用于检测细胞中的替代性端粒延长(alt)活性的方法和测定法的制作方法

专利名称：用于检测细胞中的替代性端粒延长(alt)活性的方法和测定法的制作方法
技术领域：
本发明总体来说涉及用于检测细胞的活性替代性端粒延长(AlternativeLengthening of Telomeres) (ALT)活性的方法和测定法。更具体地,在脊椎动物细胞中,本发明的方法和测定法包括检测部分双链端粒环。本发明的方法特别用于疾病诊断、疾病状态的确定、治疗方案功效的分析和新型治疗剂的鉴定。
背景技术：
体细胞具有有限的增殖能力。端粒在调控细胞分裂，特别是细胞谱系 可经历的细胞分裂的数目中的作用是至关重要的。端粒是重复DNA序列，通常在线性染色体的末端在一条链上富含G(在互补链上富含C)。在人(实际上在大多数脊椎动物)中，染色体端粒通常包括数千拷贝的序列(5' -TTAGGG-3' )n。通常地，端粒随着每一轮细胞分裂缩短，至少部分归因于线性染色体末端的不完全复制。当端粒变得太短时，这诱发正常的细胞DNA损伤修复途径。一系列复杂的生物化学和形态学变化跟着发生，导致细胞周期停滞和细胞死亡通过复制性衰老或通过程序化细胞死亡例如细胞凋亡。衰老和细胞凋亡各自构成调控细胞增殖的主要途径。这些过程在例如抑制肿瘤发生以及更一般地限制疾病进展中是有益的(参见，例如，Collado等人，2005)。在特征在于异常细胞增殖的病理学状况例如癌症中，正常的老化和细胞凋亡途径被避开，从而使细胞能够变得永生。广义上来说，两个替代性端粒维持机制(alternative telomere maintenancemechanism)被癌细胞用于抵抗通常伴随线性染色体复制的固有端粒丢失。第一个机制包括使用逆转录酶端粒酶从RNA模板合成新端粒DNA。可选择地，端粒可通过被称为替代性端粒延长(ALT) (Bryan等人，1995 ;Bryan等人，1997)的端粒酶非依赖性过程得到维持。ALT机制包括使用相同端粒或另一个端粒，或可能地染色体外端粒DNA作为拷贝模板的重组依赖性DNA复制(参见，例如，Henson等人，2002)。ALT产生端粒长度的突然的大的增加，与长线性端粒模板或滚环机制例如滚环扩增(RCA)相一致。许多人肿瘤的细胞利用ALT，特别是在脑、骨和结缔组织中产生的那些(参见，例如，Bryan 等人，1997 ;Hakin_Smith 等人,2003 ；Henson 等人,2005 ；Ulaner 等人,2003 ；Villa等人，2008)，但ALT在许多癌症中的作用和重要性的完全程度仍然未被完全阐明。对患有ALT[+]癌症的患者的预后通常是不良的，生存中值在2至5年之间。端粒酶和ALT都代表了用于抗癌治疗的有吸引性的靶，并且日益认识到对于许多癌症，期望具有供我们任意使用的特异于ALT [+]细胞的疗法和特异于端粒酶[+]细胞的疗法。一个个体的特定癌症类型的癌细胞可能利用端粒酶来维持端粒，而另一个个体中的相同癌症类型的细胞可能利用ALT，事实上单个肿瘤内的细胞可能利用不同的端粒维持机制。也有人认为癌细胞在某些条件下可具有在端粒酶诱导的端粒维持与ALT之间转换的能力，从而产生了如下可能随着端粒酶特异性癌症疗法在临床应用中增加，ALT[+]癌细胞的患病率可能增加。因此，随着ALT-特异性和端粒酶特异性疗法的发展，确定在任何给定个体中癌症是ALT[+]还是端粒酶[+]将变得愈来愈重要。
还存在对能够抑制ALT的适当治疗剂的鉴定和开发的需要。还存在对ALT激活剂的鉴定和开发的需要，以诱导细胞永生化并用于例如研究衰老。然而阻碍这样的努力的是目前不存在已知的特异于ALT的酶活性或蛋白质。迄今为止，以例如通过在端粒酶不存在的情况下在许多群体倍增过程中平均端粒长度的维持间接地证明了 ALT活性。还通过观察ALT[+]细胞的个别端粒长度或其它特征的快速变化、高度异质的端粒长度分布的存在、增加的端粒重组和前髓细胞性白血病核小体中端粒DNA的存在来推断ALT的存在。ALT活性的当前测定法没有一个适合用于ALT抑制剂的筛选，所述筛选需要对ALT活性的变化作出快速和线性反应的简单的确定性的测定法。癌症患者的ALT活性的检测目前需要肿瘤样品或活检组织的可用性；可用的技术缺乏反应性(responsiveness)和/或灵敏度,通常不适合在常规病理实验室中使用。存在对基于特异于ALT [+]细胞的参数的ALT活性的准确、可靠和快速反应测定法 的开发的明确需要。如本文中所公开的，本发明人已发现部分双链端粒DNA环的存在对于细胞内的活性ALT机制是高度特异性的并且是其定量标志。发明概述根据本发明的第一方面，提供了用于确定细胞是否具有活性ALT机制的方法，所述方法包括测定部分双链端粒环的存在，其中所述端粒环的存在特异于包含活性ALT机制的细胞。在其中细胞为脊椎动物细胞的实施方案中，部分双链端粒环通常在环状链上包含序列(CCCTAA)1J^重复并在线性链上包含序列(TTAGGG)1J^重复。部分双链端粒环可在环状链上包含序列(TTAGGG)1J^重复并在线性链上包含序列(CCCTAA)1J^重复。环状和/或线性链可包含变异和/或突变的端粒重复序列。环状和/或线性链还可包含非端粒序列。所述细胞可以是癌细胞。所述细胞可来源于患有、怀疑患有与异常细胞增殖相关的疾病或病况或对所述疾病或病况易感的受试者。所述疾病或病况可以是癌症。所述癌症可以选自例如肉瘤、母细胞瘤、癌、间皮瘤或星形细胞瘤。所述肉瘤可以是骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脂肪肉瘤、滑膜肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤或平滑肌肉瘤。所述母细胞瘤可以是神经母细胞瘤。所述癌可以是非小细胞肺癌例如肺腺癌或乳腺癌。所述间皮瘤可以是腹膜间皮瘤。所述星形细胞瘤可以是低级星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤(anaplastic astrocytoma)或多形性胶质母细胞瘤。可直接或间接检测部分双链端粒环。例如，可使用部分双链环的环状链作为模板在滚环扩增后间接检测。在一个实施方案中，检测包括(a)任选地从细胞分离DNA ；(b)在适当的条件下在DNA聚合酶和一种或多种dNTP存在的情况下温育DNA以便聚合酶介导的从不完全(线性)链的延伸产生单链端粒DNA的多联体；和(c)检测所述多联体。可通过任何适当的方法例如杂交、测序、PCR、分子信标、核酸酶例如DNA partzyme或通过在温育步骤(b)中掺入适当标记的dNTP来检测所述多联体。所述DNA聚合酶可以是例如小29DNA聚合酶。一般地，当所述部分双链端粒环在环状链上包括序列(CCCTAA)n的重复时，所述dNTP由dATP、dGTP和dTTP以及任选地dCTP组成。根据上述方面，部分双链端粒环的检测可以是存在于细胞内的所述环的检测，或可选择地可包括生物样品例如来源于受试者的生物样品中所述环的检测。检测可以是直接的或间接的。所述生物样品可包括例如血液、尿、痰、胸膜液、腹膜液、支气管和支气管肺泡灌洗液或组织切片。可以例如通过细针抽吸活组织检查获得样品。血液可以是全血、血清或血浆。本发明的第二方面提供了用于测定细胞中的ALT活性水平的方法，所述方法包括测定部分双链端粒环的量，其中所述环的量表示细胞中的ALT活性的水平。所述细胞可以是癌细胞。 本发明的第三方面提供了用于测定受试者的癌症的ALT状态的方法，所述方法包括(a)从受试者获得样品；和(b)测定样品的部分双链端粒环的存在，其中所述环的存在表示癌细胞具有ALT活性，并且所述环的不存在表示癌细胞不具有ALT活性。方法还可包括测定样品中部分双链端粒环的量，从而定量癌细胞的ALT活性的水平和/或样品中ALT[+]细胞的量或比例。癌症可选自例如肉瘤、母细胞瘤、癌、间皮瘤或星形细胞瘤。所述肉瘤可以是骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脂肪肉瘤、滑膜肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤或平滑肌肉瘤。所述母细胞瘤可以是神经母细胞瘤。所述癌可以是非小细胞肺癌例如肺腺癌、乳腺癌、胃癌、肾上腺皮质癌、卵巢癌或黑素瘤。所述间皮瘤是腹膜间皮瘤。所述星形细胞瘤可以是低级星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤。本发明的第四方面提供了诊断受试者的癌症或预测其发作的方法，其中所述癌症显示ALT活性,所述方法包括(a)从受试者获得样品；和(b)测定样品的部分双链端粒环的存在和/或量，其中所述环的存在和/或量表示受试者患有癌症或受试者的癌症发作的可能性。仅作为例子，受试者可被怀疑患有癌症，或易于患所述癌症或对其易感，可具有一个或多个发生癌症的高风险因子或可患有癌症倾向综合征(cancer predispositionsyndrome),例如维尔纳综合征、罗-汤二氏综合征(Rothmund-Thomson Syndrome)或李佛美尼综合征。所述方法可用作这类受试者的筛查程序的一部分，或用于更广群体的筛查程序。本发明的第五方面提供了用于测定患有显示ALT活性的癌症的受试者的疾病控制的方法，所述方法包括(a)从受:试者获得样品；和(b)测定样品的部分双链端粒环的存在，其中所述环的存在表示受试者的疾病控制。通常，受试者可以经历或已经历癌症的治疗例如手术、化学疗法或放射疗法。所述方法还可包括在一段时间内监控受试者的疾病控制，包括在一段时间内重复步骤(a)和(b)至少一次，和确定所述环的存在和/或量在该段时间内是否改变。本发明的第六方面提供了用于评估患有显示ALT活性的癌症的受试者的治疗方案的功效的方法，所述方法包括(a)使用适当的抗癌治疗方案治疗受试者，持续足以评估所述方案的功效的时间段；(b)从受试者获得样品；(C)测定样品的部分双链端粒环的存在和/或量；(d)在一段时间内重复步骤(b)和(C)至少一次；和(e)确定所述环的存在和/或量在该段时间内是否改变，其中所述环的存在和/或量的改变表示受试者的疾病控制的改变和治疗方案的功效的程度。本发明的第七方面提供了设计用于患有癌症的受试者的适当治疗方案的方法，所述方法包括确定部分双链端粒环在来源于受试者的样品中的存在或不存在，其中所述环的存在表示ALT [+]癌，从而指示需要ALT特异性治疗方案。所述环的不存在可以表示端粒酶[+]癌，从而指示需要端粒酶特异性治疗方案。本发明的第八方面提供了设计用于患有显示ALT活性的癌症的受试者的适当治疗方案的方法，所述方法包括在用于治疗癌症的治疗方案存在或不存在的情况下按照上述任意方面监控部分双链端粒环在受试者的样品中的存在和/或不存在，和调整治疗方案的本性、时间安排和/或强度，以减少或消除所述环，其中所述环的减少或消除表示ALT活性的抑制。本发明的第九方面提供了用于治疗患有显示ALT活性的癌症的受试者的方法，包括给受试者施用按照第七或第八方面设计的治疗方案。本发明的第十方面提供了用于鉴定适合调节细胞中的ALT活性的化合物的方法，所述方法包括(a)提供一种或多种显示或能够显示ALT活性的细胞；(b)按照上述任意方面测量部分双链端粒环的量；(C)将所述一种或多种细胞与候选化合物接触；和(d)根据上述任意方面测定所述环的量，其中步骤(b)与(d)之间的所述环的量的变化表示候选化合物调节ALT活性的能力。步骤(b)与(d)之间的所述环的量的减少表示候选化合物抑制ALT活性的能力，而步骤(b)与(d)之间所述环的量的增加表示候选化合物激活ALT活性的能力。候选化合物可以是例如抗癌剂、假定的抗癌剂或抗衰老化合物。抗衰老化合物包括抗细胞或抗复制衰老化合物，或抗程序化细胞死亡化合物例如抗细胞凋亡化合物。本领域技术人员将理解，上述方面和实施方案可以指癌症的诊断、评价和治疗，这些方面和实施方案也适用于与异常细胞增殖相关的其它疾病(其中ALT活性被患病细胞用作维持端粒长度的手段)的诊断、评价和治疗。本发明中包括的方法特别适合于分析人细胞的ALT活性和测定人疾病例如癌症的ALT活性水平。然而，本发明不限定于这些并且扩展至分析任何在线性染色体末端上包含端粒序列的物种的细胞和受试者的ALT。常见地所述细胞为真核细胞，更常见地为脊椎动物细胞，更具体地为哺乳动物细胞。附图概述现参考附图，仅以非限定性实例的方式描述本发明，其中图I是按照本发明的实施方案利用滚环扩增(RCA)的测定法的示意性举例说明。图2举例说明了检测ALT[+]细胞的C-环。A :来自ALT [+] IIICF/c细胞但非TE-85ALT [-]细胞的30ng基因组DNA的C-环(CC)测定产生G-链产物，所述产物在凝胶电泳后从孔迁移的距离最短，并且当略去基因组DNA或Φ 29DNA聚合酶时或当利用双链特异 性核酸酶(DSN)预处理DNA时未被检测到。显示了双链(ds)DNA标记物的位置。B和C:利用核酸外切酶λ、1和/或V消化2 μ g限制性酶处理的IIICF/cDNA，将I. 5%经历CC测定
(B)，将剩余的经历末端限制性片段(TRF)分析(C)。D:使用和不使用引物的IOOpg M13噬菌体环状单链(SS)DNA的RCA。仅对于(D)，反应包括dCTP，利用M13特异性探针检测到产物。E :显示了来自 ALT [+] I IICF/c、SUSM-1 和 U-20S 细胞以及 ALT [-] HeLa、HT1080 和 TE-85细胞的30ng基因组DNA的CC测定。图3举例说明了 CC测定的灵敏度和线性。A :利用ALT[+] IIICF/c基因组DNA和C96 (96个核苷酸)C-环的系列稀释物的CC测定的斑点印迹。将I IICF/c DNA (B)和C96C-环
(C)的CC测定水平作图，每一个点代表一个测定。对l_32ng的IIICF/c基因组DNA(B插图)和8-1024fg的C96C-环(C)的范围进行线性回归分析，画出最佳拟合的线。图4举例说明CC测定特异于ALT。在聚合酶反应中不使用和使用dCTP的情况下，将来自18个ALT[+]细胞系(Al-18)、15个端粒酶[+]细胞系(T1-15)、5个会死的细胞株(M1-5)的基因组DNA(30ng)经历CC测定。在表I中鉴定了各个细胞系/株系。A :分别显示了具有低和高增益的代表性印迹，以允许比较强和弱水平。将A4的额外样品(但具有dCTP) (A4+dCTP)包括在不利用dCTP的实验中以将它们针对利用dCTP的实验标准化。对照B :仅有缓冲液；0 :无DNA ；-φ Φ29被略去。B :按照端粒维持机制将平均值在对数标度上作图。ALT[+]平均值的75. 2任意单位(AU)(水平棒)，显著高于端粒酶[+]细胞的O. IOAU(p < O. 001)和会死的细胞株的O. IlAU(P = O. 007)。C:将ALT[+]细胞系的利用dCTP与不利用dCTP的CC测定的比率作图，标示了异常值A4。将其余的ALT[+]细胞系聚簇，水平棒表示它们的平均比率。D :在来自在群体倍增(pd) 211时过表达hTR的HeLa细胞(HeLa hTR)的32ng基因组DNA上进行的CC测定，所述细胞与只表达载体的HeLa (HeLa载体；pd211)或未处理的HeLa细胞相比具有端粒dsDNA环的显著增加。E :将平均值土平均值的标准误差(SEM) (η = 3)作图。SEM不适用于用于校正一式三份CC测定的IIICF/c。图5举例说明C-环在ALT激活后出现。A :来源于李佛美尼综合征患者的LFS-05F-24成纤维细胞(培养超过200pd，危险期在pd48至50发生)(箭头)的生长曲线。B和C :利用TRF分析(2 μ g) (B)和利用CC测定(16ng) (C)检查在pdl7、34、60、67和92提取的基因组DNA(A中的箭头)，将其与HT1080端粒酶[+]细胞和IIICF/c ALT[+]细胞相比较。TRF分析⑶显示在危险期后(pd60-92)与IIICF/c ALT[+]细胞相似的长异质端粒。在危险期后但非危险期前细胞⑶中检测到ALT相关PML小体(APB)。端粒重复扩增方案(TRAP)分析(B)在任何时间点上未检测到端粒酶活性。在对数标度(C)上，用曲线图将CC测定结果表示为平均值土SEM，n = 3，代表性斑点印迹在图上方。将IIICF/c用于校正一式三份CC测定。I. 55AU上的水平虚线表示5xALT[-]HT1080水平，对于ALT活性为阳性的CC测定的阈值。图6举例说明当ALT被抑制时C-环快速消失。A和B =ALT活性在表达全长黄色荧光蛋白(YFP)-SplOO融合蛋白的IIICF/c克隆、IIICF/c-17和IIICF/c-10中被抑制，但在表达YFP-SplOO缺失突变体的那些细胞IIICF/c-16和IIICF/c-11中不被抑制。用图形(B)将来自这些克隆和ALT[-]TE-85细胞的16ng基因组DNA的CC测定(A)表示为平均值土 SEM，在0. 95AU处的水平虚线表示ALT[_]对照的5x水平。C-F :在3个独立的实验(A-C)中利用YFP-SplOO表达构建体瞬时感染IIICF/c细胞。通过用抗-YFP抗体进行免疫印迹(c)来确认感染后48小时YFP-SplOO的表达。对于每一个独立的实验以一式三份进行16ngDNA (D ;上面一行)的CC测定，并且用曲线图(E)将其表示为平均值土SEM。组合实验(F ；n表示独立实验的次数)显示YFP-SplOO表达，导致比单独的载体284AU显著更低的CC测定水平34. 6AU(p = 0. 007)。G :在来自在用 YFP-SplOO 和 ALT [-]对照 TE-85 感染后 24-96小时收获的IIICF/c细胞的16ng DNA上进行的CC测定(下面一行)的一式三份平均值。图7举例说明了 ALT[+]骨肉瘤患者的血液中的C-环的增加。A :对2%的核酸外切酶处理的DNA(分离自2ml来自7个儿科骨肉瘤患者和2个正常对照NI和N2的全血)进行CC测定。4个患者具有ALT[+]骨肉瘤CA1-CA4，3个具有ALT[-]CBl-CB3(Henson等人，2005)。患有具有多个在诊断后不同时间点收集的样品。也在分离自血浆(纯化自2ml来自正常对照NlP和N2P的全血)的20% DNA和来自ALT [+] IIICF/c细胞和ALT [-] TE-85细胞的16ng基因组DNA上进行CC测定。分别利用和不用小29+和-对全血进行CC测定。B :用曲线图将CC测定结果表示为平均值土SEM，n = 3。对于全血样品，首先将不利用￠29的结果从利用￠29的结果中扣除。来自ALT[+]患者的9个血液样品的平均CC测定水平102. 8AU显著高于来自ALT [-]患者的8个血液样品的23. 4AU(p = 0. 012)。C和D :对患者血液样品CA3-3(C)的一系稀释物进行CC测定，将其作图(D)，每一个点代表一个实验。对0. 4% -2% CA3-3DNA的范围进行线性回归分析，画出最佳拟合的线。图8显示软组织肉瘤(STS)肿瘤的CC测定结果。在18个STS和典型的ALT[+](IIICF/c)以及端粒酶[+] (HT1080)永生化细胞系上进行CC测定。显示了 CC测定产物的斑点印迹。图9为16个软组织肉瘤(STS)的CC测定(C-环测定)水平的散点图，其之前已通过APB测定法确定了它们的ALT状态。将CC测定水平在对数标度上作图。CC测定水平明确地区分了 ALT [+]与ALT [-] STS。具有通过APB测定法和CC测定法测定的低ALT活性的STS可归因于一致的低水平或其ALT活性被邻近的ALT[_]群体稀释的ALT[+]亚群体。

图10为27个多形性胶质母细胞瘤肿瘤的CC测定(C-环测定)水平的散点图，所述肿瘤先前已通过TRF测定法确定了它们的ALT状态。CC测定水平明确地区分了 ALT[+]与ALT[_]多形性胶质母细胞瘤。
本文中使用的特定寡核苷酸和引物的序列(参见实施例)提供于出现在说明书的结尾处的正式序列表中。本领域技术人员将理解，所提供的序列仅仅是示例性的并且不以任何方式限定本公开内容的范围。发明详述除非上下文另外要求，否则在整个本说明书和其后的权利要求中，单词"包括"和变形例如"包含"或"含有"将被理解为暗指包括所述整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或整体或步骤的组。冠词"一个/种(a)"和"一个/种(an)"在本文中用于指一个/种或超过一个/种(即，指至少一个/种)所述冠词的宾语。例如，“一个/种元素”意指一个/种元素或超过一个/种元素。本文中所使用的术语"ALT"是指被称为"替代性端粒延长"或端粒酶非依赖性端粒维持的端粒维持的过程。因此，在其最广的情境中，"ALT"是指维持端粒的长度(阻止端粒缩短)的方法或机制，所述方法或机制不依赖于端粒酶的活性。通常称为"ALT机制"，应理解，本发明不限于ALT可籍以在细胞中运行以维持端粒的任一特定机制。因此术语“机制”一般性地用于该上下文中而非指“ALT机制”籍以运行的特定生物化学机制或途径。实际上可存在超过一种ALT籍以运行的特定途径。" ALT[+]"意指细胞显示或具有ALT活性(即，是'ALT活性'细胞)，而术 语"ALT[-]"表示细胞不显示或具有ALT活性(即为'ALT阴性'细胞)。类似的意义在本文中用于术语"端粒酶[+]"和"端粒酶[_]"，分别表示端粒酶在细胞中是有活性或无活性的。本文中所使用的术语"与……相关"，当用于“与异常细胞增殖相关”的疾病或病况的情境中时，意指所述疾病或病况可因不受调控的或过量的细胞增殖而引起；导致不受调控的或过量的细胞增殖；其特征在于不受调控的或过量的细胞增殖；或与不受调控的或过量的细胞增殖相关。因此，疾病或病况与过量的细胞增殖之间的关系可以是直接或间接的并且可在时间和/或空间上分开。如本文中所使用的，术语“疾病控制”意指疾病或病况的状态，通常是就治疗疾病或病况的干预而言。因此"疾病控制"描述了作为患者的疾病的结果由他们经历和遭受的症状和病况的范围和严重度。疾病控制有效地提供了在个体的疾病状态的给定时间点上的测量，反映了由个体使用的当前治疗性治疗方案和个体的最近经历。本文中所使用的术语"有效量"在其意义内包括无毒的但充足的量或剂量的提供期望的作用的试剂或化合物。所需的精确量或剂量因受试者而异，取决于因素例如被治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、被治疗的病况的严重度、被施用的具体试剂和施用模式等。因此，不可能规定确切"有效量"。然而，对于任何给定的情况，适当的"有效量"可由本领域普通技术人员仅使用常规实验就测定。本文中所使用的术语"核酸"、"核苷酸序列"、"寡核苷酸"和"引物"表示任何基于核酸的分子，包括DNA、cDNA、RNA、mRNA、cRNA、PNA或其任何组合。因此，核酸分子、寡核苷酸或引物可包括天然存在的核苷酸、非天然核苷酸或其组合。本文中所使用的术语“寡核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链序列、天然核苷酸的已知类似物或其混合物。寡核苷酸通常是短(例如在长度少于100个核苷酸)序列，其可通过任何适当的方法、包括例如直接化学合成或适当序列的克隆和限制性酶切来制备。通常在本发明的情境中，寡核苷酸被设计为识别和结合位于另一个核酸分子内的特定的互补核苷酸序列。寡核苷酸还可包括除与所述互补序列杂交所需的那些碱基之外的碱基。寡核苷酸可能能够或可能不能作用作用于聚合酶介导的延伸的引物。并非要求寡核苷酸中的所有碱基与所述寡核苷酸被设计用以结合的序列互补；寡核苷酸只需要包含足够的互补碱基来使所述寡核苷酸识别并且结合该序列。寡核苷酸序列可以是未修饰的核苷酸序列或可以通过多种本领域技术人员已知的方法进行化学修饰或缀合。本文中所使用的术语"部分双链端粒环"在其最广的意义上意指包含完整的或不间断的环状链(“闭合环状链”)和线性链的DNA分子，其中所述环状链包含富含C或富含G的端粒DNA序列并且所述线性链包含互补的富含G或富含C的端粒DNA序列。在本公开内容的情境中，在环状链上的包含富含C的端粒序列(例如端粒重复(CCCTAA)n)的部分双链端粒环被称为"C-环"，在环状链上的包含富含G的端粒序列(例如端粒重复(TTAGGG) )的部分双链端粒环被称为“G-环”。在本定义的上下文中，术语“线性”以其最广的解释给出，意指'非环状'，同时"环状"意指完整的不间断的环状DNA链。因此，线性链可以是具有任何长度的DNA片段或区段，其不是完整的或不间断的环，线性链包含与环状链杂交、从而能够在使用闭合环状链作为模板的滚环复制/扩增机制中利用聚合酶延伸的3' 末端；或可选择地，线性链包含3'末端，所述3'末端不与环状链杂交但被聚合酶或其它酶复合物加工以使其能够在使用闭合环状链作为模板的滚环复制/扩增机制中被聚合酶延伸。例如，线性链可以是具有足以使得能够与环状链杂交以产生短双链区的最少核苷酸的短片段，或可包含足够的与环状链互补的序列(以便双链在环状链与线性链之间几乎是完整的，线性链包含切口)以及之间的所有中间体。线性链还可具有不与环状链杂交的一个或多个5'尾。环状和/或线性链的端粒序列可以是变异或突变的端粒重复序列。除了标准端粒重复序列外，环状和/或线性链还可包含变异和/或突变的端粒重复序列。"变异"和"突变的"意指端粒序列在一个或多个核苷酸位置上通过下列方式与标准端粒序列相异碱基插入、缺失或置换。环状和线性链的每一种或二者还可包含非端粒序列(以便链作为整体可以是或可以不是富含C的或富含G的)。所述链通常包含足够的端粒序列(或具有足够的与基因组端粒序列的同源性的变异或突变的端粒序列)以使得能够通常在生理条件下与端粒DNA杂交。因此，在上述定义的上下文中，环状和线性链只需包含端粒序列而不必主要由或只由端粒序列组成而被称为“端粒的”。也在本定义的上下文中的是，术语“部分地”包括不是完整双链的双链的任何程度。本文中所使用的术语"引物"是指结合单链模板核酸分子的特定区域并且通过酶促反应起始核酸合成(从引物的3'末端延伸并且与模板分子的序列互补)的寡核苷酸。根据常规，引物通常称为'正向'和'反向'引物，所述引物之一与核酸链互补，并且所述引物的另一个引物与该链的互补链互补。本文中所使用的术语"样品"是指包含核酸分子(通常包含DNA和/或RNA)的任何生物样品。样品可以是组织、细胞或其提取物，或可以是核酸分子的纯化样品。术语"样品"的使用不一定意指待根据本文中描述的方法测定的序列在样品中的存在。关于疾病例如癌症，本文中所使用的术语"状态"是指在给定的时间、给定的受试者的疾病状态或疾病活性。"状态"与本文中定义的部分双链端粒环的存在或不存在相关。所述部分双链端粒环的不存在或其量在一段时间内的减少可表示无活性疾病状态，例如疾病的静止状态或减轻。所述部分双链端粒环的存在或其量在一段时间内的增加可表示活性疾病状态，其可表示例如肿瘤的大小和/或程度的生长或扩展，或与经历一个或多个与疾病相关的症状的受试者相关联。本文中所使用的术语“治疗”和其变形是指治疗病况或症状，预防病况或疾病的建立，或以任何方式防止、阻止、延迟或逆转病况或疾病或其它不期望的症状的进展的任何和所有用途。因此术语"治疗"等以它们的最广情境来考虑。例如，治疗不一定意指患者被治疗至完全恢复。治疗还包括特定病症的症状的改善或防止或减少发生特定病症的风险。迄今为止，细胞中的ALT活性的测定已被限定于与ALT或ALT的作用相关的因素或现象的间接测定。这类测定可以通过测量末端限制性片段(TRF)、增加的端粒重组、端粒DNA或端粒结合蛋白在前髓细胞性白血病(PML)核小体中的存在、双链染色体外端粒环(t-环)、增加的复制后端粒交换和增加的特定卫星重复的不稳定性来测量或观察例如高度异质的端粒长度分布的存在。然而，所测量的属性与ALT间接相关，并且在许多情况下可具有可选择的解释或诱因因素。例如，也已显示长异质端粒和包含端粒DNA的PML核小体存在于端粒酶阳性细胞中并且不存在于某些ALT[+]细胞中。目前可获得的测定法通常遭受对于ALT的特异性的缺乏和由此的可靠性的缺乏。增加的端粒姐妹染色单体交换和t-环还可独立于ALT发生。以下事实证明了对于用于ALT活性的简单、灵敏、特异性和快速反应的测定法的需求对于日益增加的蛋白质的数目(例如MUS81、Rad51D、FANCD2、Topo III a、BLM和 FENl)，它们对于ALT机制的意义被询问。例如，不清楚这些蛋白质是否直接促成ALT，或在ALT[+]细胞中是间接需要的。此外，这些蛋白质起着其它(通常是必需的)细胞作用，并且通常抑制会显著地降低ALT细胞的存活力，从而使ALT活性的评估非常困难。如本文中所描述的，本发明人第一次鉴定了 ALT[+]_特异性标志物。具体地本发明人已发现部分双链端粒环特异于具有活性ALT机制的细胞。这些环在ALT激活后不久出现并且当ALT被抑制时快速消失。此外，已显示这些环的水平与ALT活性的水平相关联。因此，本文中第一次描述了基于部分双链端粒环的检测和/或定量的针对ALT活性的可靠、特异性和定量测定法。本发明人的新发现打开了开发替代目前可获得的用于测定ALT活性的方法的准确的、特异性的和高效替代方法的途径。不希望受任一理论束缚，本发明人推测根据它们的环状性质、精确的特异性和短的半衰期，部分双链端粒环与ALT直接关联并且可能是ALT [+]滚环扩增中的直接中间体而非苜丨J广品。根据一个方面，本发明提供了用于确定细胞是否具有活性ALT机制的方法，所述方法包括测定部分双链端粒环的存在，其中所述环的存在特异于包含活性ALT机制的细胞。在其中细胞为脊椎动物细胞的实施方案中，部分双链端粒环通常在环状链上包含序列(CCCTAA)n的重复并且在线性链上包含序列(TTAGGG)n，或可选择地在环状链上包含序列(TTAGGG)n的重复并且在线性链上包含序列(CCCTAA) n。本文中描述的方法特别用于，开发用于ALT[+]疾病的诊断的测定法，用于评估ALT[+]疾病对治疗的治疗性反应和最优化这样的治疗的测定法以及用于监控ALT[+]疾病的进展和发展的测定法。此外，应理解，可靠且特异性地测量ALT活性的能力打开了用于开发ALT-特异性治疗剂的途径。根据本文中描述和举例说明的实施方案，已开发了简单ALT活性测定法，其中通过起始滚环扩增和随后分析这样的扩增的产物来检测部分双链端粒环。滚环扩增是用于检测环状DNA的简单灵敏的技术。滚环扩增是对于本领域技术人员来说是公知的天然存在的复制方法，其被用于许多研究应用(参见，例如，Dean等人，2001 ;将其公开内容通过引用整体并入本文)并且用于滚环扩增的技术完全在本领域技术人员的技术和能力范围之内。通常在适当的DNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸存在的情况下进行滚环扩增。在一些情况下，滚环扩增提供了优于其它可获得的检测技术的有利方面，例如所需的简单恒温聚合酶温育为常规病理学实验室应用提供了方便。然而，在一些情况下，期望或必需使用检测部分双链端粒环的可选择方法，例如PCR、测序、杂交、分子信标、核酸酶例如DNA partzymes。用于进行可选择的检测方法的技术对于本领域技术人员来说是公知的并且完全在其技术和能力范围之内。本领域技术人员还应理解，通过滚环扩增反应产生的产物的量或产物的产生速率可以例如通过向滚环上的多重引物中加入特异性引物来增强，从而使测定更快和/或更灵敏。用于按照本发明的实施方案基于滚环扩增检测部分双链端粒环的测定法的图示显示于图I中。应当指出，图I中举例说明了本发明涉及的部分双链端粒环的一个示例，但本发明的实施方案的应用不限于该单个示例。相反地，本文中定义的所有部分双链端粒环易于通过描述的方法来检测和定量。还是看图1，部分双链端粒环(10)包含完全的(完整的)环状链(11)和与环状链(11)退火以形成短双链区的短线性区段(12)。图I中显示的部分双链端粒环为"C-环"，其中环状链(11)包括端粒序列(CCCTAA)n，线性区段(12)包括与所述环状链的区域互补的序列。在进行测定时，在使Φ29 ΝΑ聚合酶以环状链(11)用作模板在线性区段(12)的3/末端起始第二链合成的条件下，在dNTP dATP、dGTP和dTTP (任选地包括dCTP)存在的情况下利用Φ29 ΝΑ聚合酶(13)温育C-环(10)。结果是单链端粒DNA的长线性多联体(14)的产生。这些多联体产物可通过任何适当的方法检测，例如与适当标记的(CCCTAA)n探针杂交、测序或PCR。可选择地，检测可以例如通过提供适当标记的和可检测的dNTP(以通过聚合酶掺入)来实现。Φ29 ΝΑ聚合酶是按照本发明的实施方案使用的适当的聚合酶的一个实例。Φ29 ΝΑ聚合酶是具有链置换能力的高度持续聚合酶(processive polymerase),其通常产生长度> 70kb的滚环扩增产物。然而本领域技术人员将认识到，具有类似特征的其它聚合酶也可用于本文中并且包括在本文中。脱氧核糖核苷酸(dNTP)通常选自dATP、dGTP、dTTP和dCTP，虽然待使用的确切dNTP将取决于部分双链端粒环的序列。例如，当环状链由端粒序列CCCTAA组成时，可在仅有dATP、dGTP和dTTP存在的情况下使用DNA聚合酶进行滚环扩增。如图I中所示，借助于提供环状DNA的短双链区的线性区段，可有利地进行滚环扩增而无需提供外源引物。相反地，线性区段(12)的序列用作引物，从其起始Φ29 ΝΑ聚合酶介导的链合成。如本文中所举例说明的，按照本文中描述的(和如图I中示意性显示的)方法进行的测定是灵敏的，其能够检测纳克量的来自ALT[+]细胞的基因组DNA中的部分双链端粒环，并且在I至32ng的范围内是线性的。同样地如所举例说明的，通过该测定法检测与一组38个细胞系和不同来源的细胞株的ALT活性精确确相关的部分双链端粒环未被t-环的ALT独立性产生显著增加，在时间上与ALT的激活相关，并且在ALT的抑制后快速衰减。部分双链端粒环因而特异于ALT [+]细胞，并且本文中描述的方法和测定法提供了 ALT活性水平的第一定量测量。本文中另外例举的是下列发现在来自ALT[+]骨肉瘤患者的血液中检、测到部分双链端粒环，这表明这类环的测定具有用于ALT[+]肿瘤的诊断和管理的临床效用。根据本文中描述的方法，可从分离的细胞分析部分双链端粒环的存在和/或量。还可按照所述方法使用来源于受试者的生物样品。按照本发明的实施方案使用的生物样品可包括一种或多种液体或组织样品，包括例如血液、尿、痰、胸膜液、腹膜液、支气管和支气管肺泡灌洗液或组织切片。所述样品可以包括新鲜、冷冻或贮存的生物材料。所述样品可通过细针抽吸活组织检查获得，从而使得能够分析例如来自相同肿瘤或患病组织的多个切片。在一些情况下，样品可在从受试者提取后经历处理、温育或培养。通常地，按照本发明应用的生物样品包括血液。血液可包括全血、血清或更常见地血浆。因此，本发明的实施方案涉及用于按照本文中描述的方法进行的ALT活性的简单的基于血液的测试法的开发和实施。 在一些实施方案中，可在分析之前从细胞提取基因组DNA。可选择地，可另外处理细胞以使DNA可用于分析，例如可以在或可以不在对细胞蛋白质进行变性或降解的情况下使用细胞裂解物。也可在或不在之前固定和/或交联的情况下在细胞通透化后原位进行分析。用于固定、交联和通透化的技术对于本领域技术人员来说是公知的。易于使用本文中描述的方法和测定法分析和/或治疗的疾病可以是其中ALT机制被用作端粒维持的手段的任何疾病。在本文中描述和举例说明的具体实施方案中，所述疾病是癌症，但本领域技术人员将理解，本公开内容的范围不限于此。仅举例说明，所述癌症可以是肉瘤、母细胞瘤、癌、间皮瘤或星形细胞瘤。所述肉瘤可以是例如骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脂肪肉瘤、滑膜肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤或平滑肌肉瘤。所述母细胞瘤可以是例如神经母细胞瘤。所述癌可以是例如非小细胞肺癌例如肺腺癌、乳腺癌、胃癌、肾上腺皮质癌、卵巢癌或黑素瘤。所述间皮瘤可以是例如腹膜间皮瘤。所述星形细胞瘤可以是例如低级星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤。应理解，本发明的范围不限于举例说明的癌症和肿瘤。可发现其它癌症和肿瘤、事实上特征在于异常细胞增殖或与异常细胞增殖相关的其它疾病或病况利用ALT作为端粒维持的手段。本领域技术人员将理解，本文中描述的方法和测定法适用于特征在于或与异常细胞增殖相关的任何疾病或病况，所述疾病或病况利用ALT作为端粒维持的手段。此外，本发明的实施方案用于患有肿瘤倾向综合征例如维尔纳综合征、罗-汤二氏综合征和李佛美尼综合征的受试者的评估、管理和癌症诊断。本文中描述的本发明的实施方案提供了 ALT[+]疾病例如癌症的诊断和ALT[+]疾病的发作可能性的预测。还提供了其中ALT活性的测定可用作处于发生ALT[+]疾病的风险中的受试者的筛查测试。例如，可以例如凭借遗传易感性、家族史或已暴露或正暴露于一个或多个高风险因子(例如生物化学、行为和环境的)来将这类受试者鉴定为属于处于发生特定疾病的高风险的组。例如，受试者可具有肿瘤倾向综合征例如维尔纳综合征、罗-汤二氏综合征或李佛美尼综合征(其中ALT[+]肿瘤已被发现(Henson，2006))，或可处于患非小细胞肺癌的增加风险中；85%的来自肺和支气管的癌症为非小细胞肺癌并且8%的这类癌症为ALT[+] (Henson，2006)。可选择地，还可使用本文中公开的方法进行更广群体的疾病筛查程序。本文中描述的实施方案提供了用于评估受试者的疾病例如癌症的状态，监控受试者的疾病随时间的状态，评估治疗或疾病管理方案的功效以及为个体设计适当的治疗或疾病管理方案的方法和测定法。例如，本发明的方法和测定法可包括确定获自患有与ALT活性相关的疾病的受试者的适当样品中部分双链端粒环的水平是否在表示疾病的满意控制或管理的预定范围内。预定范围外的水平可以表示需要改变受试者的疾病治疗或管理以改进疾病控制，或应当将受试者置于适当的治疗方案中。类似地，部分双链端粒环水平随着时间的相对改变也可表示疾病的满意控制或管理，或需要改变以改进疾病治疗和/或管理。可在给定的时间段内重复分析一次或多次以随着时间的监控受试者的疾病状态。受试者的疾病状态的测定，特别是随着时间的状态的监控，也有利于对用于个别受试者的最适干预或治疗方案作出决策。类似地，检测部分双链端粒环在样品中的存在或不存在允许确定疾病为ALT [+]还是端粒酶[+]，从而影响待施用的疗法。对于ALT[+]疾病，通常可定制治疗方案以获得随着时间的部分双链端粒环水平的降低，从而与ALT活性的抑制或ALT[+]细胞的杀死相关联。在治疗方案被启动后，可存在部分双链端粒环水平的初始增加，表示细胞死亡，然后这类环的水平随着时间的降低表 示ALT[+]疾病细胞的流行率的降低。例如，这可包括引入新治疗方案或改变现有方案以改善疾病症状或其它参数。方案的改变可以是关于多个因素(例如任何现有药剂的性质、其剂量、施用的时间安排和/或任何补充性的疾病管理策略)中的任一个或多个的改变。关于治疗方案的这样的决策将视病例而变化，最适合策略的确定完全在本领域技术人员的能力和经验范围内。例如，ALT活性是多形性胶质母细胞瘤的目前最好的预后指标(Hakin-Smith等人，2003)，并且与增至3倍的生存中值相关联，虽然该存活率仍然较低。无论基于血液还是基于肿瘤样品，按照本文中描述的方法进行的测定具有允许常规鉴定多形性胶质母细胞瘤患者中的ALT[+]组的潜力。同样地例如，约50%的骨肉瘤为ALT[+] (Ulaner等人，2003 ；Henson等人，2005)并且ALT活性似乎不影响对目前化疗方案的反应。对术前化疗方案的反应是骨肉瘤的主要预后因子，然而目前其只可在完成术前化疗后，对通过手术切除术除去的肿瘤进行组织学分析来回顾性地确定。在术前化疗过程中测定肿瘤抗性的特定测定法的开发将允许制定更具有攻击性或靶向性的术前治疗方案，所述治疗方案可在杀死肿瘤细胞和增加患者存活率上更加成功。血浆DNA的水平在成功治疗后的癌症患者中可能显著降低，反之可能以高水平持续或增加，缺乏对治疗的反应。此外，在本公开内容的情境中，也可评估特定治疗在杀死肿瘤细胞中的功效，其中肿瘤细胞死亡暂时导致在细胞死亡(例如细胞凋亡或坏死)的时期内血浆中部分双链端粒环的量的增加。因此，ALT活性的定量血液测试可帮助测定每一个化疗周期后存活的ALT[+]骨肉瘤细胞的水平。可观察到部分双链端粒环的量的初始增加，其表示细胞死亡，之后观察到这类环的量的减少，表示剩下的ALT [+]骨肉瘤细胞的丰度降低。从而，由定量血液测试获得的信息可允许定制术前化学疗法来增加非反应性和ALT[+]患者组的存活率。本领域技术人员将理解，可在临床试验的情境中确定疾病治疗的功效的评估，在该情况下，如果待试验的疗法对于ALT [+]或ALT[_]疾病之一更加有效(相对于针对另一疾病)，则可能期望将正在进行试验的受试者分层。因此，本发明的实施方案涉及本文中描述的测定法用于测定受试者或受试者组的癌症的ALT状态的用途，所述分层可用于将反应不良的受试者或受试者组从试验中除去。
用于按照本发明 的方法治疗/管理受试者的与ALT活性相关的疾病的治疗方案可包括施用通常用于治疗所述疾病的任何药剂，例如在癌症的情况下一种或多种化疗剂或放射疗法。所述治疗方案可包括同时、相继或彼此组合地施用多种药物。施用的药物类型、施用的剂量和频率可由医生按照接受的医疗原则来确定，并且将取决于因素例如疾病的严重度、受试者的年龄和体重、受试者的医疗史、受试者服用的其它药剂、现有疾病和当确定治疗时通常考虑的任何其它健康相关因素。本文中还提供了基于检测本文中公开的部分双链端粒环的存在或不存在或其水平的改变鉴定能够调节ALT活性的化合物和试剂的方法。所鉴定的化合物和试剂可以是ALT的抑制剂或激活剂。在具体的方面，提供了用于鉴定适合用于调节细胞的ALT活性的化合物的方法，所述方法包括提供一种或多种显示或能够显示ALT活性的细胞；按照上述任意方面测定部分双链端粒环的量；将所述一种或多种细胞与候选化合物接触；以及按照上述任意方面测定所述环的量，其中所述测定之间的所述环的量的改变表示候选化合物调节ALT活性的能力。所述环的量的减少表示候选化合物抑制ALT活性的能力，而所述环的量的增加表示候选化合物激活ALT活性的能力。当所述方法用于鉴定ALT抑制剂时，所提供的一种或多种细胞通常是ALT[+]的。当所述方法用于鉴定ALT的激活剂时，所提供的一种或多种细胞可以是ALT[+]或ALT[_]的；在八1^[+]细胞的情况下，部分双链端粒环的增加表示化合物激活ALT的能力，在ALT[_]细胞的情况下，部分双链端粒环的出现表示化合物激活ALT的能力。可将按照本发明的方法检测本文中公开的部分双链端粒环所需的所有必需成分一起装配在试剂盒中。所述试剂盒可包括用于检测和定量部分双链端粒环水平的适当成分、适当的阳性和阴性对照、稀释缓冲液、试剂(例如dNTP;酶)、引物等。还可标准化这类试剂、缓冲液、对照等以适合用于本领域技术人员已知的用于分析样品例如血液样品的许多装置中的任一装置。试剂盒还可包括有利于应用本文中公开的方法的装置和/或软件，例如包括基于测定的部分双链端粒环水平测定或计算预后的适当的计算机软件。通常，所述试剂盒包括用于进行本发明的方法(任选地与教导性信息一起)和用于基于使用本发明的方法和试剂盒获得的结果的治疗推荐的说明书。本说明书中对任何现有出版物(或来源于其的信息)或对已知的任何内容的参考不被，并且应当不被认为是对现有出版物(或来源于其的信息)或已知的内容形成本说明书涉及的努力的领域中的共同的一般知识的部分的承认或认可或任何形式的建议。本领域普通技术人员将理解，可对本发明进行许多变化和/或变动而不背离广泛描述的本发明的精神或范围。因此，提出的实施方案在所有方面被认为是举例说明性的而不是限制性的。现将参考下列具体实施例来描述本发明，所述实施例不应当解释为以任何方式限定本发明的范围。
实施例一般方法患者样品经Westmead儿童医院的人类研究道德委员会批准获得患者样品。全血样品由CHW肿瘤组织标本库(CHW Tumour Bank) (_80°C贮存)提供。来自37岁的李佛美尼综合征患者的皮肤样品LFS-05由kConFab提供；使用短串联重复分析法(short tandem repeatprofiling)由CellBank Australia确认从该皮肤培养的危险期前和危险期后成纤维细胞的来源。DNA提取和定量通过用2% SDS缓冲液裂解和利用100 μ g/ml链霉蛋白酶(Pronase) (Sigma)降解蛋白质而从细胞沉淀提取DNA。在SDS和盐沉淀蛋白质后，从上清液使用乙醇沉淀DNA。使用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒(Qiagen)从全血提取DNA用于实施例2。通过在4°C离心10分钟从新鲜收集的血液纯化血浆两次(第一次以1，600x g，然后以16，OOOx g)，将其快速冷冻，于-80°C下忙存，使用QIAamp UltraSens Virus试剂盒(Qiagen)提取DNA。在 Qubit 突光计(Invitrogen)上定量 ssDNA 和 dsDNA。DNA的核酸酶处理按照制造商的说明书使用双链特异性核酸酶(DSN ;Evrogen)40U/y g、λ核酸外切酶(NEB) 12. 5单位/ μ g、IOOU/ μ g的核酸外切酶I (NEB)和30U/ μ g的核酸外切酶V (DNA酶，ATP-依赖性的；USB)。通过HinfI和RsaI限制性酶(NEB)预处理、利用O. 15U/y gA核酸外切酶和I. 5U/ μ g核酸外切酶I反复降解、最后利用60U/样品核酸外切酶V消化来除去全血线性DNA。C-环测定("CC测定")其中利用4U/ μ g HinfI和RsaI限制性酶(NEB)以及25ng/ μ g RNA酶(不含DNA酶；Roche)消化适当的基因组DNA。可选择地，在一些实验(实施例5)中，涡旋样品替代对限制性酶消化或RNA酶处理的需要。将所有DNA溶液于-80°C下贮存在IOmM Tris[pH7. 6]中。将 10 μ I 样品与 10 μ I O. 2mg/ml BSA、0. 1% Tween、各 ImM 的 dATP、dGTP 和 dTTP、1ΧΦ29缓冲液和7. 5单位的Φ29 ΝΑ聚合酶(NEB)组合，在30°C下温育8小时，然后在65°C温育20分钟。只有当提及时，ImM dCTP也被包括在聚合酶反应中。为了进行定量，以一式三份进行CC测定。利用2X SSC将反应产物稀释至60 μ 1，将其斑点印迹至2Χ SSC浸湿的Biodyne B尼龙膜(Pall)上。通过紫外光(UV)将DNA交联至膜上，随后将膜在37°C下于PerfectHyb Plus杂交缓冲液(Sigma)中与末端标记的32P-(CCCTAA) 3杂交。就荧光屏的线性范围最优化曝光，在STORM 860光学扫描仪上利用ImageQuant软件(MolecularDynamics)扫描所述荧光屏，使用边缘扣除以进行本底校正。为了进行大小分离，将反应产物在 O. 6% SeaKem Gold 琼脂糖(Lonza) -O. 5X Tris-硼酸盐-EDTA 中以 1.75V/cm 进行电泳，进行12小时。将凝胶在真空下于60°C进行干燥，在2X SSC中进行洗涤，在37°C下用5XSSC、5X Denhardt' s溶液、O. 5mM焦磷酸四钠和IOmM正磷酸氢二钠温育2小时，然后加入末端标记的32P-(CCCTAA)3并且温育过夜。用O. IX SSC在37°C洗涤凝胶，将其就斑点印迹膜成像。C96C-环和 M13DNA通过使用接头5' -TGATATGGGGGGAATTGA-3 ' (SEQ ID NO :2)和 T4DNA 连接酶(NEB)环化 96 个碱基的寡核苷酸 5' -CCCATATCACTAA (CCCTAA) 12CCTCAATTCCC_3' (SEQ IDNO 1)来产生0960环。用8(^核酸外切酶1(肥8)消化未连接的寡核苷酸和游离接头2次。边界接头(Bound linker)在CC测定中用作C96的引物。如先前所述(Dean等人,2001),利用Y -GTAAAACGACGGCCagt-3/ (SEQ ID NO :3 ;3个:V末端核苷酸之间的硫代磷酸酯键)引发M13环M13mpl8ssDNA(NEB)，利用80U核酸外切酶I消化线性ssDNA 2次。将引发的M13环用于CC测定，将dCTP加入反应混合物中，利用5' -ACAGGAAACAGCTATGAC-3' (SEQID NO 4)进行探测。端粒维持状态基本上如先前所述进行末端限制性片段(TRF)长度(Perrem等人，2001)、APB检测(Henson等人，2005)和免疫沉淀-TRAP (Pickett等人，2009)，后者利用产物的常规PCR检测。免疫印迹在进行免疫印迹(如由Jiang等人,2005所描述的)后,利用小鼠抗-绿色荧光 蛋白(BD Bioscience)、兔抗-RAD51 (Calbiochem)、兔抗-SMC5 (Bethyl Laboratory)和兔抗-MMS21 (来自R Potts博士)探测膜。逆转录病毒感染、克隆和短干扰RNA通过将EYFP-Sp 100(来自 David Spector 博士)克隆入 pLXSN(Clontech)的多克隆位点来产生逆转录病毒载体pLXSN-YFP-SplOO。在75cm2培养瓶中利用Fugene 6 (Roche)将等摩尔量的 pLXSN-YFP-SplOO (或仅 pLXSN)、pVPack-GP (gag-pol 表达载体；Statagene)和PMD2-VSVG包膜载体(来自Dr Luigi Naldini)，总共16 μ g DNA共转染入293T细胞。在第48和72小时收获含有病毒的上清液,将其通过O. 45 μ m Ministart过滤器(Sartorius)过滤，在100，000MWC0 Vivaspin-20浓缩器(Sartorius)中浓缩50倍。向6孔板中的指数生长的IIICF/c细胞中加入Iml DMEM (具有8 μ g/μ I聚凝胺(polybrene))中的150μ1的新鲜浓缩物。按照制造商的说明书利用短干扰RNA(SiRNA)和jetPRIME (Polyplus-Transfection)处理细胞。所使用的siRNA寡核苷酸特异于SMC5 (5'-GAAGCAAGAUGUUAUAGAAdTdT-3' ) (SEQ ID NO :5)、MMS21(5' -CUCUGGUAUGGACACAGCUdTdT-3' ) (SEQ ID NO 6)和 RAD51 (经验证的 siRNA ；QIAGEN ；SI02663682)。数据分析对于之前的结果和患者数据，所有分析是盲测的。利用线性回归分析评价CC测定的线性。利用双尾t检验或曼-怀二氏检验(Mann-Whitney test)比较CC测定分布。误差条表不SEM。实施例I-可通过滚环扩增在ALT [+]细胞中检测到部分双链端粒环本发明人已开发了使用滚环扩增检测部分双链端粒环的测定法。如本文中所举例说明的，可将所述测定法(下文中称为"CC测定")用于例如检测C-环，通过环的不完整G-链(线性链)区段的Φ 29-介导的延伸，从而产生长端粒ssDNA多联体(参见图I)。使用30ng基因组DNA进行CC测定，在琼脂糖凝胶电泳后，在ALT [+] IIICF/c细胞中但非ALT[-]TE-85细胞中检测到产物(参见图2A)。IIICF/c细胞中的CC测定底物为(i)端粒，如通过dCTP (不是进行RCA所必需的)，以及通过利用端粒G-链特异性探针检测到产物所证明的；(ii)部分双链的，如通过它们的自身引发(self-priming)的能力和由双链特异性核酸酶(所述酶消化双链DNA但非单链(ss)DNA) (DSN ;图2A)产生的破坏显示；和(iii)环状的，如通过以下发现所证明尽管降解了大多数线性端粒DNA(图2C)，但核酸外切酶X、1和V不减少CC测定产物(图2B)。环状模板也是通过滚环扩增(图2A)产生高分子量产物所必需的，如从M13环状ssDNA产生的那些(图2D)。
通过在CC测定中包括dCTP并利用端粒C-链-杂交探针“末端标记的32P-(TTAGGG) 3”进行探测，也在ALT[+]细胞系IIICF/c “Saos-2和U-20S”中但非在端粒酶[+]细胞系“HeLa、MG63和TE-85”中检测到G-环。检测到的G-环水平为ALT [+]细胞系中的C-环水平的1/100 (使用含有I. 6kb的端粒序列的变性质粒来校正C-链-和G-链-杂交探针)。来自对ALT[+]和ALT[_]细胞进行的CC测定的任何低分子量产物的不存在(图2E)表示斑点印迹适合用于定量。本发明人还评估了对ALT [+] I IICF/c基因组DNA和C96 (包含96个核苷酸的C-环)的系列稀释物的CC测定(图3)。来自Ing ALT [+]基因组DNA (lOOIIICF/c细胞当量)的信号超过来自无DNA和ALT[_]对照的信号。CC测定水平在l_32ng的32倍范围内与 IIICF/c DNA 线性地成比例(R2 = 0. 990，p < 0. 001 ;图 3B)。CC测定也与8-1024fg(128倍的线性范围)的纯C96C-环线性地成比例(R2 =0. 996，p < 0. 001 ;图 3C)。20ng IIICF/c 基因组 DNA 具有等于 180fg C96C-环的 CC 测定信号，表明每IIICF/c细胞存在约1000个C-环。如果假定更大的C-环具有多个引发位点或允许比C96更好地接近0 29，那么实际数目可能更小。实施例2-部分双链端粒环特异于ALT本发明人使用实施例I中描述的CC测定法测定了 18个ALT[+]细胞系和由15个端粒酶[+]细胞系和5个会死的细胞系组成的ALT[-]组。结果示于表I和图4A中。表I.细胞系/株CC测定结果
权利要求
1.用于确定细胞是否具有活性ALT机制的方法，所述方法包括测定部分双链端粒环的存在，其中所述环的存在特异于包含活性ALT机制的细胞。
2.权利要求I的方法，其中所述部分双链端粒环在环状链上包含序列(CCCTAA)n的重复并且在线性链上包含序列(TTAGGG) n。
3.权利要求I的方法，其中所述部分双链端粒环在环状链上包含序列(TTAGGG)n的重复并且在线性链上包含序列(CCCTAA) n。
4.权利要求I至3的任一项的方法，其中所述环状链和/或线性链包含变体和/或突变的端粒重复序列。
5.权利要求I至4的任一项的方法，其中所述环状链和/或线性链还包含非端粒序列。
6.权利要求I至5的任一项的方法，其中所述细胞是癌细胞。
7.权利要求I至6的任一项的方法，其中所述细胞来源于患有、怀疑患有与异常细胞增殖相关的疾病或病况或对所述疾病或病况易感的受试者。
8.权利要求7的方法，其中所述疾病或病况是癌症。
9.权利要求8的方法，其中所述癌症选自肉瘤、母细胞瘤、癌、间皮瘤或星形细胞瘤。
10.权利要求9的方法，其中所述肉瘤选自骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脂肪肉瘤、滑膜肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤和平滑肌肉瘤。
11.权利要求9的方法，其中所述母细胞瘤是神经母细胞瘤。
12.权利要求9的方法，其中所述癌是非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、肾上腺皮质癌、卵巢癌或黑素瘤。
13.权利要求12的方法，其中所述非小细胞肺癌是肺腺癌。
14.权利要求9的方法，其中所述间皮瘤是腹膜间皮瘤。
15.权利要求9的方法，其中所述星形细胞瘤是多形性胶质母细胞瘤。
16.权利要求I至15的任一项的方法，其中在使用部分双链环状端粒DNA作为模板进行滚环扩增后检测到所述部分双链端粒环。
17.权利要求16的方法，其中所述检测包括 (a)任选地从细胞分离DNA； (b)在适当的条件下在DNA聚合酶和一种或多种dNTP存在的情况下温育DNA以便聚合酶介导的从不完全(线性)链的延伸产生单链端粒DNA多联体；和 (c)检测所述多联体。
18.权利要求17的方法，其中通过杂交、测序、PCR、分子信标、核酸酶或通过在温育步骤(b)中掺入适当标记的dNTP来检测所述多联体。
19.权利要求17的方法，其中所述DNA聚合酶是Φ29 ΝΑ聚合酶。
20.权利要求I至19的任一项的方法，其中在来源于受试者的生物样品中检测到所述部分双链端粒环。
21.权利要求20的方法，其中所述生物样品包括血液、尿、痰、胸膜液、腹膜液、支气管或支气管肺泡灌洗液或组织切片。
22.权利要求21的方法，其中所述血液是全血、血清或血浆。
23.用于测定细胞中的ALT活性的水平的方法，所述方法包括测定部分双链端粒环的量，其中所述环的量表示细胞中的ALT活性的水平。
24.用于测定受试者中的癌症的ALT状态的方法，所述方法包括； (a)从受试者获得样品；和 (b)测定样品的部分双链端粒环的存在， 其中所述环的存在表示癌细胞具有ALT活性，并且所述环的不存在表示癌细胞不具有ALT活性。
25.权利要求24的方法，其还包括测定样品中部分双链端粒环的量，从而定量癌细胞中的ALT活性的水平和/或样品中ALT[+]细胞的量或比例。
26.用于诊断受试者的癌症或预测其发作的方法，其中所述癌症显示ALT活性，所述方法包括 (a)从受试者获得样品；和 (b)测定样品的部分双链端粒环的存在和/或量， 其中所述环的存在和/或量表示受试者患有癌症或受试者的癌症发作的可能性。
27.权利要求26的方法，其中所述受试者被怀疑患有癌症，易于患所述癌症或对其易感，具有一个或多个发生癌症的高风险因子或患有癌症倾向综合征。
28.权利要求27的方法，其中所述癌症倾向综合征为维尔纳综合征、罗-汤二氏综合征或李佛美尼综合征。
29.用于测定患有显示ALT活性的癌症的受试者中的疾病控制的方法，所述方法包括 (a)从受试者获得样品；和 (b)测定样品的部分双链端粒环的存在， 其中所述环的存在表示受试者中的疾病控制。
30.权利要求29的方法，其中所述受试者正在经历或已经历癌症的治疗。
31.权利要求29或30的方法，其还包括随时间监控受试者的疾病控制，包括在一段时间内重复步骤(a)和(b)至少一次，和确定所述环的存在和/或量在该段时间内是否改变。
32.用于评估患有显示ALT活性的癌症的受试者中的治疗方案的功效的方法，所述方法包括 (a)使用适当的抗癌治疗方案治疗受试者，持续足以评估所述方案的功效的时间段； (b)从受试者获得样品； (C)测定样品的部分双链端粒环的存在和/或量； (d)在一段时间内重复步骤(b)和(c)至少一次；和 (e)确定所述环的存在和/或量在该段时间内是否改变， 其中所述环的存在和/或量的改变表示受试者中的疾病控制的改变和治疗方案的功效的程度。
33.设计用于患有癌症的受试者的适当治疗方案的方法，所述方法包括确定部分双链端粒环在来源于受试者的样品中的存在或不存在，其中所述环的存在表示ALT[+]癌，从而指示需要ALT特异性治疗方案。
34.设计用于患有显示ALT活性的癌症的受试者的适当治疗方案的方法，所述方法包括在用于治疗癌症的治疗方案存在或不存在的情况下，按照任何上述方面监控部分双链端粒环在受试者的样品中的存在和/或不存在，和调整治疗方案的本性、时间安排和/或强度，以减少或消除所述环，其中所述环的减少或消除表示ALT活性的抑制或ALT[+]细胞的杀死。
35.用于治疗患有显示ALT活性的癌症的受试者的方法，包括给受试者施用按照权利要求33或34设计的治疗方案。
36.用于鉴定适合调节细胞中的ALT活性的化合物的方法，所述方法包括 (a)提供一种或多种显示或能够显示ALT活性的细胞； (b)按照任何上述方面测量部分双链端粒环的量； (C)将所述一种或多种细胞与候选化合物接触；和 (d)根据任何上述方面测定所述环的量， 其中步骤(b)与(d)之间的所述环的量的变化表示候选化合物调节ALT活性的能力。
37.权利要求36的方法，其中步骤(b)与(d)之间所述环的量的减少表示候选化合物抑制ALT活性的能力，而步骤(b)与(d)之间所述环的量的增加表示候选化合物激活ALT活性的能力。
38.权利要求36或37的方法，其中所述候选化合物是抗癌剂、假定的抗癌剂或抗衰老化合物。
全文摘要
本发明涉及用于检测细胞中的活性的替代性端粒延长(ALT)活性的方法和测定法。所述方法和测定法包括检测或测定部分双链端粒环，其中所述环的存在特异于包含活性ALT机制的细胞。在一些实施方案中，所述方法特别用于测定细胞中的ALT活性水平，测定受试者中的癌症的ALT状态，诊断和/或治疗疾病，测定疾病状态，分析治疗功效和鉴定新型治疗剂。
文档编号C12Q1/68GK102639713SQ201080048175
公开日2012年8月15日 申请日期2010年9月21日 优先权日2009年9月22日
发明者J·D·汉森, R·R·雷戴尔 申请人:儿童医学研究所