记物质来标记。通过使用标记的人Thl7细胞检测用抗体，可简便地进行人Thl7细胞检测用蛋白质标记物的检测、即人Thl7细胞的检测。上述的标记物质可为32P等的放射性同位素、荧光素等的荧光物质、碱性磷酸酶、 辣根过氧化物酶等的酶、生物素等的所述技术中通常使用的标记物质。通过在包含人来源的细胞的样品中，检测至少1种人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物或至少1种人Thl7细胞检测用蛋白质标记物的存在而检测人Thl7细胞的方法也包括在本发明的范围内。在此方法中，从提高检测灵敏度的观点，优选为检测多种人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物或人Thl7细胞检测用蛋白质标记物的存在。在本发明的检测人Thl7细胞的方法中，包含人来源的细胞的样品而言，可例举包括从人采集的活体样品或人工地培养的人细胞的样品。活体样品而言，可例举血液、组织、 关节液、脑脊髓液、胸水、腹水等。对检测人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物的存在的方法某实施方式进行说明。首先，从包含人来源的细胞的样品，通过使用苯酚提取及乙醇沉淀、市售的DNA提取试剂盒等的所述技术中公知的方法来提取核酸(DNA或RNA)。接下来，检测得到的核酸样品中的上述的多核苷酸标记物的存在。在此检测中，优选为使用上述的人Thl7细胞检测用核酸探针。特别是，通过PCR法、RT-PCR法、实时PCR 法、LAMP (环-介导的等温扩增)法等的核酸扩增法检测上述的多核苷酸标记物的存在时， 人Thl7细胞检测用核酸探针而言，优选为使用用于通过核酸扩增法扩增该多核苷酸标记物的引物组。另外，人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物的存在也可通过如Southern杂交、 Northern杂交、FISH(荧光原位杂交)一样的杂交法、DNA芯片或微阵列法等的所述技术中公知的方法来检测。这些的方法在上述的严格的条件下进行，通过检测上述的标记物质等检测上述的人Thl7细胞检测用核酸探针形成杂交体，从而可检测多核苷酸标记物的存在。接下来，对检测人Thl7细胞检测用蛋白质标记物的存在的方法的某实施方式进行说明。例如，当作为检测对象的人Thl7细胞检测用蛋白质标记物是在细胞内存在的蛋白质时，使用所述技术中公知的方法，从包含人来源细胞的样品提取蛋白质。从该样品的蛋白质的提取可通过超声波的细胞的破碎、使用细胞可溶化液的可溶化等的公知的方法来进行。然后，使用与该蛋白质标记物特异性地结合的分子，可检测得到的蛋白质提取液中的上述的蛋白质标记物。具体而言，人Thl7细胞检测用蛋白质标记物可通过ELISA法、蛋白印记法等的所述技术中公知的方法来检测。在检测中，与上述的蛋白质标记物特异性地结合的分子优选为上述的核酸适体、抗体、配体或受体、优选是使用上述的人Thl7细胞检测用抗体。例如，当作为检测对象的人Thl7细胞检测用蛋白质标记物是分泌蛋白质时，使用与该蛋白质标记物特异性地结合的分子，可检测分泌到包含上述细胞的样品中的蛋白质标记物。
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另外，从包含人来源的细胞的样品采集细胞(淋巴细胞)，使用抗CD3抗体、抗 CD28抗体、伴刀豆球蛋白A、PHA(植物凝血素)、PMA(肉豆蔻酰乙酸佛波酯)、离子霉素等刺激采集的细胞之后，使用与蛋白质标记物特异性地结合的分子，可检测分泌的蛋白质标记物。具体而言，人Thl7细胞检测用蛋白质标记物可通过ELISA法、蛋白印记法等的所述技术中公知的方法来检测。在检测中，与上述的蛋白质标记物特异性地结合的分子优选为上述的核酸适体、抗体、配体或受体、优选是使用上述的人Thl7细胞检测用抗体。例如，当作为检测对象的人Thl7细胞检测用蛋白质标记物是在细胞的表面存在的蛋白质时，使用与该蛋白质标记物特异性地结合的分子，可检测在包含人来源的细胞的样品中的细胞的表面存在的蛋白质标记物。另外，从包含人来源的细胞的样品采集细胞的膜级分，使用与上述的蛋白质标记物特异性地结合的分子，可检测得到的膜级分中的该蛋白质标记物。具体而言，可通过基于 ELISA法、蛋白印记法、流式细胞术(FCM)的方法等的所述技术中公知的方法来检测。在检测中，与上述的蛋白质标记物特异性地结合的分子优选为上述的核酸适体、抗体、配体或受体、优选是使用上述的人Thl7细胞检测用抗体。例如，通过FCM检测人Thl7细胞检测用蛋白质标记物时，可通过如下所述的顺序进行检测。首先，使包含人来源的细胞的样品与用适宜的标记物质标记的上述的人Thl7细胞检测用抗体接触。只要存在，人Thl7细胞与此标记的抗体在细胞表面结合。从而，通过使包含与标记物质结合的细胞的样品通过流式细胞仪，可检测人Thl7细胞。另外，根据需要，也可将与标记物质结合的人Thl7细胞使用细胞分选仪来瓣别-分离。这样的基于FCM的方法被本领域技术人员公知，反应的条件可由本领域技术人员适宜确定。可在上述的本发明的检测人Thl7细胞的方法中使用的，人Thl7细胞检测用试剂也是本发明之一。那样的试剂包含选自下列的至少1种与上述的人Thl7细胞检测用多核苷酸标记物特异性地杂交的核酸探针、以及与上述的人Thl7细胞检测用蛋白质标记物特异性地结合的核酸适体、抗体、配体及受体。
实施例以下通过实施例详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。实施例1在人末梢血来源培养Thl7细胞中的高表达基因的解析1.从人末梢血的Thl、Th2、Treg及Thl7细胞的单离(1)从人末梢血的Thl、Th2及Thl7细胞的单离从健康的成人的末梢血得到的血沉棕黄层覆盖到Ficoll-paque plus溶液(GE HEALTHCARE Bioscience股份公司)上，通过将其离心分离，得到单核细胞级分。接下来，使用结合抗⑶4抗体的磁珠(Miltenyi Biotec公司)，从上述的级分粗纯化⑶4阳性细胞。将如此得到的CD4阳性细胞使用表1所示的荧光标记抗体染色之后，使用细胞分选仪(FACS Aria =Becton Dickinson公司)，分离ThU Th2及Thl7的各细胞。另外，分离的选通如表2所示进行。表1
权利要求
1.人的产生IL-17的辅助性T细胞的检测用多核苷酸标记物，其为有选自下列的至少 1种基因的碱基序列的多核苷酸、其变异型及片段由下列组成的编码膜蛋白质的基因ADAM12、ANKSlB、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、 CDH4、DI02、DMD、GPR34、IRS2、KCNE3、L1CAM、MCAM、MFAP3L、MY07A、PTPRM、SHR00M2、SLC16A4、 SLC02B1、TANC2、TJPU TMEM163、TNS3、UPK1B、WDFY3、DRD2、GJCU PGBD5 (L0C100134440)、 MS4A7、0DZ4、PHKAl、RGSl、SHB, SLC44A3、SLC6A15、SYNGR3、ΑΚΑΡ12、C9orfl25、DPY19L2、 HRH4、MUC20、P0PDC3、SORBSl、TANCl、ΤΜΕΜ44 及 UNC13C ；由下列组成的编码分泌蛋白质的基因CXCLl3、PC0LCE2、PNOC、SMPDL3A、TGFBI、 C17orf99、EBI3、ILlA 及 WNT3 ；由下列组成的编码细胞内蛋白质的基因BCAT1、BHLHE22、C13orf 18 (L0C728970)、 CA2、CCDC3、CDSl、CHNl、CLIC5 (L0C100131610)、CTSH、CYP7B1、DAPK2、DMRTl、DSE、FBXLl7、 FBXL21、FH0D3、H2AFY2、HLX、IRAK3、MACCl、MAML3、MYOlO、0TUB2、PAPSS2、PCBP3、PDE4DIP、 PLDl、PPARG, PTPNl3, RGS18、SIMl、SNAI2, S0X2、SPIREl、TBC1D12、TGM5、TMODl、TUBB6、 DDIT4L、DHRS9、ERC2、FERMT2、HHEX, HS3ST1、NR5A2、PHLDAl、RBM20、NINL、RTN2、SH3RF2、 TSHZ2、EML1、HIST1H2BC、MAP3K4、PDK4、RGS2 及 RGS20 ；由下列组成的基因:Clorfl06、C6orfl45、L0C401097、MAMLDU ZC3H12C、C12orf64、 C6orfl68、CAMSAPILl 及 MAGED4 (MAGED4B)、以及包含选自SEQ ID NO 147 151、157 162及167 174的至少一个碱基序列的基因。
2.权利要求1所述的人的产生IL-17的辅助性T细胞的检测用多核苷酸标记物，其中上述多核苷酸是有选自下列的至少1种基因的碱基序列的多核苷酸由下列组成的编码膜蛋白质的基因ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES, C5orf40、CDH4、 DI02、GPR34、L1CAM、MCAM、PTPRM、SHR00M2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5 (L0C100134440)、 0DZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orfl25、P0PDC3 及 UNC13C ；由下列组成的编码分泌蛋白质的基因PC0LCE2、PNOC、TGFBI及ILlA ；以及由下列组成的编码细胞内蛋白质的基因BHLHE22、PPARG、SIM1及SNAI2。
3.人的产生IL-17的辅助性T细胞的检测用蛋白质标记物，其为由权利要求1所述的至少1种基因编码的蛋白质、其功能上同等的变异型及片段。
4.权利要求3所述的人的产生IL-17的辅助性T细胞的检测用蛋白质标记物，其中上述蛋白质是由选自下列的至少1种基因编码的蛋白质由下列组成的编码膜蛋白质的基因ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES, C5orf40、CDH4、 DI02、GPR34、L1CAM、MCAM、PTPRM、SHR00M2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5 (L0C100134440)、 0DZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orfl25、P0PDC3 及 UNC13C ；由下列组成的编码分泌蛋白质的基因PC0LCE2、PNOC、TGFBI及ILlA ；以及由下列组成的编码细胞内蛋白质的基因BHLHE22、PPARG、SIM1及SNAI2。
5.权利要求4所述的人的产生IL-17的辅助性T细胞的检测用蛋白质标记物，其中上述蛋白质是由选自下列的至少1种基因编码的膜蛋白质GPR34、MCAM及PTPRM。
6.检测人的产生IL-17的辅助性T细胞的方法，其包括在包含人来源的细胞的样品中，检测至少1种权利要求1所述的Thl7细胞检测用多核苷酸标记物或至少1种权利要求3所述的Thl7细胞检测用蛋白质标记物的存在。
7.权利要求6所述的方法，其使用与上述多核苷酸标记物特异性地杂交的核酸探针来检测上述多核苷酸标记物。
8.权利要求7所述的方法，其中上述核酸探针是用于将上述多核苷酸标记物通过核酸扩增法扩增的引物组。
9.权利要求6所述的方法，其使用与上述蛋白质标记物特异性地结合的核酸适体、抗体、配体或受体来检测上述多核苷酸标记物。
10.人的产生IL-17的辅助性T细胞的检测用试剂，其包含选自下列的至少1种 与权利要求1所述的多核苷酸标记物特异性地杂交的核酸探针；及与权利要求3所述的蛋白质标记物特异性地结合的核酸适体、抗体、配体或受体。
全文摘要
本发明涉及可特异性地检测人的产生IL-17的辅助性T细胞(人Th17细胞)的标记物、特异性地检测人Th17细胞的方法及人Th17细胞检测用试剂。
文档编号C12Q1/68GK102482667SQ20108003987
公开日2012年5月30日 申请日期2010年7月29日 优先权日2009年7月29日
发明者仓田宽一, 冈泽贵裕, 宇贺均, 宫本佳昭, 柳田匡俊, 池田昌郁, 田中聪, 门胁正和 申请人:希森美康株式会社