专利名称：纤维二糖水解酶变体及编码其的多核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及纤维二糖水解酶II的变体，编码所述变体的多核苷酸，产生所述变体的方法和使用所述变体的方法。
背景技术：
纤维素是单糖葡萄糖通过β-1，4-键共价连接的聚合物。许多微生物产生水解 β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶继而从纤维素聚合物的末端释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-ι， 4-连接的葡萄糖二聚体。β -葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势 大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母发酵成乙醇。WO 2006/074005 公开了红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)纤维二糖水解酶 II 的变体。Heinzelman 等，2009, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 106 :5610-5615公开了由结构导向的重组所构建的热稳定性真菌纤维素酶的家族。 Heinzelman等，2009，Journal of Biological Chemistry 284，262四_26233 公开了有助于真菌纤维素酶稳定性的单个突变。在本领域中，提高具有纤维二糖水解酶活性的多肽改善木素纤维素原料的酶降解的能力是有利的。本发明提供了与其亲本相比具有增加的热稳定性的亲本纤维二糖水解酶II的变体。
发明内容
本发明涉及亲本纤维二糖水解酶II的分离的变体，其在一个或多个(几个)对应于SEQ ID NO 2的成熟多肽的位置272、287、325、347、357、363、409、464和476的位置处包含取代，其中所述变体具有纤维二糖水解酶Π活性。在一个方面，所述分离的变体进一步在对应于SEQ ID NO 2的成熟多肽的位置435的位置包含取代。
本发明还涉及编码所述变体的分离的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；和产生所述变体的方法。本发明还涉及降解或转化纤维素材料的方法，包括在本发明的具有纤维二糖水解酶II的变体的存在下用酶组合物处理纤维素材料。在一个方面，所述方法进一步包括回收经降解或转化的纤维素材料。本发明还涉及产生发酵产物的方法，包括(a)在本发明的具有纤维二糖水解酶 II活性的变体的存在下用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(C)从所述发酵回收发酵产物。本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，包括用一种或多种(几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中将所述纤维素材料在本发明的具有纤维二糖水解酶活性II的变体的存在下用酶组合物糖化。
图1显示了野生型土生梭孢霉(Thielavia terrestris)家族GH6A纤维二糖水解酶II和土生梭孢霉家族GH6A纤维二糖水解酶II的几种变体在100mMNaCl-50mM乙酸钠pH 5. 0中在67°C进行20分钟后的残余活性的比较。定义纤维二糖水解酶术语“纤维二糖水解酶”意指l，4-i3_D-葡聚糖纤维二糖水解酶(l，4-beta-D-glucan cellobiohydrolase) (Ε. C. No. 3. 2. 1. 91)，其催化纤维素、纤维素寡糖，或任何包含β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri，1997，Crystalline cellulose degradation :New insight into the function of ce1lobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15 160-167 ;Teeri 等，1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases :why so efficient on crystalline cellulose ？ , Biochem. Soc. Trans. 26 :173-178)。就本发明而言，根据 Lever 等，1972, Anal. Biochem. 47 :273-279 ；van Tilbeurgh 等，1982, FEBS Letters, 149 152-156 ；van Tilbeurgh^PClaeyssens, 1985,FEBS Letters, 187 :283-288 ；以及iTomme等， 1988，Eur. J. Biochem. 170 :575-581 ；以及 van Tilbeurgh 等，1985，Eur. J. Biochem. 148 329-334描述的方法确定纤维二糖水解酶活性。可采用Lever等的方法来评价玉米秸秆中的纤维素水解，而van Tilbeurgh等和Tomme等的方法可用于确定对4-甲基伞形基- β -D-乳糖吡喃糖苷 G-methylumbelIiferyl-β -D-Iactopyranoside)的纤维二糖水解酶I活性。在本发明中，描述于实施例5的测定法可用于测量纤维二糖水解酶II活性。变体术语“变体”意指纤维二糖水解酶活性II，其在一个或多个(几个)位置包含改变，即取代、插入和/或缺失。取代意指用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指邻接于占据某位置的氨基酸添加1-5个氨基酸。突变体术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。野生型纤维二糖水解酶II 术语“野生型纤维二糖水解酶II”意指由天然存在的微生物，如见于自然界的细菌、酵母或丝状真菌表达的纤维二糖水解酶II。亲本或亲本纤维二糖水解酶II 术语“亲本”或“亲本纤维二糖水解酶II”意指对
6其进行了改变以产生本发明的酶变体的纤维二糖水解酶II。所述亲本可为天然存在的(野生型)多肽或其变体。分离的或纯化的术语“分离的，，和“纯化的，，意指从与其天然相关的至少一种组分移出的多肽或多核苷酸。例如，如变体通过SDS-PAGE测定的，可为至少1 %纯，例如至少 5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，或至少95%纯；而多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，可为至少纯，例如至少5%纯，至少 10 %纯，至少20 %纯，至少40 %纯，至少60 %纯，至少80 %纯，至少90 %纯，或至少95 %纯。纤维素分解酶或纤维素酶术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种 (几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、葡糖苷酶或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括(1)测量总纤维素分解活性，和(2) 测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和葡糖苷酶)，如^iang 等，Outlook for cellulase improvement-Screening and selection strategies,2006, Biotechnology Advances M :452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No. 1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、 棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman No. 1 滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由hternational Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose,1987, Measurement of cellulase activities, Pure App1. Chem. 59 :257-68)确立的。就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定l_20mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素在50°C 进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。典型条件为1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸钠pH 5，ImM MnSO4, 50°C，72小时，通过 AMINEX HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories, Inc.，Hercules, CA, USA)进行糖分析。内切葡聚糖酶术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1，4-(1，3;1，4)-3-0-葡聚糖 4-葡聚糖水解酶(endo-l，4-0 -D-glucan 4-glucanohydrolase) (Ε. C. 3. 2. 1. 4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(Iichenin)中的 l，4-i3-D-糖苷键、混合的β_1，3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β_1，4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法Oiang等，2006，Biotechnology Advances 24: 452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据(ihose，1987，Pure and App 1. Chem. 59 :257-268的方法，在pH 5，40°C，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。β -葡糖苷酶术语“ β -葡糖苷酶”意指β -D-葡糖苷葡糖水解酶 (beta-D-glucoside glucohydrolase) (Ε. C. 3. 2. 1. 21)，其催化末端非还原 β -D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，根据Venturi等，2002，Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum !production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42 :55-66^基本方法确定葡糖苷酶活性。一个单位的葡糖苷酶活性定义为在25°C，pH 4.8， 在含有0. 01 % TffEEN 20的50mM柠檬酸钠中从ImM对硝基苯基-β -D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1. 0微摩尔对硝基苯酚阴离子。具有纤维素分解增强活性的多肽术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指增强具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的GH61多肽。就本发明而言，通过测量由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料所导致的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性l_50mg总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白包含 50-99. 5% w/w的纤维素分解酶蛋白，及0. 5-50% w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61 多肽的蛋白质，在50°C进行1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性 (l-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2-3%的米曲霉(Aspergillus oryzae) β -葡糖苷酶(根据W002/095014 在米曲霉中重组产生)或者总蛋白重量的2-3%的烟曲霉(Aspergillus fumigatus) β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的 CELLUCLAST ⑧ 1. 5L (Novozymes A/S, BagSV^rd, Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解程度所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少 1. 01倍，更优选至少1. 05倍，更优选至少1. 10倍，更优选至少1. 25倍，更优选至少1. 5倍， 更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10 倍，并且最优选至少20倍。家族61糖苷水解酶术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据Henrissat B. ,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities，Biochem. J. 280 :309_316，及Henrissat B. JfIBairoch A. , 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316 :695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。半纤维素分解酶或半纤维素酶术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Siallom，D.和Sioham，Y. Microbial hemicellulases. Current Opinion In Microbiology, 2003,6 (3) :219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、 葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支化和直链多糖的混杂基团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为鲁棒(robust)的网络。半纤维素亦共价地附接于木质素， 与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基酯键的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级结构的同源性，可指定为以数字标记的GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为宗族 (clan)，以字母标记(例如，GH-A)。这些和其他糖活性酶的最具信息性和最新的分类可在 Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据(ihose和 Bisaria, 1987，Pure&Appl. Chem. 59 :1739-1752 测量。木聚糖降解活性或木聚糖分解活性术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括(1)测定总木聚糖分解活性，和( 测定单独的木聚糖分解活性(例如，内切木聚糖酶、β -木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α -葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α -葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase)).最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely禾口Puchard，Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes, 2006,Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11) :1636-1647 ；Spanikova 禾口 Biely，2006， Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune，FEBS Letters 580(19) :4597-4601 ；Herrmann，Vrsanska， Jurickova， Hirsch， Biely 禾口 Kubicek，1997， The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydroIase， Biochemical Journal 321 :375-381o总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(Iarchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。 最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖， 如 Bailey, Biely, Poutanen,1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3) :257-270 中所述。木聚糖酶活性亦可用0. 2% AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在0. 01% TRITON X-100和200mM磷酸缓冲液 PH 6中在37°C确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37°C，pH 6，在200mM磷酸钠pH 6 缓冲液中每分钟从作为底物的AZCL-阿拉伯木聚糖产生1. O微摩尔的天青精(azurine)。就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述典型条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.，Inc.，St. Louis, MO, USA)水解的增加来确定的1ml反应，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白/g底物，50mM乙酸钠，pH 5， 50 °C, 24 小时，如 Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47 :273-279所述使用对羟基苯甲酸酰胼(PHBAH)测定法进行糖分析。木聚糖酶术语“木聚糖酶”意指催化木聚糖中1，4_β -D-木糖苷键的内水解的1， 4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 8)。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用0. 2% AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在37°C在0. 01 % TRITON X-IOO和200mM磷酸钠缓冲液pH 6中进行确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37°C，pH 6从200mM磷酸钠pH 6缓冲液中的0. 2% AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物每分钟产生1. O微摩尔的天青精(azurine)。β -木糖苷酶术语“ β -木糖苷酶”意指β -D木糖苷木糖水解酶(β -D-xyloside xylohydrolase) (Ε. C. 3. 2. 1. 37)，其催化短 β (1 — 4)木寡糖(xylooligosaccharide) 的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的木糖苷酶定义为在40°C，pH 5从含有0.01% TWEEN 20的IOOmM柠檬酸钠中的ImM对硝基苯基- β -D-木糖苷作为底物每分钟产生1. O微摩尔对硝基苯酚阴离子。乙酰木聚糖酯酶术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC 3. 1.1. 72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0. 5mM乙酸对硝基苯酯作为底物，在含有0. 01% TWEEN 20的50mM乙酸钠PH 5.0中确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH 5，25°C每分钟释放1 微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。阿魏酸酯酶术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)，，意指4_羟基_3_甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC 3. 1. 1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰酯酶 (hydroxycinnamoyl esterase)、FAE_III、肉桂酸酉旨水解酶、FAEA、cinnAE、FAE_I 或FAE-II。 就本发明而言，阿魏酸酯酶是使用50mM乙酸钠pH 5. 0中的0. 5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在PH 5，25°C每分钟释放出1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。α -葡糖醛酸糖苷酶术语“ α -葡糖醛酸糖苷酶”意指α _D_葡糖苷酸葡糖醛酸水角军_ (alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC 3. 2. 1. 139)，其催化 α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α -葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries, 1998，J. Bacteriol. 180 :243-249确定的。一个单位的α -葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH 5，40°C每分钟释放出1微摩尔葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶术语“ α _L_阿拉伯呋喃糖苷酶活性”意指α _L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3. 2. 1. 55)，其催化对α -L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)_和 /或(1，5)_键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α -L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积 200 μ 1中的每ml的IOOmM乙酸钠pH 5中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland, Ltd.，Bray, Co. Wicklow，Ireland)在 40°C进行 30 分钟，接着通过 AMINEX HPX-87H 柱层析(Bio-I ad Laboratories, Inc. , Hercules, CA, USA)的阿拉伯糖分析来确定的。纤维素材料术语“纤维素材料”意指包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β _(l-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖 (xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键键合，其帮助稳定细胞壁基质。纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆与造纸厂残余物(参见，例如，Wiselogel 等，1995，于 Handbook on Bioethanol (Charles Ε. Wyman 编),pp. 105-118, Taylor&Francis, Washington D. C. ；ffyman,1994, BioresourceTechnology 50 :3-16 ；Lynd,1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25 695-719 ;Mosier 等，，1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, 于 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper 主编，Volume 65, pp. 23-40，Springer-Verlag，New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。在一个方面，纤维素材料是草本材料。在另一个方面，纤维素材料是农业残余物。 在另一个方面，纤维素材料是林业残余物。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。 在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面， 纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，纤维素材料是芒草属(miscanthus)。在另一个方面， 纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton 1 inter) 0在另一个方面，纤维素材料是无定形的经磷酸处理的纤维素。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。纤维素材料可以按原样(as is)使用或进行预处理，使用本领域已知的常规方法， 如本文所述。在一个优选的方面，纤维素材料经预处理。预处理的玉米秸秆术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指通过用热和稀硫酸处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。含木聚糖材料术语“含木聚糖材料”意指任何包含含有β -(1-4)连接木糖残基骨架的植物细胞壁多肽的材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木糖骨架(其由短糖链分支)的杂聚物。其包含D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚、L-阿拉伯糖和/或多种寡糖，由D-木糖、L-阿拉伯糖，D-或L-半乳糖和D-葡萄糖组成。木聚糖类型的多糖可分为同木聚糖(homoxylan)和杂木聚糖(heteroxylan)，其包括葡糖醛酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和复合杂木聚糖(complex heteroxylan)。参见例如 Ebringerova 等，2005，Adv. Polym. Sci. 186 :1_67。在本发明的方法中，可使用任何含木聚糖材料。在一个优选的方面，所述含木聚糖材料是木素纤维素。成熟多肽术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，根据预测SEQ ID NO 2的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10 1_6)，成熟多肽是SEQ ID NO :2的氨基酸18至481。本领域中已知宿主细胞可产生两种或更多种由相同多核苷酸表达的不同成熟多肽(即，具有不同的C端和/ 或N端氨基酸)的混合物。成熟多肽编码序列术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有纤维二糖水解酶活性 II的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，根据预测SEQ ID NO 1的核苷酸1至51编码信号肽的 SignalP[程序，例如(Nielsen 等，1997 Jrotein Engineering 10:1-6)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO :1的核苷酸52至1433。在另一个方面，所述成熟多肽编码序列是包含于SEQ ID NO 1的核苷酸52至1433中的cDNA序列。序列同一性参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000， Trends Genet. 16 :276-277)，优选3. 0. 0版或更高版本的Needle程序中所执行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)来测定。 使用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty) 10，缺口延伸罚分(gap extension penalty) 0. 5 和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版)取代矩阵。使用 Needle 标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性， 并计算如下(同样的残基X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)就本发明而言，两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000， 见上文)，优选3. 0. 0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman和mmsch，1970，见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0. 5和EDNAFULL(NCBINUC4. 4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下(同样的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)片段术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有纤维二糖水解酶II活性。在一个方面，片段含有SEQ ID NO 2的成熟多肽的至少390个氨基酸残基，例如至少415个氨基酸残基，或至少440个氨基酸残基。亚序列术语“亚序列(subsequence) ”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’ 端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有纤维二糖水解酶 II活性的片段。在一个方面，亚序列含有SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列的至少1170个核苷酸，例如至少1245个核苷酸，或至少1320个核苷酸。等位变体(allelic variant)术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。编码序列术语“编码序列”意指直接指定其多肽产物氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或其他起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、 cDNA、合成的或重组的多核苷酸。cDNA 术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA 分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的包括剪接的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。核酸构建体术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。调控序列(control sequence)术语“调控序列”意指对编码本发明变体的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述变体的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码变体的多核苷酸编码区的连接。可操作地连接术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。表达术语“表达”包括涉及本发明的变体产生的任何步骤，其包括但不限于转录、 转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达载体术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明的变体的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。宿主细胞“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，所述后代由于在复制中发生的突变与亲本细胞不完全相同。增加的热稳定性术语“增加的热稳定性”意指相对于亲本在一定温度一段时间的温育之后，变体保留了较高的纤维二糖水解酶II活性。所述变体相对于亲本的增加的热稳定性可例如在一个或多个(几个)温度条件下进行评价。例如，所述一个或多个(几个) 温度可为任何45°c至95°C的范围的温度，例如45、50、55、60、65、70、75、80、85或95°C (或其间温度例如 670C )，在 3 至 8 范围的 pH，例如 3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0、 7. 5或8. 0(或其间)进行合适期间的温育，例如1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、 45分钟或60分钟，从而使得所述变体相对于亲本保留残余活性。在一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 3.0和50°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 3.0和55°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 3. 0和60°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 3. 0和65°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 3.0和70°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 3.0 和75°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 3.0和80°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 3.0和85°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 3. 0和90°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 3.5和501确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 3.5和551确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 3.5和601确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 3.5和651确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 3.5和701确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 3.5和751确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 3. 5和 80°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 3.5和851确定的。 在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 3. 5和90°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 4.0和50°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 4.0和55°C确定的。在另一个方面， 所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 4.0和60°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 4.0和65°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 4.0和70°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 4.0和75°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 4. 0和 80°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 4.0和85°C确定的。 在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 4. 0和90°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 4.5和501确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 4.5和551确定的。在另一个方面， 所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 4.5和601确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 4.5和651确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 4.5和701确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 4.5和751确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 4. 5和 80°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 4.5和851确定的。 在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 4. 5和90°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 5.0和50°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 5.0和55°C确定的。在另一个方面， 所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 5.0和60°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 5.0和65°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 5.0和70°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 5.0和75°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 5. 0和 80°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 5.0和85°C确定的。 在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 5. 0和90°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 5.5和501确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 5.5和551确定的。在另一个方面， 所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 5.5和601确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 5.5和651确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 5.5和701确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 5.5和751确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 5. 5和 80°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 5.5和851确定的。 在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 5. 5和90°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 6.0和50°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 6.0和55°C确定的。在另一个方面， 所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 6.0和60°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 6.0和65°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 6.0和70°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 6.0和75°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 6. 0和 80°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 6.0和85°C确定的。 在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 6. 0和90°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 6.5和501确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 6.5和551确定的。在另一个方面， 所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 6.5和601确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 6.5和651确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 6.5和701确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 6.5和751确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 6. 5和 80°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 6.5和851确定的。 在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 6. 5和90°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 7.0和50°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 7.0和55°C确定的。在另一个方面， 所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 7.0和60°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 7.0和65°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 7.0和70°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 7.0和75°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 7. 0和 80°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 7.0和85°C确定的。 在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 7. 0和90°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 7.5和501确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 7.5和551确定的。在另一个方面， 所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 7.5和601确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 7.5和651确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 7.5和701确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 7.5和751确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 7. 5和 80°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 7.5和851确定的。 在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 7. 5和90°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 8.0和50°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 8.0和55°C确定的。在另一个方面， 所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 8.0和60°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 8.0和65°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 8.0和70°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 8.0和75°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 8. 0和 80°C确定的。在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在pH 8.0和85°C确定的。 在另一个方面，所述变体相对于亲本的热稳定性是在PH 8. 0和90°C确定的。
在上述每一个方面中，所述变体相对于亲本的热稳定性是通过温育所述变体和亲本1分钟而确定的。在上述每一个方面中，所述变体相对于亲本的热稳定性是通过温育所述变体和亲本5分钟而确定的。在上述每一个方面中，所述变体相对于亲本的热稳定性是通过温育所述变体和亲本10分钟而确定的。在上述每一个方面中，所述变体相对于亲本的热稳定性是通过温育所述变体和亲本15分钟而确定的。在上述每一个方面中，所述变体相对于亲本的热稳定性是通过温育所述变体和亲本30分钟而确定的。在上述每一个方面中， 所述变体相对于亲本的热稳定性是通过温育所述变体和亲本45分钟而确定的。在上述每一个方面中，所述变体相对于亲本的热稳定性是通过温育所述变体和亲本60分钟而确定的。然而，可使用任何时间期间以说明本发明的变体相对于亲本的增加的热稳定性。变体相对于亲本的增加的热稳定性可通过使用本领域标准方法的差示扫描量热法(DSC)(参见，例如 Sturtevant，1987，Annual Review of Physical Chemistry 38: 463-488)来确定。变体相对于亲本的增加的热稳定性亦可使用本领域已知的任何对于纤维二糖水解酶II的酶测定法来确定。变体相对于亲本的增加的热稳定性亦可使用实施例 5中所述的测定法来确定。在一个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的变体的热稳定性与亲本相比，为至少 1. 05倍，例如至少1. 5倍，至少1. 8倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少15倍，至少20 倍，至少25倍和至少50倍更加稳定。发明的具体描述本发明涉及亲本纤维二糖水解酶II的分离的变体，其在一个或多个(几个)对应于SEQ ID NO 2的成熟多肽的位置272、287、325、347、357、363、409、464和476的位置处包含取代，其中所述变体具有纤维二糖水解酶Π活性。本发明的变体与亲本相比具有增加的热稳定性。变体命名规则就本发明而言，使用公开于SEQ ID NO 2中的成熟多肽以确定在其他纤维二糖水解酶II中对应的氨基酸残基。将其他纤维二糖水解酶II的氨基酸序列与公开于SEQ ID NO :2中的成熟多肽进行比对，并基于该比对，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman 和 Wunsch, 1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)(如用 EMBOSS 软件包(EMBOSS 欧洲分子生物开放软件组(The European Molecular Biology Open Software Suite), Rice 等，2000， Trends in Genetics 16 :276-277 ;http://emboss, org)的Needle程序执行，优选为 3. 0. 0 版或之后的版本)确定SEQ ID NO :2所公开的成熟多肽中任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。在另一个纤维二糖水解酶II中对应氨基酸残基的鉴定可通过使用 "Clustalff" (Larkin 等，2007，Bioinformatics 23 :2947-2948)进行的多个多肽序列的比对来确证。当其他酶与SEQ ID NO :2的成熟多肽歧异到传统的基于序列的比较无法检测出其关系时(Lindahl 和 Elofsson，2000, J. Mol. Biol. 295 :613-615)，可使用其他配对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用采用多肽家族的概率表现(probabilistic r印resentation)(序型)搜索数据库的搜索程序来获得。例如，PSI-BLAST程序通过迭代的(iterative)数据库搜索过程来产生序型，并能够检测出较远的同源物(Atschul等，1997, Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402)。当多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表时，甚至可达成更高的敏感度。程序如GenTHR ADER(Jones 1999， J. Mol. Biol. 287 :797-815 ；McGuffin 和 Jones, 2003，Bioinformatics 19 :874-881)使用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测(secondary structure prediction)、结构比对 j^M (structural alignment profile) URMM^1 (solvation potential))白勺预测所查询序列(query sequence)结构折叠(structural fold)的神经网络的输入。类似地，Gough等，2000, J. Mol. Biol. 313 :903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于 SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对可接着用于生成所述多肽的同源性模型， 且上述模型可就其准确度使用多种为此目的开发的工具加以评价。对于已知结构的蛋白质，可获取数种工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。例如，已将SCOP超家族的蛋白质进行了结构比对，且这些比对是可获取并可下载的。两个或更多蛋白质结构可使用多种算法，如距离比对矩阵(distance alignment matrix)(Holm 禾口 Sander,1998, Proteins 33 :88-96)或组合延伸(combinatorial extension) (Shindyalov 禾口 Bourne, 1998, Protein Engineering. 11 :739-747)进对亍比对， 且这些算法的实施可另外用于查询具有目标结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物 (例如 Holm 禾口 Park，2000，Bioinformatics 16 :566-567)。在描述本发明的不同变体时，为了参照方便起见，采用了下面所述的命名法。在所有情况下，使用通用的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。_。对于氨基酸取代，使用下述命名法初始氨基酸，位置，取代氨基酸。相应地，在2 位用丙氨酸取代苏氨酸命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变可以用加号 (“ + ”)分开，例如，“Gly205Arg+kr411Phe” 或 “G205R+S411F”，分别代表 205 和 411 位用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。迹失。对于氨基酸缺失，使用了如下命名法初始氨基酸，位置*。相应地，在位置 195缺失甘氨酸命名为“Glyl95*”或“G195*”。多个缺失通过加法符(“ + ”)分开，例如， "Glyl95*+Ser4ir” 或 “G195*+S411*，，。ΜΑ。对于氨基酸插入，使用了如下的命名法初始氨基酸，位置，初始氨基酸， 插入的氨基酸。因此，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸命名为“Glyl95GlyLys”或 “G195GK”。多个氨基酸的插入命名为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸 #1，插入的氨基酸#2 ；等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸记为 "Glyl95GlyLysAla” 或 “G195GKA，，。在此情况下，通过在插入的氨基酸残基前的氨基酸残基的位置号添加小写字母而对插入的氨基酸残基进行编号。因此，在上一例子中序列为
权利要求
1.一种亲本纤维二糖水解酶II的分离的变体，其在一个或多个(几个)对应于SEQ ID NO 2的成熟多肽的位置272、沘7、325、；347、；357、363、409、464和476的位置包含取代，其中所述变体具有纤维二糖水解酶II活性。
2.权利要求1的变体，其在对应于SEQID NO 2的成熟多肽的位置272的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp 或 Tyr，优选用kr的取代。
3.权利要求1或2的变体，其在对应于SEQID NO 2的成熟多肽的位置观7的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp或Tyr，优选用Lys的取代。
4.权利要求1-3任一项的变体，其在对应于SEQID NO 2的成熟多肽的位置325的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr、Trp或Tyr，优选用Asp的取代。
5.权利要求1-4任一项的变体，其在对应于SEQID NO 2的成熟多肽的位置347的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr、Trp或Tyr，优选用lie的取代。
6.权利要求1-5任一项的变体，其在对应于SEQID NO :2的成熟多肽的位置357的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr、Trp或Tyr，优选用Asn的取代。
7.权利要求1-6任一项的变体，其在对应于SEQID NO 2的成熟多肽的位置363的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr、Trp或Tyr，优选用Lys的取代。
8.权利要求1-7任一项的变体，其在对应于SEQID NO :2的成熟多肽的位置409的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr、Trp或Tyr，优选用Cys的取代。
9.权利要求1-8任一项的变体，其在对应于SEQID NO :2的成熟多肽的位置464的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr、Trp或Tyr，优选用Gln的取代。
10.权利要求1-9任一项的变体，其在对应于SEQID NO :2的成熟多肽的位置476的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、 Thr、Trp或Tyr，优选用Cys的取代。
11.权利要求1-10任一项的变体，其在对应于位置272、287、325、347、357、363、409、 464 和 476 的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、 Phe、Pro、Ser, Thr、Trp 或 Tyr 的取代。
12.权利要求1-11任一项的变体，其包含一个或多个(几个)选自下组的取代A272S、 Q287K、S325D、L347I、D357N、S363K、G409C、T464Q 和 N476C。
13.权利要求1 的变体，其包含取代 A272S+Q287K，S325D+L347I+D357N+S363K+G409C+ T464Q+N476C0
14.权利要求1-13任一项的变体，其在对应于位置435的位置进一步包含用Ala、Arg、 Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp 或 Tyr 的取代。
15.权利要求1-14的变体，其中所述亲本纤维二糖水解酶II为(a)多肽，其与SEQID NO :2的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少95 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %，至少 99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在低严格条件下、中等严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下或非常高严格条件下与以下杂交(i)SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)⑴或( ) 的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQID NO :1的成熟多肽编码序列或其基因组DNA序列具有至少60 %，例如至少65 %，至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %， 至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的同一性；或(d)SEQID NO 2的成熟多肽的片段，其具有纤维二糖水解酶II活性。
16.权利要求1-15任一项的变体，其与亲本纤维二糖水解酶II的氨基酸序列具有至少 60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%，但少于100%序列同一性。
17.权利要求1-15任一项的变体，其与SEQID NO :2的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%，但少于100%序列同一性。
18.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-17任一项的变体。
19.一种产生亲本纤维二糖水解酶II的变体的方法，包括(a)在适于所述变体的表达的条件下培养包含权利要求18的多核苷酸的宿主细胞；和(b)回收所述变体。
20.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其经权利要求18的多核苷酸转化。
21.一种产生权利要求1-17任一项的变体的方法，包括(a)在有助于产生所述变体的条件下培养包含编码所述变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述变体。
22.一种用于降解或转化纤维素材料的方法，包括在权利要求1-17任一项的变体存在下用酶组合物处理所述纤维素材料，其中具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和液体的组合增强了酶组合物对纤维素材料的水解。
23.权利要求22的方法，进一步包括回收经降解的纤维素材料。
24.一种用于产生发酵产物的方法，包括(a)在权利要求1-17任一项的变体的存在下用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；知(c)从所述发酵回收所述发酵产物。
25.一种发酵纤维素材料的方法，包括用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料在权利要求1-17任一项的变体的存在下用酶组合物糖化。
26.权利要求25的方法，其中纤维素材料的发酵产生发酵产物。
27.权利要求沈的方法，进一步包括从所述发酵回收所述发酵产物。
全文摘要
本发明涉及亲本纤维二糖水解酶II的变体。本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；和使用所述变体的方法。
文档编号C12N9/42GK102597228SQ201080047933
公开日2012年7月18日 申请日期2010年10月20日 优先权日2009年10月23日
发明者M.沃古利斯 申请人:诺维信股份有限公司