凝血因子Ⅶ组合物及其制备和使用方法

专利名称：凝血因子Ⅶ组合物及其制备和使用方法
凝血因子Vl I组合物及其制备和使用方法关于联邦资助研究的声明本发明在由美国国立卫生研究院授予的SBIR基金2R44GM079873-02的政府支持下完成。政府具有本发明的某些权利。相关申请的交叉引用本申请要求2009年8月24日提交的美国临时申请No. 61/236，493 ;2009年8月25日提交的美国临时申请No. 61/236，836，2009年11月10日提交的美国临时申请No. 61/280，955，2009年11月10日提交的美国临时申请No. 61/280，956，以及2010年2月3日提交的美国申请No. 12/699, 761的优先权权益，所有这些申请，以及在代理人案号 32808-72. 201下随同提交的共同待决的申请，为了所有目的其全部内容以引用的方式并入本文。
背景技术：
在血友病中，凝血受到缺乏某些血浆凝血因子的干扰。人因子IX(FIX)是一种丝氨酸蛋白酶的酶原，它是凝血级联的内源性途径的一个重要组分。在没有FIX缺乏的个体中，FIX的平均半衰期很短，约为18-24小时。在大约1/30000男性中发生的X-连锁疾病引起的功能FIX缺陷导致血友病B，也称为Christmas病，是以一位被发现缺乏该因子的叫做St印hen Christmas的年轻男孩命名的。已经记载了超过100个因子IX的突变；其中一些不引起症状，但许多导致明显的出血性疾病。如果不及时治疗，血友病B与损伤后无法控制的肌肉、关节和体腔内的出血有关，并可能导致死亡。此前，该疾病的治疗包括施用由来自供体库的人血浆制备的FIX，这具有随之而来的感染血源性病毒的风险，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)。最近，重组FIX产品已经市售。外来提供的因子IX的体内活性受到蛋白质半衰期和凝血抑制剂(包括抗凝血酶III)的限制。因子IX组合物通常有短半衰期，这需要经常注射。此外，目前的基于FIX的疗法由于较差的生物利用度，需要静脉内施用。因此，需要当作为血友病(包括血友病B)的预防和/或治疗方案的一部分施用时具有延长的半衰期和保留活性的因子IX组合物。因子VII是在肝脏中合成且作为具有约50kDa的分子量的单链酶原分泌入血中的凝血因子蛋白。FVII酶原通过蛋白水解性裂解被转化成活化形式(FVIIa)，并且该活性形式当与组织因子(TF)络合时能够将因子IX和因子X转化成它们的活性形式，导致快速凝血酶产生和血纤蛋白形成。因为rFVIIa的循环半衰期约2. 3小时(“Summary Basis forApproval for NovoSeven ”，FDA参考号96-0597)，所以对于血友病受试者和具有因子VII缺陷的受试者的出血病症的治疗，需要多次施用和频繁施用。对治疗蛋白的化学修饰可以降低其体内清除率并随后增加血清半衰期。常见修饰的一个实例是添加聚乙二醇(PEG)部分，聚乙二醇(PEG)部分通常通过PEG上与胺基(例如赖氨酸侧链或N端)反应的醛或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团而与蛋白质偶联。然而，偶联步骤可导致需要分离的不均一产物混合物的形成，导致明显的产物损失和生产复杂性，并且得不到化学上完全均一的产物。而且，如果治疗蛋白结合位点附近的氨基酸侧链被PEG化过程所修饰，那么治疗蛋白的药理学功能可能受阻。Fe结构域与治疗蛋白的融合是增加治疗蛋白大小，因此降低通过肾的清除率的另一种方法。此外，Fe结构域赋予结合溶酶体并通过FcRn受体从溶酶体再循环的能力，这导致增加的药代动力学半衰期。不幸的是，Fe结构域未能在重组表达期间有效折叠，并易于形成被称为包涵体的不溶性沉淀。这些包涵体必须被溶解并且功能性蛋白质必须从错误折叠的聚集物复性，这种过程是耗时、低效且昂贵的。因此，依然需要具有增加半衰期的改善的凝血因子组合物，其能够以较低频率施用，和/或通过更简单的过程以更低成本生产。发明概述本发明涉及用于治疗或改善病症或增强与施用凝血因子IX和/或VII相关的参数的组合物和方法。具体地，本发明提供了包含一种或多种延伸重组多肽(XTEN)的融合蛋白的组合物。主题XTEN通常为非重复序列和非结构化构象。XTEN与选自因子IX (“FIX”)、因子VII( “FVII”)、因子VII-因子IX杂种和其序列变体的凝血因子(“CF”)连接，形成、凝血因子-XTEN融合蛋白(“CFXTEN”)。在某种程度上，本公开涉及包含融合蛋白的药物组合物及其用于治疗凝血因子相关的疾病、病症或疾患。CFXTEN组合物与未连接XTEN的CF相比具有增强的药代动力学性质，其可允许更便利的给药和改善的药效。在一些实施方案中，本发明的CFXTEN组合物不具有选自以下的组分聚乙二醇(PEG)、白蛋白、抗体和抗体片段。在一些实施方案中，本发明提供了分离的因子IX融合蛋白，其包含与选自表I的氨基酸序列具有至少约90 %、或约95 %、或约96 %、或约97 %、或约98 %、或约99 %同一性的因子IX序列。具有这种序列同一性的因子IX进一步与具有至少约100至约3000个氨基酸残基的延伸重组多肽(XTEN)连接。在一个实施方案中，XTEN与FIX或FVII CF的C-端连接。在一些实施方案中，本发明提供了分离的因子VII融合蛋白，其包含与选自表2的氨基酸序列具有至少约90 %、或约95 %、或约96 %、或约97 %、或约98 %、或约99 %同一性的因子VII。具有这种序列的因子VII与延伸重组多肽(XTEN)连接。具有连接单个XTEN的单个FIX或单个FVII的CFXTEN的非限制性实例示于表41中。在一个实施方案中，本发明提供了与来自表41的CFXTEN相比具有至少约80%序列同一性，或者与来自表41的CFXTEN相比具有至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或约 100%序列同一性的CFXTEN组合物。在一些实施方案中，融合蛋白的CF和XTEN组分经由可通过蛋白酶(包括内源性哺乳动物蛋白酶)裂解的裂解序列连接。这类蛋白酶的实例包括但不限于FXIa、FXIIa、激肽释放酶、FVIIa、FIXa, FXa、凝血酶、弹性蛋白酶_2、粒酶B、MMP-12、MMP-13、MMP-17或MMP-20、TEV、肠激酶、鼻病毒3C蛋白酶和分选酶A，或选自表7的序列。在一个实施方案中，具有裂解序列的CFXTEN组合物与来自表42的CFXTEN相比具有至少约80%序列同一性的序列，或者与来自表42的CFXTEN相比具有至少约81%、82%、83%、84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%，或约100%序列同一性。然而，本发明还提供了用表I或表2的任一个CF序列替换表42的序列中的CF，以及用表4的任一个XTEN序列替换表42的序列中的XTEN，以及用表7的任何裂解序列替换表42的序列中的裂解序列。在具有裂解序列的CFXTEN实施方案中，通过蛋白酶从CF释放XTEN而裂解该裂解序列。在前述的一些实施方案中，一旦CF组分通过裂解序列的裂解而从XTEN释放，它就会变得具有生物活性或活性增加，其中促凝活性与未连接XTEN的相应的FIX或FVII相比至少为约30 %、或至少约40 %、或至少约50 %、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%。本发明提供了分离的CFXTEN融合蛋白，其包含约36至约3000个氨基酸残基的第二 XTEN，该第二 XTEN可以与第一 XTEN相同或可以不同，其中所述第二 XTEN可以加入CF的任何两个相邻结构域之间，即在Gla、EFGl、EGF2、活化肽和蛋白酶结构域之间，或加入CF的结构域序列的现有环状结构域的序列内，如实施例中更完全描述的。在一个实施方案中，第一和第二 XTEN可以是选自表4或9-13中任一者的氨基酸序列，或可以与选自表4和9_13的序列相比表现出至少至少约80%、或至少约90%、或至少约91 %、或至少约92%、或至少约93%、或至少约94%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%序列同一性。在另一实施方案中，分离的融合蛋白包含约36至约3000个氨基酸残基的第二 XTEN。融合蛋白可采用表6的多-XTEN构型或其变体。本发明提供了包含连接因子VII的XTEN的CFXTEN组合物，该因子VII包含可通过相同或不同的促凝蛋白酶裂解的一个或多个异源裂解序列。在前述的一些实施方案中，因子VII包含加入或替换FVII序列部分的因子XI的异源序列，形成了因子VII-因子IX杂种序列变体。在一些实施方案中，将来自FIX活化肽结构域的部分或整个序列加入或替换桥连FVII组分的EFG2和蛋白酶结构域之间结构域的FVII序列，形成可以活化为凝血级联内源性系统的部分(例如，活化因子XI)的组合物。在这类情况中，因子VII-因子IXCFXTEN组合物可以在不存在组织因子的情况下由促凝蛋白酶活化，使得当这类因子缺乏时(例如，在血友病A或B中)或当存在对这些因子的抑制剂时，CFXTEN可以在内源性凝血途径中充当因子VIII和IX的旁路。在一个实施方案中，FVII-FIX序列变体加入全长FIXAP结构域加上至少约2个、或至少约3个、或至少约4个、或至少约5个、或至少约6个、或至少约7个、或至少约8个、或至少约9个、或至少约10个、或至少约11个、或至少约12个 或更多氨基酸，该氨基酸侧连在FIX AP结构域的R145-A146和R180-V181裂解位点的一侧或两侧上的氨基酸残基(例如，在12个侧翼氨基酸在N端侧而5个侧翼氨基酸在C端侧的情况中，序列 RVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGE)。在另一实施方案中，在最佳比对时，CFXTEN FVII-FIX序列变体包含与序列KLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRV 相比表现出至少至少约 80 %、或至少约 90 %、或至少约91 %、或至少约92%、或至少约93%、或至少约94%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或100%同一性的异源FIX序列。在其它实施方案中，CFXTEN包含加入FIX AP的一部分的FVII-FIX序列变体，该FIX AP部分包括位于R145-A146裂解位点的一侧或两侧的至少约2个、或至少约3个、或至少约4个、或至少约5个、或更多氨基酸的序列(例如，在6个侧翼氨基酸在裂解位点任一侧上的情况中，序列TSKLTRAETVFP)，或位于R180-V181裂解位点的一侧或两侧的至少约2个、或至少约3个、或至少约4个、或至少约5个或更多氨基酸的序列(例如，在4个氨基酸在N端侧翼上且缬氨酸作为来自FIX的裂解位点的C端的情况中的序列和DFTRV)。在前述的一个实施方案中，在最佳比对时，CFXTENFVII-FIX序列变体包含与选自TSKLTRAETVFP和FNDFTRV的序列相比表现出至少至少约80%、或至少约90%、或至少约91 %、或至少约92%、或至少约93%、或至少约94%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或100%同一性的异源FIX序列。
在另一实施方案中，CFXTEN包含上文所公开的FVII-FIX序列变体，该FVII-FIX序列变体进一步包括与FVII组分C端和融合蛋白的XTEN组分之间的连接子相同的AP裂解序列，例如，FVII变体-AP序列-XTEN的N端至C端构型，由此当由与FVII向FVIIa转变的促凝蛋白酶相同的促凝蛋白酶裂解时，允许FVII变体组分从CFXTEN融合蛋白中释放。在一个实施方案中，任何前述实施方案的FVII-FIX CFXTEN都包括作为FVII-FIX序列和XTEN之间的连接子的因子XI裂解序列KLTRAET，由此使FVII变体组分从CFXTEN融合蛋白通过启动内源性凝血级联反应而释放。在一个实施方案中，本发明提供了具有与来自表43的序列相比表现出至少约80%、或至少约85%，或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%序列同一性的FVII-FIX杂种序列的CFXTEN。在其它实施方案中，本发明提供了具有加入的FIX-衍生的AP裂解序列的FVII-FIX序列变体，所述AP裂解序列未连接XTEN。在一个实施方案中，不含XTEN的FVII-FIX序列与来自表43的不含XTEN的序列相比表现出至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%序列同一性。
在CFXTEN组合物的一个实施方案中，本发明提供了式I的融合蛋白(XTEN) X-CF- (XTEN) y I其中对于每次出现独立地，CF是凝血因子；x是0或I且y是0或1，其中x+y彡I ;且XTEN是延伸重组多肽。在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了式II的融合蛋白(XTEN) x- (CF) - (S) y- (XTEN) y 11其中对于每次出现独立地，CF是凝血因子a ；S是具有I至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；x是0或I且y是0或1，其中x+y ^ I ;且XTEN是延伸重组多肽。在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白是式III (XTEN) x-⑶ x_ (CF)-⑶「(XTEN) y III其中对于每次出现独立地，CF是凝血因子；S是具有I至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；x是0或I且y是0或I,其中x+y > I ;且XTEN是延伸重组多肽。在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了式IV的分离融合蛋白(Gla) - (XTEN) u_ (EGFl) - (XTEN) v_ (EGF2) - (XTEN) w- (AP) - (XTEN) x- (Pro) - (S)y- (XTEN) z IV其中对于每次出现独立地，Gla是FIX的Gla结构域；EGF1是FIX的EGFl结构域；EGF2是FIX的EFG2结构域；AP是FIX的激活肽；PR0是FIX的蛋白酶结构域；S是具有I至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；u是0或I ;v是0或I ;x是0或l;y是0或l;z是0或1，条件是u+v+w+x+z彡I ;且XTEN是延伸重组多肽。在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了式V的分离的融合蛋白(Gla) - (XTEN) u_ (EGFl) - (XTEN) v_ (EGF2) - (API) - (XTEN) w- (AP2) - (XTEN)x-(Pro)-(S)y-(XTEN)z V其中对于每次出现独立地，Gla是FIX的Gla结构域；EGF1是FIX的EGFl结构域；EGF2是FIX的EFG2结构域；AP1是FIX的激活肽结构域的N端序列部分，其包括AP结构域的第一天然裂解序列；AP2是FIX的激活肽结构域的C端序列部分，其包括AP结构域的第二天然裂解序列；PRO是FIX蛋白酶结构域；S是具有I至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；11是0或1^是0或1;1是0或1;7是0或1;2是0或1，条件是u+v+w+x+z彡I ;且XTEN是延伸重组多肽。在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了式VI的分离融合蛋白(Gla) - (XTEN) u_ (EGFl) - (XTEN) v_ (EGF2) - (XTEN) w- (Pro) - (S) x- (XTEN) y VI其中对于每次出现独立地，Gla是FVII的Gla结构域；EGF1是FVII的EGFl结构域；EGF2是FVII的EFG2结构域；PR0是FVII的蛋白酶结构域；S是具有I至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；11是0或1^是0或1;1是0或1;7是0或1，条件是u+v+w+y彡I ;且XTEN是延伸重组多肽。在CFXTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供了式VII的分离融合蛋白(Gla) - (XTEN) t_ (EGFl) - (XTEN) u_ (EGF2) - (API) v_ (XTEN) w- (AP2) x- (Pro) - (S)y-(XTEN)z VII其中对于每次出现独立地，Gla是FVII的Gla结构域；EGF1是FVII的EGFl结构域；EGF2是FVII的EFG2结构域；PR0是FVII的蛋白酶结构域；AP1是FIX的激活肽结构域的N端序列部分，其包括天然裂解序列；AP2是FIX的激活肽结构域的C-端序列部分，其包括天然裂解序列；S是具有I至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列4是0或1;11是0或1^是0或1;1是0或1;7是0或1;2是0或1，条件是t+u+w+z彡I ;且XTEN是延伸重组多肽。在该实施方案中，CFXTEN组合物可以包含整个所述FIX激活肽结构域序列、或来自因子IX的激活肽结构域的一个或两个裂解序列，例如，如上文更完全描述的，位于R145-A146裂解位点侧翼的至少约3至约12个氨基酸的序列，以及位于R180-V181裂解位点侧翼的至少约I至约5个氨基酸的序列。本发明还涵盖表7中任何其它裂解序列替换AP裂解序列。使用本文所公开的任何适当的体外测定(例如，表40的测定或实施例中所述的测定)，可以评估本文所述的实施方案的CFXTEN组合物的保留活性(包括在任何加入的XTEN-释放裂解位点裂解后)，以确定该构型在治疗凝血-因子相关的疾病、疾患或病症中用作治疗剂的适合性。在一个实施方案中，CFXTEN与未连接XTEN的天然CF相比表现出至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%的活性。在另一实施方案中，通过酶促裂解连接CF和XTEN组分的加入的裂解序列而从CFXTEN释放的CF组分与未连接XTEN的天然CF相比表现出至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%的活性。所述CFXTEN组合物的XTEN具有至少约200、或至少约400、或至少约800、或至少约900、或至少约1000、或至少约2000，最多约3000个氨基酸残基。所述CFXTEN融合蛋白组合物的XTEN的特征在于它们具有下列特征的一种或多种(a)至少第一 XTEN包含显示与类似长度的选自表4所示序列的氨基酸序列具有至少约90 %、或约95 %、或约96 %、或约97%、或约98%、或约99%同一性的至少约200个连续氨基酸；(b)当通过TEPIT0PE算法分析时，所述XTEN序列缺少预测的T细胞表位，其中所述TEPIT0PE算法对所述XTEN序列 中表位的预测是基于_5、或-6、或-7、或-8、或-9或更高的评分；(c)所述XTEN具有小于
10、或小于9、或小于8、或小于7、或小于6、或小于5、或甚至更小的序列评分；(d)天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总和小于所述XTEN总氨基酸序列的10%; (e)蛋氨酸和色氨酸残基的总和小于所述XTEN总氨基酸序列的2% ; (f)通过GOR算法确定，所述XTEN具有大于90%的无规卷曲形成、或约95 %、或约96 %、或约97 %、或约98 %、或约99 %的无规卷曲形成；(g)如通过Chou-Fasman算法确定，所述XTEN序列具有小于2%的a螺旋和2%的P折叠；和
(h)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和构成所述XTEN的总氨基酸残基的超过约90 %、或约95 %、或约96 %、或约97 %、或约98 %、或约99%。 在另一实施方案中，本发明提供了 CFXTEN融合蛋白，其中所述XTEN特征在于 天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总和小于所述XTEN的总氨基酸序列的10%，甲硫氨酸和色氨酸残基的总和小于所述XTEN总氨基酸序列的2%，所述XTEN序列具有小于5%的带正电荷的氨基酸残基，通过GOR算法确定所述XTEN序列具有大于90%的无规卷曲形成、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%的无规卷曲形成；并且通过Chou-Fasman算法确定所述XTEN序列具有小于2%的a螺旋和2%的0折叠。在一些实施方案中，没有一种类型的氨基酸构成超过30 %的CFXTEN的XTEN序列。在另一实施方案中，本发明提供了 CFXTEN融合蛋白，其中所述XTEN特征在于XTEN序列的至少约80 %、或至少约90 %、或至少约91%、或至少约92 %、或至少约93 %、或至少约94%、或至少约95 %、或至少约96 %、或至少约97 %、或至少约98 %、或至少约99 %由非重叠序列基序组成，其中每个序列基序具有约9至约14个氨基酸残基，并且其中任何两个连续氨基酸残基的序列在每个序列基序中出现不超过两次，所述序列基序由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸⑶、苏氨酸⑴、谷氨酸(E)和脯氨酸⑵的4至6个类型的氨基酸组成。在一个实施方案中，所述XTEN特征在于至少约80%、或至少约90%、或至少约91 %、或至少约92%、或至少约93%、或至少约94%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%的XTEN序列由非重叠序列基序组成，其中所述基序选自表3。在一些实施方案中，所述XTEN具有其中没有三个连续氨基酸是相同的序列，除非所述氨基酸是丝氨酸，在这种情况下，不超过三个连续氨基酸是丝氨酸残基。在其它实施方案中，所述CFXTEN的XTEN组分具有小于10、或小于9、或小于8、或小于7、或小于6、或小于
5、或更小的序列得分。在该段的实施方案中，所述XTEN特征为“基本上非重复的”。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少第二 XTEN的CFXTEN，其中所述XTEN序列与来自表4、表9、表10、表11、表12或表13的序列相比表现出至少约80%、或至少约90%、或至少约91 %、或至少约92%、或至少约93%、或至少约94%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%序列同一性。在一些实施方案中，CFXTEN融合蛋白与未连接XTEN的CF相比表现出增强的药代动力学性质，其中增强的性质包括但不限于与未连接XTEN的CF相比更长的终末半衰期、更大的曲线下面积、血药浓度在治疗窗内维持时间的增加、连续剂量之间的时间的增加导致血药浓度在治疗窗内、和随时间的可施用的摩尔剂量的降低，仍会导致血药浓度在组合物的治疗窗内。在一些实施方案中，施用给受试者的CFXTEN融合蛋白的终末半衰期增加至以类似剂量施用给受试者的未连接XTEN的CF的终末半衰期的至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约8倍、或至少约10倍、或至少约20倍、或至少约40倍、或至少约60倍、或至少约100倍、或甚至更高。在其它实施方案中，施用给受试者的CFXTEN融合蛋白的终末半衰期为至少约12h、或至少约24h、或至少约48h、或至少约72h、或至少约96h、或至少约120h、或至少约144h、或至少约21日或更长。在其它实施方案中，增强的药代动力学性质由以下事实反映CFXTEN融合蛋白在给定时段在治疗窗内维持的血药浓度是以类似剂量施用给受试者的未连接XTEN的CF的至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约8倍、或至少约10倍、或至少约20倍、或至少约40倍、或至少约60倍、或至少约100倍。与未连接XTEN的相应CF相比，半衰期和治疗窗内维持时间的增加允许较低频率的给药和施用给受试者的融合蛋白量(以摩尔当量表示)的减少。在一个实施方案中，使用治疗-有效剂量方案向受试者施用CFXTEN导致融合蛋白的血药水平的至少两个连续Cmax峰和/或Cmin谷之间的时间增加至使用类似剂量方案施用给受试者的未连接至XTEN的CF的至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至少8倍、或至少10倍、或至少约20倍、或至少约40倍、或至少约60倍、或至少约100倍，或更高。在一些实施方案中，与未连接XTEN的生物活性蛋白相比，与XTEN连接时XTEN增 强了 CF的热稳定性，其中热稳定性通过在暴露于约37°C的温度下至少约7天之后测量生物活性的保留来确定。在前述一个实施方案中，与未连接XTEN的CF相比，生物活性保留时间增加至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约100%、或约150%、至少约200%、至少约300%或约500%。在一些实施方案中，构造分离的融合蛋白使之与未连接XTEN的相应CF相比具有降低的对清除受体的结合亲和力。在一个实施方案中，CFXTEN融合蛋白对CF的清除受体表现出如下范围的结合亲和力未连接XTEN的相应CF的结合亲和力的约0. 01 % -30%、或约0. 1%至约20%、或约1%至约15%、或约2%至约10%。在另一实施方案中，亲和力降低的CFXTEN融合蛋白可以具有降低的活性清除和相应的半衰期增加，半衰期是未连接XTEN的相应CF的至少约3倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、或至少约9倍、或至少约10倍、或至少约12倍、或至少约15倍、或至少约17倍、或至少约20倍、或至少约30倍、或至少约50倍、或至少约100倍。在一些实施方案中，本发明提供了 CFXTEN融合蛋白，其中CFXTEN在生理条件下表现出溶解度增加至未连接XTEN的CF的溶解度的至少3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、或至少约9倍、或至少约10倍、或至少约15倍、或至少20倍、或至少40倍、或至少60倍。在一些实施方案中，通过尺寸排阻色谱测定，CFXTEN融合蛋白表现出与实际分子量相比增加的表观分子量。在某些实施方案中，包含FIX和至少第一 XTEN的CF表现出至少约400kD、或至少约500kD、或至少约700kD、或至少约1000kD、或至少约1400kD、或至少约1600kD、或至少约1800kD、或至少约2000kD的表观分子量，而融合蛋白的每个FIX组分的实际分子量为约50kD且融合蛋白的分子量的范围为约70至约125kDa。在其它实施方案中，包含FVII和至少第一 XTEN的CF表现出至少约400kD、或至少约500kD、或至少约700kD、或至少约1000kD、或至少约1400kD、或至少约1600kD、或至少约1800kD、或至少约2000kD的表观分子量，而融合蛋白的每个FIX组分的实际分子量为约50kD且融合蛋白的分子量为约70至约125kDa。因此，CFXTEN融合蛋白的表观分子量可以是融合蛋白的实际分子量的约6倍、或约8倍、或约10倍、或约12倍、或约15倍。在一些情况下，本文所公开的任何实施方案的分离的CFXTEN融合蛋白在生理条件下表现出大于约4、或约5、或约6、或约7、或约8、或约10、或大于约15的表观分子量因子。在一些实施方案中，治疗有效剂量的式I-VII之一的融合蛋白施用给有相应需要的受试者可以导致在融合蛋白治疗窗内维持的时间增加至以类似剂量施用给受试者的未连接XTEN的相应CF的至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍或更多。在其它情况下，治疗有效剂量的式I-VII的实施方案的融合蛋白施用给有相应需要的受试者可以导致与以类似剂量施用的未连接XTEN的CF相比，维持治疗有效剂量方案所必需的连续剂量之间时间增加至少48h、或至少72h、或至少约96h、或至少约120h、或至少约7天、或至少约14天、或至少约21天。所公开的组合物的融合蛋白可以被设计为具有不同构型，CF的N端至C端和 XTEN以及任选的间隔区序列，包括但不限于XTEN-CF、CF-XTEN、XTEN-S-CF, CF-S-XTEN、 XTEN-CF-XTEN、CF-CF-XTEN、XTEN-CF-CF, CF-S-CF-XTEN、XTEN-CF-S-CF 及其多聚体。如本文所公开的，构型的选择可以赋予特定的药代动力学性质、理化性质或药理性质，包括就加入的裂解序列而言、CF的释放伴随活性增加。在一些实施方案中，所述CFXTEN融合蛋白特征在于(i)与在另外的等效剂量下施用于受试者的未连接XTEN的相应凝血因子相比，它在施用于受试者时具有更长的半衰期；(ii)与以另外等同的剂量方案施用给受试者的缺少XTEN的相应凝血因子相比，当较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时,所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的曲线下面积(AUC)与以另外等同的剂量方案施用给受试者的缺少XTEN的相应凝血因子相比，当较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的治疗效应；(iv)与使用另外等同的摩尔量施用给受试者的未连接XTEN的相应凝血因子相比，当所述融合蛋白以较低频率施用给受试者时，所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的曲线下面积(AUC) ；(v)与使用另外等同的摩尔量施用给受试者的未连接XTEN的相应凝血因子相比，当所述融合蛋白以较低频率施用给受试者时，所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的治疗效应；(vi)与以另外等同的剂量期施用给受试者的未连接XTEN的相应凝血因子相比，当累积较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的曲线下面积(AUC);或(vii)与以另外等同的剂量期施用给受试者的未连接XTEN的相应凝血因子相比，当累积较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的治疗效应。本发明提供了制备包含与一个或多个延伸重组多肽(XTEN)融合的因子VII或因子IX或因子VII-因子IX杂种凝血因子的融合蛋白的方法，该方法包括(a)提供包含编码所述融合蛋白的重组多核苷酸分子的宿主细胞；(b)在允许所述融合蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞；和(C)从培养物中回收所述融合蛋白。在该方法的一个实施方案中，融合蛋白的凝血因子与选自表I或表2的序列相比具有至少90%序列同一性。在该方法的另一实施方案中，所表达的融合蛋白的一个或多个XTEN与选自表4的序列相比具有至少约90%、或约91 %、或约92%、或约93%、或约94%、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%至约100%序列同一性。在该方法的另一实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在该方法的另一实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。在该方法的另一实施方案中，分离的融合蛋白以基本上可溶的形式从宿主细胞的细胞质中回收。本发明提供了包含选自以下的多核苷酸序列的分离的核酸(a)编码前述实施方案任一个的融合蛋白的多核苷酸，或(b) (a)的多核苷酸的互补体。在一个实施方案中，本发明提供了分离的核酸，其包含与以下相比具有至少80%序列同一性、或约85%、或至少约90%、或约91 %、或约92%、或约93%、或约94%、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%至约100%序列同一性的多核苷酸序列(a)选自表41和表42的类似长度的多核苷酸序列；或(b) (a)的多核苷酸的互补体。本发明提供了包含与本段所述的上述实施方案任何一个的核酸的表达载体。在一个实施方案中，前述表达载体还包含与多核苷酸序列可操作连接的重组调控序列。在另一实施方案中，前述表达载体的多核苷酸序列与编码分泌信号序列的多核苷酸在框内融合，所述分泌信号序列可以是CF天然信号序列。本发明提供了宿主细胞，其包含本段描述的上述任何实施方案的表达载体。在一个实施方案中，所述的宿主细胞是真核细胞。在另一实施方案中，所述的宿主细胞是CHO细胞。在另一实、施方案中，所述是宿主细胞是细胞。在一个实施方案中，本发明提供了包含前述实施方案的任何一个的融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。在另一实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包括包装材料和包含前述实施方案的药物组合物的至少第一容器以及标识所述药物组合物以及存储和处理条件的标签，以及关于所述药物组合的重建和/或施用给受试者的一张说明。本发明提供了治疗受试者凝血紊乱或凝血因子相关的疾病、疾患或病症的方法，该方法包括对所述受试者施用治疗有效量的前述实施方案任一个的CFXTEN融合蛋白。在该方法的一个实施方案中，凝血因子相关病症选自出血疾患(例如，血小板功能缺损、血小板减少或von Willebrand病)、凝血紊乱(凝血的任何疾患,包括凝血因子缺乏)、血友病B(又称为Christmas病)、因子IX-相关的出血疾患、因子VII缺乏、血友病A、血管损伤、未患血友病受试者的失控出血、创伤或手术引起的出血、由抗凝治疗引起的出血和由肝病引起的出血。在治疗方法的一个实施方案中，所述凝血紊乱是血友病A。在治疗方法的一个实施方案中，所述凝血紊乱是血友病B。在治疗方法的另一实施方案中，所述凝血紊乱是因子VII缺乏。在治疗方法的另一实施方案中，将所述CFXTEN施用于受试者以控制出血事件。在治疗方法的另一实施方案中，将包含因子VII-因子IX序列杂种的CFXTEN施用于受试者以控制出血事件，其中所述CFXTEN由内源性凝血级联的促凝蛋白酶(例如，活化因子XI)活化。在另一实施方案中，本发明提供了治疗受试者凝血因子缺乏的方法，该方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的本文所提供的因子VII的组合物。在一些实施方案中，组合物可以皮下、肌肉内或静脉内施用。在一个实施方案中，组合物以治疗有效量施用，其中所述施用导致与以类似剂量施用给受试者的未连接XTEN的融合蛋白的相应CF相比，在融合蛋白的治疗窗内维持的时间增加。在治疗窗内维持的时间增加至未连接XTEN的CF的至少3倍，或者可选地是未连接XTEN的相应CF的至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少约30倍、或至少约50倍、或至少约100倍。在治疗方法的一些实施方案中，(i)与以另外相同的剂量方案施用的未连接XTEN的相应凝血因子相比，施用较小摩尔量(例如，约1/2、或约1/3、或约1/4、或约1/5、或约1/6、或约1/8、或约1/100或更少)的所述融合蛋白，并且所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的曲线下面积和/或类似的治疗效应；(ii)与使用另外相同的剂量的未连接XTEN的相应凝血因子相比，所述融合蛋白以较低频率(例如，每2天一次、约每7天一次、约每14天一次、约每21天一次、或约每月一次)施用，并且所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的曲线下面积和/或类似的治疗效应；或(iii)与以另外相同的剂量方案的未连接XTEN的相应凝血因子相比，施用累积较低摩尔量的所述融合蛋白(例如,约5%、或约10%、或约20%、或约40%、或约50%、或约60%、或约70%、或约80%、或约90% )，所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的曲线下面积和/或类似的治疗效应。所述累积更低的摩尔量是针对至少约一周、或约14天、或约21天、或约一个月的时段的测量。在治疗方法的一些实施方案中，治疗效应是选自以下的测量参数凝血因子血药浓度、凝血酶原(PT)测定、部分活化凝血酶原(aPTT)测定、出血时间测定、全血凝血时间(WBCT)和血栓弹力描记法。在另一实施方案中，本发明提供了治疗疾病、疾患或病症的方法，包括利用使用治疗有效剂量方案施用的多次连续剂量的药物组合物给受试者施用上述药物组合物。在前述的一个实施方案中，所述治疗有效剂量方案可以导致所述融合蛋白的血药水平的至少两个 连续Cmax峰和/或Cmin谷之间的时间增加至以类似剂量方案施用给受试者的未连接所述融合蛋白的相应融合蛋白的CF的至少3倍、或可选地至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少约30倍、或至少约50倍、或至少约100倍。前述另一实施方案中，与使用治疗有效方案施用给受试者的未连接融合蛋白的相应生物活性蛋白组分相比，使用药物组合物的融合蛋白的较低频率给药或较低总剂量(以摩尔计)施用融合蛋白导致凝血因子相关的疾病的至少一个测量参数的改善。本发明还提供了包含前述实施方案任何一个的融合蛋白的组合物在制备用于治疗有相应需要的受试者的疾病、疾患或病症的药剂中的用途。在前述一个实施方案中，所述疾病、疾患或病症选自出血疾患、凝血紊乱、血友病B (又称为Christmas病)、因子IX-相关的出血疾患、因子VII缺乏、血管损伤、创伤或手术引起的出血、由抗凝治疗和肝病引起的出血。所公开的实施方案的任何一个可以根据感兴趣的应用而单独实施或者组合实施。通过引用并入在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用的方式并入，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请明确且单独地被指明而通过引用的方式并入。附图简述本发明的特征和优势可以参考以下详述和列出示例性实施方案的附图来进一步解释。图I示出了示例性CFXTEN(FIX-XTEN)融合蛋白的示意图。图IA示出天然FIX的结构域构造，该天然FIX具有Y -羧基谷氨酸盐结构域、EGFl和EGF2结构域、活化肽和蛋白酶结构域，其中XTEN在C端连接。箭头指示活化肽结构域的裂解位点。图IB示出具有经由裂解序列连接至C端的XTEN多肽的FIX分子，并指示蛋白水解性裂解释放XTEN的位点(箭头指示活化肽结构域的裂解位点和XTEN的释放点)。图2显示FIX-XTEN的CXTEN构型和缔合的蛋白酶裂解位点的若干实例。图2A示出具有在FIX的活化肽内的两个蛋白水解性裂解位点的FIX-XTEN (箭头)，以及无裂解位点连接子的C端XTEN。图2B的构型与图2A相似，但C端XTEN经由裂解序列连接，箭头指示释放位点。图2C示出FIX-XTEN的三种构型，其中XTEN在FIX的不同结构域之间整合。图2D示出具有插入天然裂解位点间的活化肽中的XTEN部分的FIX-XTEN，一旦FIX蛋白水解性活化，所述FIX-XTEN将会释放XTEN。图2E显示包含插入不同结构域之间的多XTEN序列并且在C端添加可释放的XTEN的FIX-XTEN。图2F显示XTEN已插入FIX环状结构域内情况下的FIX-XTEN。图3是凝血级联的示意图，其示出外源性和内源性途径。图4示出FVII-XTEN的CXTEN构型的若干实例。图4A示出并未活化的FVII-XTEN。图4B示出在FVII-XTEN中肽已裂解，形成活化的FVIIa-XTEN ；图4C显示具有可释放XTEN的裂解序列的FVII-XTEN组合物，其中FVII组分已被活化，含有活化蛋白酶(AP)的裂解位点和释放蛋白酶(RP)的第二裂解位点。图4D示出含有释放蛋白酶的裂解位点的活化FVIIa-XTEN的组合物。 图5显示使用内部XTEN的FVII-XTEN设计方法的策略。图5A-D示出在FVII结构域(左边是未活化的FVII而在右边是FVII活化形式)的边界，XTEN插入的示例性位点(A =XTEN在Gla和EGFl结构域之间插入，B =XTEN在EGFl和EGF2之间插入。C =XTEN在活化肽的C端插入，D :XTEN在活化肽的N端插入)。图5E示出FVII-XTEN的实例，其中XTEN位于独立的结构域融合蛋白内的外环内，左边是未活化的FVII而右边是FVIIa。相对于显示为粗线的XTEN, FVII中的活化肽显示为细线。图6显示与图5基本上相同的构建体，但是在每个构建体的C端连接有XTEN。图7示出一些不同部位的示意图，其中XTEN可以内插入凝血因子FVII或FIX序列。图8是凝血系统主要组分的示意图。图7A :具有内源性和外源性级联组分的正常凝血系统。图7B显示一种变化，在该变化中FVII-XTEN的无活性/低活性形式(FVII*)意欲在施用后被内源性活化时旁路内源性系统的FIX和FVIII组分。图9是通过对来自pBC0014CH0-Kl转化体的初步筛选的克隆进行ELISA而得到的细胞群集大小分布(灰色条)和以ng/ml计的FVII ELISA滴度(黑色条)的图(由于空间不够，在条的下面并没有标记所有的克隆)(参见实施例25的实验细节)。根据ELISA滴度低至高(从左至右)分选克隆。

图10是前pBC0014克隆的细胞计数(白色条)和以ng/ml计的FVII滴度(黑色条)的图(参见实施例25的实验细节)。根据ELISA滴度低至高(从左至右)分选克隆。图11是FVII滴度与前PBC0014克隆的细胞计数的比值的图(参见实施例25的实验细节)。根据比值低至高(从左至右)分选克隆。图12是根据ELISA、凝血、ELISA/细胞计数和凝血/细胞计数比值的前pBC0014克隆的蛋白质印迹(参见实施例25的实验细节)。克隆6G1表达了截短产物，且并未进一步评估。图13是根据ELISA、凝血、ELISA/细胞计数和凝血/细胞计数比值的前pBC0016克隆的蛋白质印迹(参见实施例25的实验细节)。图14是根据ELISA、凝血、ELISA/细胞计数和凝血/细胞计数比值的前pBC0018克隆的蛋白质印迹(参见实施例25的实验细节)。克隆3B2表达了截短产物，且并未进一步评估。图15示出通过抗GLA亲和色谱纯化FVII-AE864(参见实施例26的实验细节)。SDS-PAGE分析表明从浓缩的上清液中纯化FVII-AE864和纯度> 90%的EDTA洗脱级分。图16示出通过FXa处理将FVII-XTEN融合物活化为FVIIa-XTEN融合物(参见实施例26的实验细节)。SDS-PAGE分析表明在Fxa处理后，而不是在未处理的样本中，轻链条带在还原条件下的外观。此外，上面的条带出现下移，这表明轻链损失。图17示出表明FVII-XTEN融合物自体活化为FVIIa-XTEN融合物的SDS-PAGE(参见实施例26的实验细节)。SDS-PAGE分析表明在FXa处理后且在4°C下用CaCl2高浓度孵育后，轻链条带在还原条件下的外观。此外，上面的条带出现下移，这表明轻链损失。图18示出FVII-AE864和FVII-AE288的SEC分析(参见实施例26的实验细节)。 SEC示出在柱的空体积( 22ml)处有极低污染而无聚集物的单分散群。图19示出由阴离子交换色谱纯化FVII_AE864(参见实施例26的实验细节)。色谱图描绘了来自Macrocap Q柱的总蛋白质含量和FVII活性物的洗脱图，大量活性物迟于污染蛋白质洗脱，产生净5倍纯化。图20示出由疏水相互作用色谱纯化FVII_AE864(参见实施例26的实验细节)。色谱图描绘了来自toyopearl phenyl柱的总蛋白质含量和FVII活性物的洗脱图，大量活性物早于污染蛋白质洗脱，产生净2倍纯化。图21示出两种色谱法的产量，其表明用阴离子交换色谱从单体FVII-AE864中移除了聚集蛋白(参见实施例26的实验细节)。图21A是描绘来自macrocap Q柱的FVII-XTEN洗脱图的色谱图，双峰在缓冲相关的前峰后洗脱。图21B示出前后macrocap Q峰的SEC色谱图，表明在前峰中没有聚集物。图22示出ELISA或aPTT测定的结果，该结果示出与FIX-XTEN相比，FIX/cFXI/XTEN具有增高的活性(参见实施例29的实验细节)。短暂表达的FIX构建体通过ELISA来测定抗原含量，并通过基于aPTT的测定来测定活性。当FIX-XTEN与FIX/cFXI/XTEN构建体的抗原含量相似时，活性显著增加。在测定中这种增加归因于FXI蛋白酶的特异作用，因为FIX/cTEV/XTEN与FIX-XTEN并没有示出显著不同的活性。记录FIX样本的ELISA滴度为197ng/ml且在图的比例之外。图23示出给大鼠皮下施用单次剂量后药代动力学的图，示出导出的当量FIX浓度，如实施例30所述。图24示出给大鼠皮下施用单次剂量后药代动力学的图，示出导出的当量FIX浓度，如实施例31所述。图25示出在皮下或静脉内施用与不同长度的非结构化多肽连接的GFP的不同组合物的单次剂量后，食蟹猴的药代动力学的图(血浆浓度)，如实施例39所述。所述组合物是 GFP-L288、GFP-L576、GFP_XTEN_AF576、GFP-Y576 和 XTEN_AD836_GFP。在注射后不同时间分析血样，并使用抗GFP的多克隆抗体用于捕获以及使用相同多克隆抗体的生物素化制剂用于检测，通过ELISA测定GFP在血浆中的浓度。结果显示为相对于给药后时间(小时)的血浆浓度，并且示出，特别是XTEN_AD836-GFP (具有最长序列长度的XTEN的组合物)的半衰期显著增加。构建体的序列长度越短，GFP-L288半衰期越短。图26示出来自与GFP的N端融合的融合蛋白XTEN_AE864的稳定性研究的样本SDS-PAGE凝胶(参见实施例40)。使GFP-XTEN在食蟹猴血浆和大鼠肾裂解物中于37°C下孵育达7天。此外，还评估了施用给食蟹猴的GFP-XTEN。在第0、1和7天提取样本并通过SDS PAGE分析，随后使用Western分析和抗GFP抗体进行检测。图27示出用于来自LCW546、LCW547和LCW552的克隆的N端序列中第三和第四密码子的三个随机文库(参见实施例14的实验细节)。如所示的，将文库设计为第三和第四残基被修饰而使得允许的XTEN密码子的所有组合存在于这些位置。为了使每个文库包含所有这些允许的XTEN密码子，设计具有第三和第四残基密码子多样性的编码12个氨基酸的9对寡核苷酸、使其退火并连接到Ndel/Bsal限制酶消化的填充载体pCW0551 (填充片段-XTEN_AM875-GFP)，并转化入大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞以获得三个文库LCW0569、LCW0570 和 LCW0571 的菌落。图28示出如实施例15所述优化步骤之后针对前75个克隆的GFP荧光信号的再测试的直方图，相对于基准CBD_AM875构建体。结果指示几个克隆目前优于基准克隆。
图29是为联合N端48个氨基酸的两个区域的密码子优化偏好而进行的重组方法的示意图(参见实施例16的实验细节)。该方法在XTEN蛋白的N端产生新的48mer,用于评估表达优化，所述表达优化得到可能是XTEN蛋白表达的解决方案的前导序列，其中XTEN在CF的N端。图30示出证实获自XTEN N端密码子优化实验的优选密码子表达的SDS-PAGE凝胶，与在构建体序列的N端包含CBD前导序列的基准XTEN克隆相比较，如实施例17所述。图31是XTEN的组装、产生和评估中代表性步骤的示意流程图。图32是编码融合蛋白的CFXTEN多核苷酸构建体组装中代表性步骤的示意流程图。单个寡核苷酸501被退火成序列基序502，例如12氨基酸基序(“12-mer”)，其随后与含有BbsI和KpnI限制性位点503的寡聚体连接。来自文库的其它序列基序被退火成12-mer，直到获得期望长度的XTEN基因504。将XTEN基因克隆到填充载体。在这种情况下，该载体编码任选的Flag序列506，随后是两侧具有BsaI、BbsI和KpnI位点的终止序列507和FVII基因508，得到编码XTEN-FVII融合蛋白的基因500。图33是在编码包含CF和XTEN的融合蛋白的基因的组装、其表达和作为融合蛋白回收、及其作为候选CFXTEN产物的评估中代表性步骤的示意流程图。图34是使用不同的加工策略设计CFXTEN表达载体的示意图。图34A示出编码与FVII编码序列3'端融合的XTEN的表达载体。注意，该载体中不需要额外的前导序列。图7B描绘了编码与FVII编码序列5'端融合的XTEN的表达载体，其具有CBD前导序列和TEV蛋白酶位点。图7C描绘了图7B中CBD和TEV加工位点被优化的N端前导序列(NTS)所替代的表达载体。图7D描绘了编码NTS序列、XTEN、VFII编码序列和第二个XTEN编码序列的表达载体。图35示出根据已知分子量的蛋白质标准品测量的胰高血糖素-XTEN构建体样本的尺寸排阻色谱分析结果，其中图形输出为吸光度对保留体积，如实施例37所述。胰高血糖素-XTEN构建体是I)胰高血糖素-Y288 ；2)胰高血糖素Y-144 ；3)胰高血糖素-Y72 ;和4)胰高血糖素-Y36。结果指示表观分子量随着XTEN部分长度的增加而增加。图36示出天然FIX、天然FVII和FVII-FIX序列杂种部分间的序列比对，这些序列具有加入跨EGF2和Pro结构域分子部分的AP结构域不同部分。该图例提供了构建体名称。单独序列中的空位(破折号)表示FIX的非同源性延伸，但是为连续的、连接的序列。加下划线的氨基酸是FIX-衍生序列。发明详述在描述本发明实施方案之前，要理解，这些实施方案仅作为例子而提供，并且可以采用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案来实施本发明。本领技术人员现在将可以想到不背离本发明的许多改变、变化和替代。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明，但下面描述了合适的方法和材料。冲突时，以包括定义在内的本专利说明书为准。此外，材料、方法和实例仅是示例说明性的而不旨在限制。本领技术人员现在会想到不背离本发明的许多改变、变化和替代。
定义除非另外规定，如本文使用的以下术语具有归属于它们的含义。除非上下文另外清楚地指明，说明书和权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。例如，术语“一种细胞”包括多个细胞，包括其混合物。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是线性或分支的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其间可以插入非氨基酸。这些术语还包括例如通过二硫键形成、糖基化、酯化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作(例如与标记组分偶联)而被修饰的氨基酸聚合物。本文使用的术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括但不限于D或L旋光异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。使用标准的单字母或三字母密码指定氨基酸。术语“天然L-氨基酸”表示以下氨基酸的L旋光异构体形式甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。应用于序列并在本文使用的术语“非天然存在的”指没有哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列的对应物、与哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列不互补、或与哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列不具有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。例如，适当比对时，非天然存在的多肽或片段可以与天然序列共享不超过
90%,80%,70%,60%,50%或甚至更低的氨基酸序列同一性。术语“亲水性”和“疏水性”指物质具有的与水的亲和力程度。亲水性物质对水具有强亲和力，易于溶解于水、与水混合或被水润湿，而疏水性物质基本缺乏对水的亲和力，易于排斥水并不吸收水并且不易于溶解于水或与水混合或被水润湿。氨基酸可以根据其疏水性来表征。已经发展了许多量表。一个实例是由Levitt，M等，J Mol Biol (1976) 104 59发展的量表，其列于 Hopp，TP 等，Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 78 :3824。“亲水性氨基酸”的实例是精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。特别关注的亲水性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸和甘氨酸。“疏水性氨基酸”的实例是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
“片段”是保留至少一部分治疗活性和/或生物活性的天然生物活性蛋白的截短形式。“变体”是与天然生物活性蛋白具有序列同源性的蛋白质，保留了生物活性蛋白的至少一部分治疗活性和/或生物活性。例如，变体蛋白可以与參考生物活性蛋白相比共享至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的氨基酸序列同一性。本文使用的术语“生物活性蛋白部分”包括例如通过定点诱变、插入而有意修饰或通过突变而意外修饰的蛋白质。如本文使用的，“内部XTEN”指已插入凝血因子序列中的XTEN序列。内部XTEN可以通过XTEN序列插入例如FIX或FVII的凝血因子的序列中，通过在凝血因子的两个相邻氨基酸之间、或结构域之间插入、或其中XTEN替代凝血因子的部分、内源性序列而构建。如本文使用的，“末端XTEN”指已与凝血因子的N端或C端融合的、或融合入其中的，或与蛋白水解性裂解序列在凝血因子的N或C端融合的XTEN序列。末端XTEN可以与凝血因子的天然末端融合。或者，末端XTEN可以替代凝血因子的末端序列。术语“XTEN释放位点”指CFXTEN融合蛋白中可以被哺乳动物蛋白酶识别和裂解， 引起XTEN或XTEN的部分从CFXTEN融合蛋白中释放的序列。如本文使用的，“哺乳动物蛋白酶”意指正常存在于哺乳动物的体液、细胞或组织中的蛋白酶。XTEN释放位点可以设计为由各种哺乳动物蛋白酶(又称为“XTEN释放蛋白酶”)裂解，例如FXIa、FXIIa、激肽释放酶、FVIIa、FIXa、FXa、FIIa (凝血酶)、弹性蛋白酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17、MMP_20、或在凝血事件期间存在的任何蛋白酶。适用于本文提供的CFXTEN多肽的形式的“活性”，指保留天然凝血因子的生物活性，其中“生物活性”指体外或体内生物学功能或效应，包括但不限于受体或配体结合的酶促活性、或凝血因子对本领域通常已知的凝血因子的效应。适用于形成本文提供的CFXTEN多肽的形式的“治疗效应”指生理效应，包括但不限于人或其它动物中疾病或病症的治愈、缓和、逆转、缓解或预防、或指以其它方法增强人或动物的生理或精神状态。“治疗有效量”意指有效预防、减轻、逆转或缓解疾病或病症的症状(例如，出血事件)或延长所治疗受试者的存活的化合物的量。治疗有效量的測定完全是在本领域技术人员的能力之内，尤其是根据本文所提供的详细公开内容。“宿主细胞”包括可以是或已经是主题载体的受体的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。由于天然、意外或有意的突变，后代不一定与原始亲代细胞完全相同(形态方面或者总DNA互补体的基因组方面)。宿主细胞包括用本发明的载体在体内转染的细胞。当用于描述本文公开的各种多肽吋，“分离的”指已经从其天然环境的组分鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分是通常会干扰所述多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶质。对于本领域技术人员明显的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以使之与其天然存在的对应物相区分。此外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可与其天然存在对应物相区分，因为浓度或每体积的分子数目一般大于其天然存在的对应物。一般而言，通过重组方式制备并在宿主细胞中表达的多肽被认为是“分离的，，。“分离的”多核苷酸或多肽编码核酸或其它多肽编码核酸是从所述多肽编码核酸的天然来源中正常伴随的至少ー种污染核酸分子鉴定和分离的核酸分子。分离的多肽编码核酸不同于其天然存在的形式或环境。因此，分离的多肽编码核酸分子可与天然细胞中存在的特定多肽编码核酸分子相区分。然而，分离的多肽编码核酸分子包括正常表达所述多肽的细胞中含有的多肽编码核酸分子，此时，例如，核酸分子处于不同于天然细胞核酸分子的染色体内或者染色体外位置。“嵌合”蛋白含有至少ー个融合多肽，包含与天然存在不同的序列位置的区域。所述区域可以正常存在于不同的蛋白质中并且在融合多肽中汇集在一起；或者它们可以正常存在于相同的蛋白质中但在融合多肽中处于新的排列。嵌合蛋白可以通过例如化学合成或者通过产生并翻译其中肽区域以期望关系编码的多核苷酸来产生。“偶联的”、“连接的”、“融合的”和“融合”在本文可互換使用。这些术语指通过包括化学偶联或重组方式在内的任何方式使两个或多个化学元素或组分结合在一起。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增强子与所述序列是可操作连接的。一般而言，“可操作连接”表示被连接的DNA序列是连续的，并且在阅读相内或框内。“框内融合”指两个或多个开放阅读框(ORF)以保持原始ORF正确阅读框的方式结合形成连 续更长的0RF。因此，得到的重组融合蛋白是含有对应于由原始ORF编码的多肽的两个或多个片段的单个蛋白质(所述片段通常本质上不会如此结合)。多肽上下文中，“线性序列”或“序列”是多肽中以氨基端至羧基端方向的氨基酸顺序，序列中彼此邻接的残基在多肽ー级结构中是连续的。“部分序列”是已知在ー个或两个方向包含额外残基的多肽的一部分的线性序列。“异源的”指衍生自与进行比较的实体其余部分基因型不同的实体。例如，从其天然编码序列取出并可操作连接至不同于天然序列的编码序列的富含甘氨酸序列是异源的富含甘氨酸序列。术语“异源的”应用于多核苷酸、多肽时指所述多核苷酸或多肽衍生自与进行比较的实体其余部分基因型不同的实体。术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互換使用。它们指任何长度的核苷酸的聚合体形式，所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以发挥已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例基因或基因片段的编码区或非编码区、通过连锁分析确定的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物组装之前或之后进行。核苷酸序列中可以插入非核苷酸组分。多核苷酸可以在聚合之后进ー步修饰，例如通过与标记组分的偶联。术语“多核苷酸的互补体”表示与參考序列相比具有互补碱基序列和反方向的多核苷酸分子，使得互补体可以与具有完全保真性的參考序列杂交。“重组的”应用至多核苷酸时指该多核苷酸是体外克隆、限制酶消化和/或连接步骤以及产生可能在宿主细胞中表达的构建体的其它程序的各种组合的产物。术语“基因”和“基因片段”在本文可互換使用。它们指含有能够在被转录和翻译之后编码特定蛋白质的至少ー个开放阅读框的多核苷酸。基因或基因片段可以是基因组或cDNA，只要该多核苷酸含有至少ー个开放阅读框，该开放阅读框可以涵盖整体编码区或其片段。“融合基因”是由至少两个连接在一起的异源多核苷酸构成的基因。“同源性”或“同源的”指两个或多个多核苷酸序列或两个或多个多肽序列之间的序列相似性或可互換性。当使用例如BestFit等程序来測定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用缺省设置，或者可以选择适当的评分矩阵例如blosum45或blosum80来优化同一'丨生、相似性或同源性评分。优选地，同源的多核苷酸是在本文定义的严格条件下杂交的那些序列并且与那些序列相比具有至少70%、优选至少80 %、更优选至少90 %、更优选95 %、更优选97 %、更优选98 %和甚至更优选99 %序列同一性。“连接”指在两个核酸片段或基因之间形成磷酸ニ酯键而使它们连接在一起的过程。为了使DNA片段或基因连接在一起，DNA末端必须彼此相客。在一些情况下，末端在核酸内切酶消化之后即是相容的。然而，可能必须首先将通常由核酸内切酶消化后产生的交错末端转化成平末端以使它们适合连接。、
术语“严格的条件”或“严格的杂交条件”包括提及多核苷酸将以比其它序列可检測地更大程度(例如，超过背景至少2倍)与其靶序列杂交的条件。一般而言，杂交的严格性部分地參考进行洗涤步骤的温度和盐浓度来表示。通常，严格条件是如下条件其中pH 7. O至8. 3下的盐浓度小于约I. 5M Na离子、通常约O. 01至I. OM Na离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短的多核苷酸(例如，10至50个核苷酸)是至少约30°C并且对于长的多核苷酸(例如，大于50个核苷酸)是至少约60°C—例如，“严格的条件”可以包括在37°C下50%甲酰胺、IM NaClU% SDS中杂交，以及在O. 1XSSC/1% SDS中于60°C下至65°C下三次洗涤，毎次15分钟。可选地，可以使用约65°C、60°C、55°C或42°C的温度。SSC浓度可以从约O. I至2XSSC变化，其中SDS以约O. 1%存在。这种洗涤温度通常被选择为比确定离子强度和PH下特定序列的热力学熔点低约5°C至20°C。Tm是50%的靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和PH下)。计算Tm的方程和核酸杂交条件是熟知的并且可以參见 Sambrook, J.等(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2 版,第 1-3 卷,Cold Spring Harbor Press,Plainview N. Y.;特别參见第 2 卷第 9 章。通常，使用阻断试剂来阻断非特异性杂交。这种阻断试剂包括例如约100-200yg/ml的经剪切和变性的鲑鱼精子DNA。在特定情况下，例如对于RNA:DNA杂交，还可以使用有机溶剂，例如浓度约35-50% v/v的甲酰胺。对这些洗涤条件的有用改变对于本领域普通技术人员而目是明显的。术语“同一性百分比”和“同一性应用于多核苷酸序列时指使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配百分比。这种算法可以标准化且可重复的方式在被比较的序列中插入空位以优化两个序列之间的比对，并因此实现两个序列的更有意义的比较。可以对整体确定的多核苷酸序列长度测量百分比同一性，或者可以对较短长度例如对获自较大的确定的多核苷酸序列的片段长度測量百分比同一性，所述片段例如是至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450个连续残基的片段。这些长度仅是示例性的，并且要理解，本文、表格、附图或序列表中示出的序列所支持的任何片段长度可以被用来描述可被測量百分比同一性的长度。有关本文鉴定的多肽序列的“序列同一性百分比) ”被定义为比对序列并引入空位(如果必要)以实现最大百分比序列同一性并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分，询问序列中与另ー个參考多肽序列或其部分的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分比。g在測定百分比氨基酸序列同一性的比对可以本领域技术中的各种方式实现，例如使用公开可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当參数，包括对被比较的序列的全长实现最大比对所需的任何算法。可以对整体确定的多肽序列长度测量百分比同一性，或者可以对较短长度例如对获自较大的确定的多肽序列的片段长度測量百分比同一性，所述片段例如至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段。这些长度仅是示例性的，并且要理解，本文、表格、附图或序列表中显示的序列所支持的任何片段长度可以被用来描述可被測量百分比同一性的长度。本文多肽上下文中使用的术语“非 重复性”指在肽或多肽序列中缺乏或有限程度的内部同源性。例如，术语“基本上非重复的”可以指例如序列中很少或没有四个连续氨基酸是相同的氨基酸类型，或者多肽具有10或更小的子序列评分(下文定义)，或者没有构成多肽序列的序列基序从N端至C端顺序的模式。本文多肽上下文中使用的术语“重复性”指肽或多肽序列中内部同源性程度。相反，“重复的”序列可以含有短氨基酸序列的多个相同拷贝。例如，目标多肽序列可以被分成n-mer序列，并且相同序列的数目可以被计数。高度重复的序列含有大比例的相同序列，而非重复的序列含有很少的相同序列。在多肽上下文中，序列可以含有确定或可变长度的较短序列或基序的多个拷贝，其中基序本身具有非重复序列，使全长多肽是基本上非重复的。其中測量非重复性的多肽长度可以是3个氨基酸至约200个氨基酸、约6至约50个氨基酸、或约9至约14个氨基酸。多核苷酸序列的上下文中使用的“重复性”指序列内部同源性程度，例如，给定长度的相同核苷酸序列的频率。重复性可以例如通过分析相同序列的频率来测量。“载体”是优选在适当宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转到宿主细胞中和/或在宿主细胞之间。该术语包括主要功能是将DNA或RNA插入细胞的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，以及功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供不止ー种上述功能的载体。“表达载体”是被引入适当宿主细胞时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常表示包含可以用于产生期望的表达产物的表达载体的适合的宿主细胞。“血清降解抗性”应用于多肽时指多肽在血液或其组分中抵抗降解的能力，血清或血浆中通常包括蛋白酶。血清降解抗性可以通过使蛋白质与人(或视情况为小鼠、大鼠、猴)血清或血浆通常在约37°C混合通常一定天数(例如O. 25、0· 5、1、2、4、8、16天)来测量。可对这些时间点的样本进行蛋白质印迹分析，并使用抗体检测蛋白质。抗体可以针对蛋白中的标签。如果蛋白质在印迹(western)上显示单条带，其中蛋白质大小与注射蛋白质大小相同，则没有发生降解。在该示例性方法中，通过蛋白质印迹或等效技术判断50%蛋白被降解的时间点是蛋白质的血清降解半衰期或“血清半衰期”。本文使用的术语“t1/2”指终末半衰期，计算为In⑵/Kel。Kel是通过log浓度对时间曲线的终末线性部分的线性回归而计算的终末消除速率常数。半衰期通常指活生物体中储存的施用物质的半数被正常生物过程代谢或消除所需的时间。术语“t1/2”、“终末半衰期”、“消除半衰期”和“循环半衰期”在本文可互換使用。“主动清除”指下述机制通过该机制将CF从循环中移除，除了通过过滤或凝血以夕卜，且该机制包括从CF的细胞、受体、代谢或降解介导的循环中移除。“表观分子量因子”和“表观分子量”是相关术语，指特定氨基酸序列表现出的表观分子量的相对增加或降低的量度。表观分子量使用尺寸排阻色谱(SEC)和类似方法与球状蛋白标准品相比较来測定，并且以“表观kD”単位来度量。表观分子量因子是表观分子量和实际分子量之间的比率；后者通过基于氨基酸组成而加合组成中每种氨基酸的计算分子量，或通过对比SDS电泳凝胶中的分子量标准评估来预测。术语“流体动力学半径”或“Stokes半径”是分子在溶液中的有效半径(Rh，以nm
计)，通过假设它是穿过溶液并受溶液粘性抵抗的主体来測量。在本发明的实施方案中，XTEN融合蛋白的流体动力学半径測量与‘表观分子量因子’相关联，表观分子量因子是更直观的量度。蛋白质的“流体动力学半径”影响其在水溶液中的扩散速率以及其在大分子凝胶中迁移的能力。蛋白质的流体动力学半径由其分子量以及其结构(包括形状和致密度)決定。測定流体动力学半径的方法是本领域熟知的，例如通过使用尺寸排阻色谱(SEC)jn美国专利No. 6，406，632和No. 7，294，513所述。大多数蛋白质具有球形结构，这是蛋白质在最小流体动力学半径下可以具有的最致密的三维结构。ー些蛋白质具有随机和开放的非结构化或‘线性’构象，因此与类似分子量的典型球形蛋白质相比具有大得多的流体动力学半径。“生理条件”指活宿主中的ー组条件以及模拟活受试者那些条件的体外条件，包括温度、盐浓度、pH。已经确立了用于体外分析的许多生理相关条件。一般而言，生理缓冲液包含生理浓度的盐并且被调节至中性pH，范围从约6. 5至约7. 8，并且优选约7. O至约7. 5。许多生理缓冲液列于Sambrook等(1989)。生理相关温度范围从约25°C至约38°C并且优选约35°C至约37 °C。“反应基”是可以与另一反应基偶联的化学结构。反应基的实例是氨基、羧基、巯基、羟基、醛基、叠氮基。一些反应基可以被活化以促进与另一反应基的偶联。活化的非限制性实例是羧基与碳ニ亚胺反应，羧基转化为活化的酷，或者羧基转化为叠氮化物官能。“控释剤”、“缓释剤”、“贮库制剂”和“持续释放剂”可互換使用，指与多肽在缺乏这些物质而施用时的释放持续时间相比能够延长本发明多肽释放持续时间的物质。本发明的不同实施方案可以具有不同的释放速率，导致不同的治疗量。术语“抗原”、“靶抗原”和“免疫原”在本文可互換使用，指抗体片段或基于抗体片段的治疗剂与之结合或对之具有特异性的结构或结合决定簇。本文使用的术语“有效负载”指具有生物活性或治疗活性的蛋白质或肽序列；小分子药效团的对应物。有效负载的实例包括但不限于细胞因子、酶、激素和血液和生长因子。有效负载还可以包含基因融合或化学偶联的部分，例如化疗剂、抗病毒化合物、毒素或造影齐U。这些偶联部分可以通过连接子连接至多肽其余部分，所述连接子可以是可裂解的或不可裂解的。本文使用的术语“拮抗剂”包括部分或完全阻断、抑制或中和本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。用于鉴定多肽拮抗剂的方法可以包括使天然多肽与候选拮抗剂分子接触并测量通常与天然多肽相关的ー种或多种生物活性的可检测的变化。在本发明上下文中，拮抗剂可以包括蛋白质、核酸、糖类、抗体或降低生物活性蛋白效应的任何其它分子。术语“激动剂”以最广泛的含义使用并且包括模拟本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。适合的激动剂分子具体包括激动剂抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、小有机分子等。用于鉴定天然多肽的激动剂的方法可以包括使天然多肽与候选激动剂分子接触并测量通常与天然多肽相关的一种或多种生物活性的可检测的变化。“活性”出于本文目的指融合蛋白组分与相应的天然生物活性蛋白一致的作用或效应,其中“生物活性”指体外或体内生物功能或效应,包括但不限于受体结合、拮抗剂活性、激动剂活性或细胞或生理反应。本文使用的“治疗(treatment) ”或“治疗(治疗)”或“减轻(palliating) ”或“缓解(ameliorating)”在本文可互换使用。这些术语指获得包括但不限于治疗益处和/或预防益处的有益或期望结果的方法。所谓治疗益处是指被治疗的潜在疾患的消除或缓解。而且，随着与潜在疾患相关的一种或多种生理症状的消除或缓解使得在受试者中观察到改善而实现治疗益处，尽管受试者可能依然受累于所述潜在疾患。为了预防益处，组合物可以被施用给处于发展特定疾病风险的受试者或者报告了疾病的一种或多种生理症状的受试者， 尽管可能还未做出该疾病的诊断。本文使用的“治疗效应”指生理效应，包括但不限于人或其它动物中疾病的治愈、缓和、缓解或预防，或者指除此以外增强人或动物的生理或精神状态，这是由本发明融合多肽而非诱导生成针对生物活性蛋白具有的抗原表位的抗体的能力引起的。治疗有效量的确定在本领域技术人员能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。本文使用的术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”指单独或作为融合蛋白组合物的一部分的生物活性蛋白的量，所述生物活性蛋白一次或重复剂量施用给受试者时能够对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数或特征具有任何可检测的有益效应。这种效应不一定绝对是有益的。本文使用的术语“治疗有效剂量方案”指单独或作为融合蛋白组合物的一部分的生物活性蛋白的连续施用的多个剂量(即，至少两个或更多个)的计划表，其中所述剂以治疗有效量给予以对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数或特征产生持续有益的效应。I). —般技术除非另外指出，本发明实践采用本领域技术范围内的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术。参见Sambr00k，J.等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual,，，第 3 版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2001 ;“Current protocols in molecular biology”，F. M. Ausubel 等编辑，1987 ;系列 “Methods in Enzymology, ^Academic Press, San Diego, CA. ;“PCR 2 a practicalapproach”，M. J. MacPherson, B. D. Hames 和 G. R. Taylor 编辑，Oxford University Press,1995 ;“Antibodies, a laboratory manual，，Harlow, E.和 Lane, D.编辑，Cold SpringHarbor Laboratory,1988 ;“Goodman & Gilman’ s The Pharmacological Basis ofTherapeutics,” 第 11 版，McGraw-Hi 11, 2005 和 Freshney, R. I. ,“Culture of AnimalCells A Manual of Basic Technique,，，第 4 版，John Wiley & Sons,Somerset,NJ,2000,这些参考文献的全部内容通过引用的方式并入本文。II).凝血因子
本发明部分涉及包含凝血因子(CF)的融合蛋白组合物。如本文使用的，“凝血因子”或“CF”指因子IX (FIX)、因子VII (FVII)、FVII和FIX的序列组合、或其模拟物、序列变体以及截短形式。(a)因子 IX“因子IX”或“FIX”指凝血因子蛋白及其种类和序列变体，并且包括但不限于人FIX前体多肽(“前原”)的461单链氨基酸序列和成人FIX的415单链氨基酸序列。FIX包括具有血液凝血因子IX的典型特征的因子IX分子的任何形式。如本文使用的“因子IX”和“FIX”意欲包含多肽，其包含结构域Gla (含有Y -羧基谷氨酸残基的区域)、EGF1和EGF2 (含有与人表皮生长因子同源的序列区域)、活化肽(由成熟FIX的残基R136-R180形成)，以及C端蛋白酶结构域(“前”)、或本领域已知结构域的同义密码子，或可以是截短片 段或保留天然蛋白质生物活性的至少一部分的序列变体。FIX或序列变体已被克隆，如美国专利No. 4，770, 999,7, 700, 734中所述，并且人因子IX的cDNA编码已被分离、表征并克隆至表达载体(参见，例如 Choo 等人，Nature299 :178-180 (1982) ;Fair 等人，Blood 64:194-204 (1984);和 Kurachi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. A. 79 :6461-6464 (1982))。人因子IX(FIX)由位于X-染色体q27. I处的单拷贝基因编码。人FIXmRNA由5’非翻译区的205个碱基、前原因子IX的1383个碱基、终止密码子和3’非翻译区的1392个碱基组成。FIX多肽为55kDa，合成为由以下三个区组成的前原多肽链28个氨基酸的信号肽、18个氨基酸的前肽(其对于谷氨酸残基的Y羧化是必需的)和415个氨基酸的成熟因子IX。所述前肽是N端连接Y羧基谷氨酸盐结构域的18-氨基酸残基序列。该前肽结合维生素K依赖性Y羧化酶，然后通过内源性蛋白酶(最可能是PACE(成对的碱性氨基酸裂解酶)，还被称为弗林蛋白酶或PCSK3)从FIX的前体多肽裂解。在没有Y羧化酶的前提下，Gla结构域不能结合钙，以设定需将蛋白质锚定于带负电荷的磷脂表面所需的正确的构象，由此使因子IX无功能。即使它被羧化，该Gla结构域也取决于正确功能的前肽的裂解，因为保留的前肽干扰了与钙和磷脂优化结合所需的Gla结构域的构象变化。在人中，生成的成熟因子IX由肝细胞分泌至血流中作为无活性酶原，一种含有按重量计约17%碳水化合物的415个氨基酸残基的单链蛋白(Schmidt,A. E.等人(2003)Trends CardiovascMed, 13 :39)。成熟因子IX由在N端至C端构型中如下的若干结构域组成Gla结构域、EGFl结构域、EGF2结构域、活化肽(AP)结构域和蛋白酶(或催化的)结构域。FIX含有分别由R145-A146和R180-V181形成的两种活化肽。随后的活化，单链FIX变成2链分子，其中这两条链由连接酶和Gla结构域的二硫键连接。可通过替代它们的活化肽、形成改变的活化特异性，来设计CF。在哺乳动物中，成熟FIX必定由活化因子XI活化，以得到因子IXa。一旦FIX活化为FIXa，该蛋白酶结构域提供了 FIX的催化活性。活化因子VIII (FVIIIa)是用于完全表达FIXa活性的特异性辅因子。涉及凝血的蛋白质包括因子I、因子II、因子III、因子IV、因子V、因子VI、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、蛋白质C和组织因子(“凝血蛋白”)。多数凝血蛋白以酶原形式存在，其在活化时表现出促凝蛋白酶活性以活化其它凝血蛋白，促进内源性或外源性凝血途径和血块形成。在凝血级联的内源性途径中，FIX与活化因子VIII、因子X、钙和磷脂复合物相关。在该复合物中，FIX由因子XIa活化。因子 IX 的活化由从分子(Bajaj 等人，Human factor IX and factor IXa, in METHODS INENZYMOLOGY. 1993)中两步移除活化肽(Ala 146-Arg 180)实现。通过因子XIa或因子VIIa/组织因子在Argl45-Alal46位点进行第一次裂解。第二次和限速裂解在Arg 180-Val181处进行。活化移除了 35个残基。活化的人因子IX以C端重链(28kDa)和N端轻链(ISkDa)(通过连接酶和Gla结构域的一个二硫键结合在一起)的异源二聚体存在。因子Ixa与活化的因子VIII —起轮流活化因子X。或者，因子IX和X都可以通过与脂化组织因子复合的因子VIIa活化，经由外源性途径产生。因子Xa随后参与最终共同途径，由此凝血酶原转变为凝血酶，并且凝血酶依次使纤维蛋白原转变为纤维蛋白以形成凝块。凝血过程缺陷可导致出血疾患，在该疾患中血块形成的时间延长。这种缺陷可能是天生的或后天的。例如，血友病A和B是特征在于分别缺乏因子VIII(FVIII)和FIX的遗传疾病。用这些蛋白质(通常制备为重组蛋白质)的补充疗法可以用于治疗性干预血友病B(Christmas病)和因子IX-相关的出血疾患。因子IX可以用于治疗这两种病症。然而，在某些情况下，患者发展了抗所施用蛋白质的抗体，所述抗体降低或取消了治疗效应。本发明考虑在CFXTEN组合物中加入与FIX序列具有同源性的FIX序列、例如来自人、非人灵长类动物、哺乳动物(包括家养动物)的天然的序列片段、以及保留了 FIX的至 少一部分生物活性或生物学功能和/或用于预防、治疗、调节或缓解凝血因子相关的疾病、缺乏、疾患或病症(例如，与凝血因子缺乏的创伤、手术相关的出血事件)的非天然序列变体。与人FIX同源的序列可以通过标准同源性检索技术例如NCBI BLAST来发现。在一个实施方案中，加入主题组合物的FIX是具有对应于天然存在蛋白质的序列的重组多肽。在另一实施方案中，FIX是天然序列的序列变体、片段、同源物或模拟物，保留了相应天然FIX的至少一部分生物活性。表I提供了本发明CFXTEN融合蛋白所涵盖的、FIX氨基酸序列的非限制性列表。待加入融合蛋白组合物的任何FIX序列或同源衍生物可以通过改组表I的氨基酸序列之间的个体突变而构建，并评估其活性。保留天然FIX的至少一部分生物活性的FIX序列或同源衍生物可用于本发明的融合蛋白组合物。可加入CFXTEN融合蛋白的FIX包括与选自表I的氨基酸序列相比具有至少约80%序列同一性、或可选地 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的蛋白质。表I :FK氨基酸和核酸序列
权利要求
1.一种分离的因子VII多肽，其包含延伸重组多肽(XTEN)，所述XTEN包含至少200个氨基酸残基，其中所述因子VII多肽当施用给受试者时表现出大于约12小时的终末半衰期。
2.权利要求I所述的分离的因子VII多肽，其中所述因子VII多肽当最佳比对时与选自表2的序列相比表现出至少90%序列同一性。
3.权利要求I或2所述的分离的因子VII多肽，其中所述因子VII在其C-端与所述XTEN连接。
4.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其与XTEN经由可由哺乳动物蛋白酶裂解的裂解序列连接，所述哺乳动物蛋白酶选自由因子XIa、因子Xlla、激肽释放酶、因子Vila、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、弹性蛋白酶-2、MMP_12、MMP13、MMP-17和MMP-20组成的组。
5.权利要求4所述的分离的因子VII多肽，其中通过哺乳动物蛋白酶引起的在所述裂解序列处的裂解从所述因子VII多肽释放所述XTEN。
6.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述XTEN在所述因子VII中包含的任何两个相邻结构域之间引入，其中所述两个相邻结构域选自由Gla、EGFl、EGF2、活化肽(AP)和肽酶SI (Pro)组成的组。
7.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述XTEN的特征在于 (a)XTEN氨基酸残基的累计总数大于200至约3000个氨基酸残基； (b)天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总和小于所述XTEN的总氨基酸序列的10%； (c)蛋氨酸和色氨酸残基的总和小于所述XTEN的总氨基酸序列的2%； (d)所述XTEN序列具有小于10的亚序列得分； (e)通过GOR算法确定，所述XTEN序列具有大于90%的无规卷曲形成；和 (f)通过Chou-Fasman算法确定，所述XTEN序列具有小于2%的a螺旋和2%的@折叠。
8.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其表现出至少约4的表观分子量因子。
9.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述XTEN表现出与类似长度的选自表4、表9、表10、表11、表12或表13的氨基酸序列具有至少90%序列同一性。
10.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其根据式VII来构建 (Gla) - (XTEN) u- (EGFl) - (XTEN) v- (EGF2) -(API)- (XTEN) w- (AP2) - (XTEN) x- (Pro) - (S)y-(XTEN)z VII 其中对于每次出现独立地， (a)Gla是因子VII的Gla结构域； (b)EGFl是因子VII的EGFl结构域； (c)EGF2是因子VII的EFG2结构域； (d)APl是因子VII的激活肽结构域的一部分； (e)AP2是包括至少第一裂解序列的因子IX的激活肽结构域的一部分； (f)PRO是因子VII的蛋白酶结构域； (g)S是具有I至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选包括裂解序列；(h)XTEN是延伸重组多肽，所述延伸重组多肽表现出与类似长度的选自表4、表9、表.10、表11、表12或表13的氨基酸序列具有至少90%序列同一性；(i)u是 0 或 I ； (j) V 是 0 或 I ； (k) X 是 0 或 I ; (Dy是0或I ;且 (m) z是0或I,条件是u+v+x+y+z彡I。
11.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其包含一个以上的XTEN。
12.—种分离的因子VII多肽，其包含至少一个异源序列，所述异源序列可被未活化野生型因子VII的促凝蛋白酶裂解，其中在裂解异源序列后，因子VII多肽就被活化。
13.权利要求12所述的分离的因子VII多肽，其可在不存在组织因子的情况下活化。
14.权利要求12或13所述的分离的因子VII多肽，其中所述异源序列可被活化因子XI裂解。
15.权利要求12-14中任一项所述的分离的因子VII多肽，其包含至少两个异源序列，所述异源序列的每一个可被相同或不同的促凝蛋白酶裂解。
16.权利要求12-15中任一项所述的分离的因子VII多肽，其包含延伸重组多肽(XTEN)。
17.权利要求12-16中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中在裂解所述至少一个异源序列后，XTEN也被裂解。
18.权利要求12-17中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述异源序列表现出与序列 KLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRV 具有至少 90%序列同一性。
19.权利要求12-18中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述异源序列当最佳比对时表现出与选自TSKLTRAETVFP和FNDFTRV的序列具有至少90%序列同一性。
20.权利要求12-19中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述因子VII多肽不包含选自由聚乙二醇(PEG)、白蛋白、抗体和抗体片段组成的组的组分。
21.权利要求12-10中任一项所述的分离的因子VII多肽，其表现出至少约4的表观分子量因子。
22.—种治疗受试者的凝血紊乱的方法，其包括给所述受试者施用包含治疗有效量的前述权利要求中任一项所述的因子VII的组合物。
23.权利要求22所述的方法，其中所述凝血紊乱是血友病A或血友病B。
24.权利要求22或23所述的方法，其中所述治疗有效量的因子VII足以回避外源性施用因子VIII和/或因子IX的需要以产生类似的治疗效应。
25.一种治疗受试者的出血事件的方法，其包括给所述受试者施用包含治疗有效量的权利要求1-21中任一项所述的因子VII的组合物。
26.一种治疗受试者的凝血蛋白不足的方法，其包括给所述受试者施用包含治疗有效量的权利要求1-21中任一项所述的因子VII的组合物。
27.权利要求26所述的方法，其中所述凝血蛋白替换野生型因子VII、因子IX或因子XI。
全文摘要
本发明涉及包含与延伸重组多肽(XTEN)连接的因子Ⅶ凝血因子的组合物、编码所述组合物的分离的核酸和含有所述分离的核酸的载体和宿主细胞，以及制备所述组合物的方法和使用所述组合物治疗凝血因子相关的疾病、疾患和病症的方法。
文档编号C12P21/04GK102741422SQ201080047919
公开日2012年10月17日 申请日期2010年8月2日 优先权日2009年8月24日
发明者B·斯平克, C-W·王, J·西尔维尔曼, N·C·吉特欣格, V·舍伦贝格尔, W·P·斯特默, W·托 申请人:阿穆尼克斯运营公司