专利名称：用于病毒拯救的改良反向遗传方法
技术领域：
本发明涉及反向遗传领域。此外，其涉及制造用于保护抵御各种病毒的疫苗。
背景技术：
反向遗传可在细胞培养中重组表达和操作RNA病毒。它是病毒学和疫苗制造的有效工具，因为能快速生产重组病毒(包括重配株)和/或其突变型。所述方法涉及用一种或多种编码所述病毒基因组的表达构建体转染宿主细胞和从所述细胞中分离所述病毒。 通过反向遗传进行病毒拯救的一个缺点是过程低效且通常导致病毒产量不令人满意。因此本领域仍需要提供更有效的反向遗传替代方法。优选实施方式概述本发明人意外发现反向遗传的低效可通过用反向遗传构建体转染细胞然后向该转染细胞中添加更多细胞而得到显著改良。本发明人猜测观察到的效率增加是由于转染对所述细胞有害。因此，任何拯救的病毒需要在带病的细胞中扩增或等待将该病毒转染到健康细胞中。这导致有活力的病毒的损失。将细胞添加到所述转染宿主细胞中能使拯救的病毒在健康细胞底物中扩增，这能显著提高病毒产量。在一个实施方式中，本发明提供制备病毒的方法，所述方法包括步骤(i)用至少一种编码病毒RNA分子的表达构建体转染宿主细胞培养物；(ii)向(i)的转染宿主细胞中添加细胞以提供细胞混合物；和(iii)培养该细胞混合物产生病毒。在另一实施方式中，本发明提供制备用于生产疫苗的病毒的方法，所述方法包括步骤(i)用至少一种编码病毒RNA分子的表达构建体转染宿主细胞培养物；(ii)向(i)的转染宿主细胞中添加细胞以提供细胞混合物；(iii)培养该细胞混合物产生病毒；(iv)纯化步骤(iii)中获得的病毒和任选地(V)用该病毒配制成疫苗。反向遗传反向遗传可用于生产各种RNA病毒,包括正链RNA病毒[I, 2],负链RNA病毒[3,4]和双链RNA病毒[5]。因此，本发明提供生产重组病毒的方法，其中所述病毒用本发明的反向遗传方法获得。已知反向遗传系统包括用POl I启动子、细菌RNA聚合酶启动子、噬菌体聚合酶启动子等表达编码所需病毒RNA (vRNA)分子的DNA分子。此外，病毒需要特定蛋白以形成感染病毒时，系统还提供这些蛋白，例如所述系统还包括编码病毒蛋白的DNA分子从而两种DNA的表达导致完整感染病毒的组装。反向遗传用于vRNA表达时，本领域技术人员清楚所述序列元件彼此的精确间隔对于所述聚合酶启动复制至关重要。因此编码所述病毒RNA的DNA分子正确位于所述polI启动子和所述终止序列之间很重要，但该定位在反向遗传系统操作人员的能力范围内。
通常，反向遗传适合于表达需要在生命周期中生产基因组RNA的任何病毒。此类病毒包括但不限于正链和负链RNA病毒，如下文所述病毒。所述病毒优选正粘病毒如流感病毒。本发明的方法还适合非节段以及分节段病毒。所述病毒为正链RNA病毒时，用含所述病毒基因的表达构建体转染细胞通常已足够。例如，含有脊髓灰质炎病毒基因组的质粒转染引起传染性脊髓灰质炎病毒的回收[1，2]。负链RNA病毒的反向遗传更具挑战性，因为所述反义病毒RNA通常无感染性且需要RNA聚合酶来完成生命周期。因此，必须以蛋白或用于原位蛋白表达的基因形式提供所述病毒聚合酶。所述病毒的传染性需要蛋白质时，通常优选使用双向表达构建体，因为这能减少所述宿主细胞需要的表达构建体总数。因此,本发明方法可利用至少一种双向表达构建体，其中基因或cDNA位于上游pol II启动子和下游非内源poll启动子之间。从所述pol II启动子转录所述基因或cDNA产生可翻译为蛋白质的加帽正义病毒mRNA，而从所述非内源 pol I启动子转录产生负义vRNA。所述双向表达构建体可为双向表达载体。为了生产重组病毒，细胞必须表达组装病毒粒子所需病毒基因组的所有节段，克隆到本发明表达构建体内的DNA优选提供所述病毒所有RNA和蛋白，但也可使用辅助病毒以提供一些RNA和蛋白，尽管优选不使用辅助病毒的系统。所述病毒为非节段病毒时，通常可通过在本发明方法中利用单一表达构建体实现该系统，但使用多于一种表达构建体表达非节段病毒的病毒基因组也在本发明的范围之内。所述病毒为分节段病毒时，本发明方法通常用多于一种表达构建体表达所述病毒基因组。然而，还考虑在单一表达构建体上组合所述病毒基因组的一种或多种节段或甚至所有节段。本发明方法尤其适于生产重配病毒株。所述技术可用质粒的体外操控以产生病毒节段的组合、以便于操控病毒节段中的编码序列或非编码序列、以引入突变等。优选使用所述表达系统生产重配病毒株，因为这样可显著减少获得重配种病毒所需的时间，这在需要快速生产疫苗以抵抗流行病的情况中尤其有用。因此本发明本方面的方法优选使用表达来自或源自至少两种不同野生型毒株的病毒基因的一种或多种表达构建体。还可使用导致所述宿主细胞内表达辅助蛋白的表达构建体。例如，可能宜表达非病毒丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)，作为反向遗传系统的一部分。表达构建体本发明所用的编码病毒RNA分子的表达构建体可为本领域通常用于拯救病毒的任何表达构建体。所用的表达构建体可为单向或双向表达构建体。宿主细胞表达多于一种转基因时(不论在相同或不同表达构建体上)可能使用单向和/或双向表达。双向表达构建体含从同一构建体中的不同方向(即5'到3'和3'到5')驱动表达的至少两种启动子。所述两种启动子可操作性连接同一双链DNA的不同链。优选所述启动子之一是pol I启动子且至少一种其他启动子为pol II启动子。这是有利的，因为所述pol I启动子可用于表达非加帽的cRNA而所述pol II启动子可用于转录随后翻译为蛋白质的mRNA，因此同一构建体能同时表达RNA和蛋白质。所述表达构建体(不论是单向或双向)通常包括RNA转录终止序列。所述终止序列可为内源终止序列或对所述宿主细胞非内源的终止序列。本领域技术人员清楚合适的终止序列且其包括但不限于RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列、和核酶。此外，所述表达构建体可包括针对mRNA的一种或多种聚腺苷酸化信号，尤其在表达受pol II启动子控制的基因的末端。用在所述表达构建体中的pol I和pol II启动子可源自与表达该表达构建体的宿主细胞相同分类学目的生物体。或者，该启动子可源自与所述宿主细胞不同分类学目的生物体。术语“目”指常规分类学分级，目的示例为灵长目、哨齿目、食肉目、有袋目、鲸目等。人和黑猩猩在同一分类学目中(灵长目)，但人和狗在不同的目中(灵长目与食肉目)。本发明的方法中，可用至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种或至少12种表达构建体转染宿主细胞。表达构建体可为载体，如质粒或其他游离构建体。此类载体通常包括至少一个细菌和/或真核的复制起点。此外，所述载体可包括可在原核和/或真核细胞中筛选的选择性标记。此类选择性标记的示例为对抗生素产生抗性的基因，如氨苄青霉素或卡那霉素。所述载体还可包括一个或多个多克隆位点以方便DNA序列克隆。 或者，表达构建体可为线性表达构建体。该线性表达构建体通常不含任何氨苄青霉素和/或选择序列。但是，包含该氨苄青霉素和/或选自序列的线性构建体也在本发明的范围内。使用该线性表达构建体以表达流感病毒的方法在参考文献6中描述。本发明的表达构建体可用本领域已知方法产生。例如,参考文献7中描述了此类方法。所述表达构建体为线性表达构建体时，可在导入所述宿主细胞前利用单个限制性酶位点使之线性化。或者，可用至少两种限制性酶位点从载体中切下所述表达构建体。此外，也可通过用核酸扩增技术(如用PCR)扩增获得线性表达构建体。表达宿主为犬细胞如MDCK细胞系时，蛋白编码区可针对犬表达优化，如使用来自野生型犬基因或来自犬病毒的启动子，和/或比起人细胞更适于犬细胞的密码子用法。例如，人基因较偏好将UUC用作Phe的密码子(54% )，在犬细胞中该偏好更强(59% )。相似地，Ile密码子在人细胞中没有明显偏好，而53%的犬密码子将AUC用于He。犬病毒，如犬细小病毒(ssDNA病毒)也可为密码子优化提供指导，如犬细小病毒序列中95%的Phe密码子为UUU(对比犬基因组中的41% )，68%的Ile密码子为AUU(对比32% )，46%的Val密码子为GUU(对比14% )，72%的Pro密码子为CCA(对比25% )，87 %的Tyr密码子为UAU (对比40 % )，87 %的His密码子为CAU (对比39 % )，92 %的Gln密码子为CAA (对比25% )，81%的Glu密码子为GAA(对比40% )，94%的Cys密码子为UGU(对比42% )，仅1%的Ser密码子为U⑶(对比24% )，CCC从不用于Phe且UAG从不用作终止密码子。因此，可使蛋白编码基因更接近已为犬细胞表达而自然优化的基因，从而方便表达。转染“转染”指将DNA导入细胞中。可利用本领域技术人员已知的任何技术将所述表达构建体导入宿主细胞。例如，可通过使用电穿孔、DEAE-右旋糖苷、磷酸韩沉淀、脂质体、微注射、微粒轰击将其导入宿主细胞。反向遗传通常用脂质体方法实施，例如用转染试剂Lipofectamine 0本发明的方法不局限于用脂质体转染，但期望用其他转染方法能良好的工作。所述细胞可在转染后最多72小时的任何时间加入转染的宿主细胞中。例如，所述细胞可在转染后立即、转染后5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、I小时、2小时、3小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时加入。通常，转染后加入细胞的最
大时间与所述转染的细胞能存活的最大时间匹配。“转染后”时期从所述DNA导入培养物内的宿主细胞中开始。DNA导入的时间点由于各种因子而不同，例如所用细胞系、转染方法或实施转染时的温度。技术人员用标准方法可容易地确定该时间。例如，可平行进行数种实验，其中所述细胞在相同条件下用反向构建体转染但转染在不同时间点停止。若DNA导入所述宿主细胞则至少已形成一种病毒。因此，技术人员可分析此病毒是否存在，例如通过用标准实验确定空斑形成单位的数量。可检测到至少一种空斑形成单位(PFU)的第一时间点是DNA导入宿主细胞的时间点。或者，细胞加入转染细胞的时间可从所述转染开始时确定。转染开始是编码所述病毒分子的表达构建体接触宿主细胞培养物的时间点。因此，细胞可在转染开始后最多96小时的任何时间加入转染细胞中，例如12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时或96小时。虽然时间点“转染后”和时间点“从转染开始”相对不同起始点测量，但细胞加入感染细胞中的绝对时间可相同。例如,若DNA需要I小时来导入培养物中的宿主细胞且所述细胞在DNA导入后30分钟加入，则所述细胞会在从转染开始的90分钟或转染后30分钟加入。转染后加入的细胞数量通常根据作为宿主细胞用于转染的细胞数量以及用于转染的细胞培养容器的大小而不同。本发明方法可用的细胞数量可由技术人员容易地确定。例如，本发明方法可在数种平行实验中以相同条件进行，但加入的细胞数量不同。产生最高病毒产量的细胞数量可用于进一步实验。例如，当约6xl05个细胞用作Lipofectamine 转染的初始培养物，则加入约4xl05个细胞。
转染后加入的细胞为病毒拯救提供在其上复制的底物。因此，所述细胞可为未感染细胞，这表示该细胞在其用于本发明方法之前的一定时间内(例如48小时)没有被病毒感染或用编码病毒RNA的表达构建体转染。用病毒例如EB(Epstein-Barr)病毒感染使之永生化的细胞适合用于本发明。同样，转染的细胞可用于本发明方法，前题是该细胞用于本发明方法之前的短时间内(即48小时内)未发生转染。拯救的病毒需要存在蛋白酶以具有感染性时，优选转染后将该蛋白酶和细胞一起加入。例如，流感疫苗需要丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶活性来感染。因此，本发明方法用于拯救流感疫苗时，可在转染后将所述丝氨酸蛋白酶和细胞同时加入。或者，可在所述细胞加入所述转染的细胞之前或之后加入所述蛋白酶。细胞本发明可用能生产感兴趣病毒的任何原核细胞实施。本发明通常使用细胞系，但例如原代细胞可用作替代细胞。所述细胞通常为哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于仓鼠、牛、灵长类(包括人和猴)，以及犬细胞。可使用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适仓鼠细胞的例子是名为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞包括例如，非洲绿猴细胞，例如肾细胞，如Vero细胞系[8-10]。合适的犬细胞是(例如)肾细胞，例如CLDK和MDCK细胞系。其他合适的细胞包括但不限于CH0；293T ；BHK ；MRC 5 ；PER. C6 [11] ；FRhL2 ；WI-38;等。合适的细胞系可由各种来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC) [12]、Coriell细胞库[13]或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同Vero细胞，目录号为CCL81、CCL81. 2、CRL1586和CRL-1587，并提供目录号为CCL34的MDCK细胞。PER. C6可获自ECACC，保藏号为96022940。MDCK、Vero和PER. C6细胞通常用于生产病毒，因此这些细胞系各自尤其适用于本发明的方法。本发明使用的细胞优选源自马达二氏(Madin Darby)犬肾的MDCK细胞[14_16]。原始MDCK细胞可以CCL 34获自ATCC。优选使用这些细胞的衍生细胞或其他MDCK细胞的衍生细胞。MDCK的衍生细胞如参考文献14所述，其公开了适合悬浮培养的MDCK细胞('MDCK33016'或‘33016-PF’，保藏号DSM ACC 2219，也可参见参考文献14)。此外，参考文献17公开了在无血清培养基中悬浮培养的MDCK衍生细胞('B-702/，保藏号FERM BP-7449)。所用的MDCK细胞系可为致瘤性的。也考虑使用非致瘤性MDCK细胞。例如，参考文献18公开了非致瘤性 MDCK 细胞，包括'MDCK-S' (ATCC PTA-6500)、' MDCK-SF10T (ATCCPTA-6501)、' MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502)和'MDCK-SF103' (PTA-6503)。参考文献19公开了具有高感染易感性的MDCK细胞，包括‘MDCK. 5F1’细胞(ATCC CRL 12042)。用于转染的细胞和用于转染后添加的细胞可为相同或不同细胞类型。例如，所述表达构建体可转染入MDCK细胞且所添加的细胞可为VeiO细胞或反之亦然。可用其他例子，表达构建体转染入MDCK细胞的一种株系且添加的细胞为不同MDCK株系。该方法具有优势，拯救的病毒在不容易被转染的细胞系中生长最好。在这个方面，所述病毒可转染到更易转染的细胞中，但随后可在更适于病毒复制的细胞系中繁殖。然而，通常优选使用相同细胞系(如MDCK 33016细胞)作为转染和随后添加细胞的宿主细胞，因为这样具有优势，例如可避免竞争培养选择压力或不同细胞培养条件。也可使用多于一种细胞类型的混合物作为宿主细胞用于转染和/或用于转染后添加。所述细胞优选在无血清中培养以避免常见污染源。本领域技术人员已知用于真核细胞培养的各种无血清培养基(如伊可夫氏(Iscove' s)培养基、超CHO培养基(BW公司(BioWhittaker))、EX_CELL (JRH 生物科学公司(JRH Biosciences)))。此外，可用无蛋白培养基(如PF-CHO(JRH生物科学公司))。另外，用于复制的细胞也可在常规含血清培养基中(如含O. 5% -10%胎牛血清的MEM或DMEM培养基)培养。所述宿主细胞和加入的细胞可贴壁培养或悬浮培养。例如，用于转染的细胞可为贴壁细胞且转染后添加的细胞也可为贴壁细胞。转染后添加的细胞为贴壁细胞时，很明显该细胞在加入所述转染的细胞中前需要从其生长的培养容器中移出。这可在例如丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶的协助下实现。也可用悬浮培养细胞作为转染的宿主细胞而贴壁细胞用作转染后添加且反之亦然。本发明的方法通常在本领域通常用于特异转染方法的温度下实施。例如，用脂质体转染时，DNA/脂质体复合物首次添加时所述转染反应最初可室温孵育(例如约30分钟)，然后在约37°C孵育特定时间段(例如约24小时)。本发明的方法可用本领域已知的任何转染方法实施，因此实施转染的温度技术人员已知。或者，也可通过在除了转染期间孵育温度不同的相同条件下平行进行数种转染实验来寻找合适的孵育温度。拯救的病毒数量表明转染效率且可如上所述通过分析产生的PFU数量来确定。产生最大数量PFU的温度可用于转染。将所述细胞加入所述转染细胞的温度和所得细胞混合物孵育的温度可与转染期间所用温度相同或不同。所述温度可取决于用于转染后添加的细胞系且也可随本发明方法拯救的病毒而不同。生长个体细胞系或拯救具体病毒的合适温度本领域已知，然而，技术人员因此可容易地鉴定合适的温度。例如，哺乳动物细胞系如Vero、Per. C6和MDCK细胞系通常在36°C和38°C之间或约37°C的温度生长。该温度还选择用于拯救许多病毒，尽管一些病毒如流感病毒可在约33°C的温度拯救，因为这样可使所得病毒产生更好的抗原性[20]。也可通过在除了转染后孵育温度不同的相同条件下平行进行数种转染实验来鉴定合适的温度。产生最大数量PFU的温度可在转染后使用。分析PFU的合适方法如上所述与鉴定转染期间所用温度的试验相关。病毒制备在另一方面，本发明提供制备用于生产疫苗的病毒的方法，所述方法包括步骤(i)用至少一种编码病毒RNA分子的表达构建体转染宿主细胞培养物；(ii)向(i)的转染宿主细胞中添加细胞以提供细胞混合物；和(iii)培养该细胞混合物产生病毒；和(iv)纯化步骤(iii)中获得的病毒和任选地(V)用该病毒配制成疫苗。 本发明此方面中用细胞作培养宿主时，已知细胞培养条件(如温度、细胞密度、PH值等)根据所用细胞系和病毒在较宽的范围内变化且可根据应用需求调整。因此下述信息仅代表指南。如上所述，细胞优选培养在无血清或无蛋白的培养基中。所述细胞的繁殖可按照本领域技术人员已知的方法进行。例如，所述细胞可在使用常规支持方法如离心或过滤的灌注系统中培养。而且，所述细胞可按照本发明于感染前在分批进料系统中繁殖。在本发明的内容中，培养系统指分批进料系统，其中所述细胞初始培养于分批系统中且通过控制浓缩营养的补料来补偿培养基中营养的消耗(或部分消耗)。在感染前的细胞繁殖期间将培养基的PH值调节在pH 6.6-pH 7. 8之间，特别是pH
7.2-pH 7. 3之间是有利的。细胞培养优选在30-40°C的温度进行。在步骤(iii)中，所述细胞优选在30°C -36°C或32°C _34°C或约33°C培养。这在使用本方法生产流感病毒时特别优选，因为已显示在此温度范围内孵育感染细胞能生产配入疫苗时功效改善的病毒[20]。感染前培养期的氧分压优选调节为25%-95%且特别为35%-60%。本发明内容中的氧分压值基于空气饱和度。在分批系统中细胞浓度优选约8-25xl05细胞/mL时或在灌注系统中优选约5-20xl06细胞/mL时进行细胞感染。所述细胞可用10_8_10，优选
O.0001-0. 5的病毒剂量(Μ0Ι值，“感染复数”，相当于感染时每细胞的病毒单位数量)感染。可以在贴壁或悬浮培养的细胞中培养病毒。可米用微载体培养。微载体培养被认为是贴壁培养。该细胞可能还适合悬浮培养。本发明所述方法还包括收获和分离病毒或其产生的蛋白。分离病毒或蛋白期间，通过标准方法如分离、过滤或超滤从所述培养基中分离所述细胞。之后按照本领域技术人员充分已知的方法如梯度离心、过滤、沉淀、层析等浓缩所述病毒或所述蛋白，然后纯化。按照本发明优选在纯化期间和之后灭活所述病毒。可在所述纯化过程中任何点用例如丙内酯或甲醛进行病毒灭活。按照本发明分离的病毒也可在步骤(iii)中在蛋上培养。目前培养疫苗用流感病毒的标准方法采用含胚的SPF鸡蛋，由鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。也可用蛋传代病毒并随后在细胞培养物中繁殖。病毒
本发明方法可用能在细胞中通过反向遗传表达的任何病毒实施。所述病毒可是分节段或非分段的病毒。此外，所述病毒可为正链RNA病毒或负链RNA病毒。所述病毒也可为双链RNA病毒。所述病毒为负链RNA病毒时，所述病毒可来自选自下组的科副粘病毒科(Paramyxoviridae)、肺炎病毒亚科(Pneumovirinae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、纤丝病毒科(Filoviridae)、博尔纳病毒科(Bornaviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、本扬病毒科(Bunyaviridae)、或沙粒病毒科(Arenaviridae) 此外，所述病毒可来自选自下组的属副粘病毒属(Paramyxovirus)、正粘病毒属(Orthomyxovirus)、呼吸道病毒属(Respirovirus)、麻疫病毒属(Morbillivirus)、腿腺炎病毒属(Rubulavirus)、亨尼病毒属(Henipaviras)、禽副粘病毒属(Avulavirus)、肺炎病毒属(Pneumovirus)、偏肺病毒属(Metapneumovirus)、水泡病毒属(Vesiculovirus)、狂犬病病毒属(Lyssavirus)、短暂热病毒属(Ephemerovirus)、质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)、核型弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)、粒外弹状病毒属(Novirhabdovirus)、马堡病 毒属(Marburgvirus)、埃博拉病毒属(Ebolavirus)、博尔纳病毒属(Bornavirus)、甲型流感病毒(Influenzavirus A)、乙型流感病毒(Influenzavirus B)、丙型流感病毒(Influenzavirus C)、托高土病毒属(Thogotovirus)、鲑传贫病毒属(Isavirus)、正本雅病毒属(Orthobunyavirus)、汉坦病毒属(Hantavirus)、内罗病毒属(Nairovirus)、白岭病毒属(Phlebovirus)、番煎斑萎病毒属(Tospovirus)、沙粒病毒属(Arenavirus)、蛇形病毒属(Ophiovirus)、纤细病毒属(Tenuivirus)、或δ病毒属(Deltavirus)。在具体实施方式
中，所述负链RNA病毒选自下组仙台病毒(Sendai virus)、麻疫病毒(Measlesvirus)、腿腺炎病毒(Mumps virus)、亨德拉病毒(Hendra virus)、新城疫病毒(Newcastledisease virus)、人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus)、禽月市病毒(Avian pneumovirus)、水泡性口炎印第安那病毒(Vesicular stomatitis Indianavirus)、狂犬病病毒(Rabies virus)、牛暂时热病毒(Bovine ephemeral fever virus)、萬苣坏死黄化病毒(Lettuce necrotic yellows virus)、马铃薯黄矮病毒(Potato yellowdwarf virus)、传染性造血组织坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus)、维多利亚湖马尔堡病毒(Lake Victoria marburgvirus)、扎伊尔埃波拉病毒(Zaireebolavirus)、博纳病病毒(Borna disease virus)、流感病毒(Influenza virus)、托高土病毒(Thogoto virus)、鲑传染性贫血病毒(Infectious salmon anemia virus)、布尼安维拉病毒(Bunyamwera virus)、汉坦病毒(Hantaan virus)、达格毕病毒(Dugbe virus)、裂谷热病毒(Rift Valley fever virus)、番煎斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus)、柑桔鱗皮病毒(Citruspsorosis virus)、水稻条纹病毒(Rice stripe virus)、和丁型肝炎病毒(Hepatitisdelta virus) 0在优选实施方式中，所述病毒为流感病毒(如下)。所述病毒为正链RNA病毒时，所述病毒可来自选自下组的科动脉炎病毒科(Arteriviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)和杆套病毒科(Roniviridae)。此外，所述病毒可为选自下组的属的病毒动脉炎病毒属(Arterivirius)、冠状病毒属(Coronavirus)、肠道病毒属(Enterovirus)、环曲病毒属(Torovirus)、头甲病毒属(Okavirus)、鼻病毒属(Rhinovirus)、肝病毒属(Hepatovirus)、心病毒属(Cardiovirus)、口蹄疫病毒属(Aphthovirus)、副肠孤病毒属(Parechovirus)、马鼻病毒属(Erbovirus)、崎病毒属(Kobuvirus)和捷申病毒属(Teschovirus)。在具体实施方式
中，所述病毒选自下组严重急性呼吸道综合症病毒(severe acuterespiratory syndrome (SARS) virus)、脊髓灰质炎病毒(polio virus)、甲型人肠病毒(Human enterovirus A) (HEV-A)、乙型人肠病毒(Human enterovirus B) (HEV-B)、丙型人肠病毒(Human enterovirus C)、丁型人肠道病毒(Human enterovirus D)、甲型肝炎病毒(Hepatitis A)和甲型与乙型人鼻病毒(H uman rhinovirus)。所述病毒为双链RNA病毒时，所述病毒可来自选自下组的科双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)、囊病毒科(Cystoviridae)、减毒病毒科(Hypoviridae)、分体病毒科(Partitiviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)和整体病毒科(Totiviridae)。此夕卜，所述病毒可为选自下组的属的病毒水生双RNA病毒属(Aquabirnavirus)、禽双RNA病毒属(Avibirnavirus)、昆虫双RNA病毒属(Entomobirnavirus)、囊状病毒属(Cystovirus)、分病毒属(Partitivirus)、α 潜隐病毒属(Alphacryptovirus)、β 潜隐病毒属(Betacryptovirus)、水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)、科罗拉多壁風热病毒属(Coltivirus)、质型多角体病毒属(Cypovirus)、斐济病毒属(Fi jivirus)、虫源呼肠孤病毒属(Idnoreovirus)、苍蚬呼肠病毒属(Mycoreovirus)、环状病毒属(Orbivirus)、正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)、水稻病毒属(Oryzavirus)、植物呼肠病毒属(Phytoreovirus)、轮状病毒属(Rotavirus)和东南亚十二节段RNA病毒属(Seadornavirus)。本发明优选使用的病毒为轮状病毒。因为所述病毒拯救的效率较差，用这些病毒的反向遗传目前较困难，因此本发明有助于所述病毒的拯救。本发明还特别适于经历快速突变的病毒和所述重组方法使所述病毒更快分离的情况，所述病毒然后可进一步繁殖以获得合适的疫苗。因此，在另一优选的实施方式中所述病毒为流感病毒。流感病毒流感病毒特别适于在本发明方法中使用，尤其是甲型流感病毒和乙型流感病毒，因为该病毒的反向遗传已被充分鉴定。流感病毒为分区段负链RNA病毒。甲型和乙型流感病毒具有8个节段，而丙型流感病毒有7个。所述病毒需要至少4种病毒蛋白(PB1、PB2、PA和核蛋白)来起始复制和转录。甲型和乙型流感病毒的反向遗传可用12种质粒实施以表达所需的4种蛋白和所有八种基因组节段。然而为减少所需的构建体数量，将多个RNA聚合酶I转录盒(用于合成病毒RNA)包含入单一质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感vRNA节段的序列)上，并且将多个蛋白编码区与RNA聚合酶II启动子包含入另一个质粒(如编码1、2、3、4、
5、6、7或所有8种流感mRNA转录物的序列)上[21]。也可将一种或多种流感vRNA节段纳Apol I启动子的控制下并将一种或多种流感蛋白编码区纳入同一质粒的另一启动子控制下，特别是pol II启动子。如上所述，这优选通过使用双向质粒完成。参考文献21方法的优选方面包括(a)在单一质粒上的PB1、PB2和PA mRNA编码区域；和(b)在单一质粒上的所有8种vRNA编码节段。特别优选在一种质粒上包括神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)节段并在另一质粒上包括六种其他节段，因为新出现的流感病毒株系通常在所述NA和/或HA节段具有突变。因此，在此实施方式中，只需替换包含所述HA和NA序列的载体。
甲型流感病毒的优选表达系统编码衍生自多种不同野生型株系的基因组节段。所述系统可编码PR/8/34株系(A/Puerto Rico/8/34)的I或多个(如1、2、3、4、5或6个)基因组节段，但通常这/这些节段不包括所述PR/8/34HA节段且通常不包括PR/8/34NA节段。因此所述系统可编码PR/8/34的NP、M、NS、PA、PB1和/或PB2中至少一个节段(可能全部六个)。甲型流感病毒的其他有用的表达系统可编码AA/6/60流感病毒(A/AnnArbor/6/60)的I或多个(如1、2、3、4、5或6个)基因组节段，但通常这/这些节段不包括所述AA/6/60HA节段且通常不包括AA/6/60NA节段。因此所述系统可编码AA/6/60的NP、M、NS、PA、PBl和/或PB2中至少一个节段(可能全部六个)。所述系统可编码A/California/4/09株系的一或多个基因组节段，如所述HA节段和/或所述NA节段。因此例如，HA基因节段可编码Hl血凝素，所述血凝素与SEQ ID NO 1的相关性高于与SEQ ID NO 2的相关性(即使用相同算法和参数，与SEQ ID NO 1相比的 序列相同性高于与SEQ ID N0:2的相同性)。SEQ ID NO :1和2有80%同一性。相似地，所述NA基因可编码NI神经氨酸苷酶，其与SEQ ID NO 3的相关性高于与SEQ ID NO 4的相关性。SEQ ID NO :3和4有82%同一性。乙型流感病毒的表达系统可编码衍生自多种不同野生型株系的基因组节段。所述系统可编码AA/1/66流感病毒(B/Ann Arbor/1/66)的I个或多个(如1、2、3、4、5或6个)基因组节段，但通常这/这些节段不包括AA/1/66的HA节段且通常不包括AA/1/66的NA节段。因此所述系统可编码AA/1/66的NP、M、NS、PA、PBl和/或PB2中至少一个节段。A/PR/8/34、AA/6/60、AA/l/66、A/Chile/l/83 和 A/California/04/09 株系的病毒节段和序列广泛可得。其序列可在公共数据库上获得，如GI :89779337, GI :89779334, GI 89779332、GI :89779320, GI :89779327, GI :89779325, GI :89779322, GI :89779329。流感病毒的反向遗传系统可包括导致所述宿主细胞中表达辅助蛋白的表达构建体。例如，表达非病毒丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)可具有优势。疫苗在一个方面，本发明利用本方法生产的病毒生产疫苗。疫苗(特别是流感病毒)通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可基于全病毒颗粒、‘裂解’病毒颗粒或基于纯化的表面抗原。抗原也可以病毒体形式存在。可使用本发明制造任意这些类型的疫苗。采用灭活病毒时，所述疫苗可包含完整的病毒颗粒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原(对于流感，包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种试剂处理去污剂、甲醛、β_丙内酯、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺、乙酰基乙烯亚胺或它们的组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如UV射线或Y射线辐射。可通过各种方法由含病毒液体如尿囊液或细胞培养物上清收获病毒颗粒。例如，纯化方法可包括用含有去污剂以破坏病毒颗粒的线性蔗糖梯度溶液进行区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。用去污剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三-N-丁基磷酸盐、曲通(Triton)XlOO、曲通Ν101、溴化十六烷基三甲铵、特吉托(Tergitol)NP9等)处理纯化的病毒颗粒以获得裂解病毒颗粒，从而产生亚病毒颗粒制剂，包括‘吐温-醚’裂解方法。裂解流感病毒的方法为本领域熟知，例如参见参考文献22-27等。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化完整病毒来裂解病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子型)表面活性剂，如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、NP9、季铵化合物、肌氨酰、CTAB (溴化十六烷基三甲铵)、三-N-丁基磷酸酯、塞塔隆(Cetavlon)、十四烷基三甲铵盐、脂质转染试剂、脂质转染胺试剂(Iipofectamine)和DOT-ΜΑ、辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通XlOO或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒颗粒初始纯化期间(例如在蔗糖密度梯度溶液中)进行。因此，裂解过程可包括澄清含病毒颗粒的物质(以去除非病毒颗粒物质)，浓缩收获的病毒颗粒(例如使用吸附方法，如CaHPO4吸附)，从非病毒颗粒材料分离全病毒颗粒，用裂解剂在密度梯度离心 步骤中裂解病毒颗粒(例如，用含有裂解剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(例如超滤)以去除不需要的物质。可将裂解的病毒颗粒重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。裂解流感疫苗的示例有BEGRIVAC 、FLUARIX 、FLUZ0NE 和FLUSHIELD 产品。本发明的方法也可用于生产活疫苗。此类疫苗通常通过从含病毒颗粒的液体中纯化病毒颗粒来制备。例如，所述液体可通过离心澄清并用缓冲液(例如含蔗糖、磷酸钾和谷氨酸单钠)稳定。目前可以获得各种形式的流感病毒疫苗(例如参见参考文献28的第17和18章)。活病毒包括米迪缪尼公司(MedImmune)的FLUMIST 产品(三价活病毒)。纯化的流感病毒表面抗原疫苗包含表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。制备这些蛋白质纯化形式的方法是本领域熟知的。fluvirin 、AgrippALb^p influvac 产品是流感亚基疫苗。另一种形式的灭活抗原是病毒体[29](不含核酸的病毒样脂质体颗粒)。病毒体可通过用去污剂溶解病毒，然后去除核衣壳和重建含病毒糖蛋白的膜来制备。另一种制备病毒体的方法包括将病毒膜糖蛋白加入至过量磷脂中，得到膜中具有病毒蛋白质的脂质体。所述病毒可被减毒。所述病毒可为温度敏感型。所述病毒可为冷适应性病毒。使用活病毒作为抗原时这三种特征特别有用。HA是现有灭活流感疫苗中的主要免疫原，且参照一般由SRID测定的HA水平来标准化疫苗剂量。现有的疫苗一般含有约15 μ g HA/毒株，但也可使用更低的剂量，例如儿童或大流行情况下，或者是使用佐剂时。分数剂量如1/2(即7.5yg HA/毒株)、1/4和1/8以及较高剂量(如3x或9x剂量[30，31])已有应用。因此，疫苗可包含O. 1-150 μ g HA/流感毒株，优选 O. 1-50 μ g,例如 O. 1-20 μ g、0. 1-15 μ g、0. 1-10 μ g、0. 1-7. 5 μ g、0. 5-5 μ g等。具体剂量包括例如，约45、约30、约15、约10、约7. 5、约5、约3. 8、约3. 75、约I. 9、约
I.5等/株。对于活疫苗，利用组织培养感染剂量中值(TCID5tl)而非HA含量来衡量剂量，且TCID50—般为 106-108(优选为 IO6 5-IO7 5)/毒株。本发明所用的流感株系可以具有野生型病毒中的天然HA，或具有修饰HA。例如，已知修饰HA去除决定簇(如HA1/HA2切割位点周围的超碱性区域(hyper-basic region))能使病毒在禽类动物中具有高度致病性。采用反向遗传促进这类修饰。用于疫苗的流感病毒株随季节而变。在大流行间期，疫苗一般包括两种甲型流感株系(H1N1和H3N2)和一种乙型流感株系，且一般为三价疫苗。本发明也可采用大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群没有与其发生过免疫接触的毒株，特别是甲型流感病毒)，如H2、H5、H7或H9亚型毒株，且大流行株系的流感疫苗可以是单价疫苗或者可以基于补充有大流行株系的正常三价疫苗。然而，根据季节和疫苗中所含抗原的特性，本发明可保护抵御HA 亚型 HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16 中的一种或多种。本发明可保护抵御甲型流感病毒NA亚型NI、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中的一种或多种。除了适合进行针对大流行间期株系的免疫外，本发明组合物还特别有助于免疫抵御大流行或潜在大流行株系。可能引起大流行爆发的流感毒株的特征是(a)与目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即十年以上在人群中未见的血凝素(如 H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如通常只出现在鸟群体中的H5、H6或H9)，以至于人群未曾免疫接触过该毒株的血凝素；(b)它能够在人群中横向传播；和(c)它对人有致病性。优选用含H5血凝素类型的病毒免疫以抵御大流行流感，如H5N1毒株。其它可能的株系包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出现的大流行株系。本发明特别适于保护抵御可以或已经从非人动物群体传播给人类的潜在大流行毒株，如猪源HlNl流感株系。因此本发明适于给人类以及非人动物接种疫苗。其抗原可用于包含在所述组合物中的其它株系是对抗病毒治疗有耐受性(例如对奥塞米韦[32]和/或扎那米韦有耐受性)的毒株，包括耐药性大流行株系[33]。本发明组合物可包含一种或多种(如1、2、3、4或更多种)流感病毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，收获病毒并制备抗原后将它们混合在一起。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。通常为三价疫苗，其包含来自两种甲型流感病毒毒株和一种乙型流感病毒毒株的抗原。也可用四价疫苗[34]，其包含来自2种甲型流感病毒毒株和2种乙型流感病毒毒株、或者3种甲型流感病毒毒株和一种乙型流感病毒毒株的抗原。药物组合物如本发明所述制备的疫苗组合物是药学上可接受的。除抗原外，它们通常还包含其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。如下所述，也可包含佐齐[J。对这类组分的充分讨论参见参考文献35。疫苗组合物通常是水性形式。然而，一些疫苗可为干燥形式，如可注射固体或贴片上的干燥或聚合制品的形式。疫苗组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5yg/ml)含萊物质,如不含硫柳萊[26,36]。优选不含萊的疫苗,可包含琥拍酸α-生育酚以替代含汞化合物[26]。特别优选不含防腐剂的疫苗。为了控制张度，优选包含生理性盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其浓度可为
l-20mg/ml。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙
坐寸ο
疫苗组合物的渗透压通常为200m0sm/kg-400m0sm/kg,优选240-360m0sm/kg,更优选290-310m0sm/kg。虽然以前报道过渗透压对疫苗接种引起的疼痛无影响[37]，但优选将渗透压保持在此范围内。疫苗组合物可含有一种或多种缓冲剂。常用缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(具体是有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂一般是5-20mM。疫苗组合物的pH通常为5. 0-8. 1，更典型为6. 0-8. O,例如6. 5-7. 5，或者
7.0-7. 8。因此，本发明方法可包括在包装前调整散装疫苗pH的步骤。所述疫苗组合物优选无菌。所述疫苗组合物优选无热原，如每剂量含有< 1EU(内 毒素单位，标准量度)，优选每剂量< O. IEU0所述疫苗组合物优选不含谷蛋白。本发明疫苗组合物可包含去污剂，如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(称为‘吐温’)、辛苯聚醇(如辛苯聚醇_9(曲通X100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲铵(‘CTAB’ )或脱氧胆酸钠，特别适用于裂解疫苗或表面抗原疫苗。去污剂可仅以痕量存在。因此，疫苗中辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80各自的含量可以小于lmg/ml。其它痕量残留组分可以是抗生素(如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。疫苗组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即‘多剂量’药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，所述组合物可包含在装有无菌接头以取出物质的容器中。流感疫苗的给药剂量体积一般为约O. 5ml，但可将一半剂量(即约O. 25ml)给予儿里。组合物和药盒优选储存于2°C-8°C。其不应冷冻。理想地，其应避直射光保存。宿主细胞DNA由细胞系分离和/或培养病毒时，标准实践是最小化最终疫苗中残留的细胞系DNA含量，以最小化该DNA的致癌活性。因此，按照本发明制备的疫苗组合物优选含有每剂量低于IOng (优选低于lng，更优选低于IOOpg)残留的宿主细胞DNA，但可能存在痕量宿主细胞DNA。任何残留宿主细胞DNA的平均长度优选小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于IOObp等。在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法，如层析法等去除污染的DNA。可通过核酸酶处理，例如DNA酶处理来改进对残留宿主细胞DNA的清除效果。参考文献38和39公开了一种减少宿主细胞DNA污染的方便方法，该方法包括两步处理，先使用DNA酶(如Benzonase)处理(可以在病毒生长过程中使用)，然后使用阳离子去污剂(如CTAB)处理(可以在病毒颗粒破坏过程中使用)。也可利用烷化剂如丙内酯处理来去除宿主细胞DNA，其也可适合用于灭活病毒颗粒[40]。佐剂本发明组合物宜包含佐剂，其作用是增强在接受组合物的患者中引起的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。优选的佐剂包含水包油乳液。已知各种这类乳液，其通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中的油滴直径通常小于5 μ m,理想情况下具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。所述乳液可以包含如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的示例。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1，2_丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是种籽油中天然产生。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是可以用于本发明的几种鱼油的示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳六烯，其为本文特别优选。角鲨烯的饱
和类似物角鲨烷也是优选的油。包括角鲨烯和角鲨烷在内的鱼油，易于从商业来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。其他优选的油为α-生育酚(如下)。可以使用油的混合物。表面活性剂可以按其‘HLB’ (亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名D0WEAK 出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链Ε0/Ρ0嵌段共聚物；重复乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9 (曲通(Triton)X-IOO或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如特吉托 NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30);以及脱水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80 (聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85 (脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。优选的表面活性剂的含量(重量％ )为聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80) O. 01-1%,特别是约O. I %;辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通XlOO或曲通系列的其它去污剂)0. 001-0. 1%，特别是O. 005-0. 02%;聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0. 1-20%,优选O. 1-10%，特别是O. 1-1%或约O. 5%。所述疫苗含裂解病毒时，优选在水相中含有游离的表面活性剂。这是有益的，因为游离表面活性剂可在所述抗原上产生‘裂解效果’，因此破坏否则可能存在的任何未裂解病毒颗粒和/或病毒颗粒聚集体。这可改善裂解病毒疫苗的安全性[41]。乳液优选平均液滴大小为< Iym,例如< 750nm、< 500nm> ^ 400nm> ^ 300nm、≤250nm、；≤ 220nm≤ 200nm或更小。可通过某些技术如微流化等方便地获得这些液滴尺寸。本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于 鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5%角鲨烯、约O. 5%聚山梨酯80和约O. 5%司盘85。以重量计，这些比例为4. 3%鲨烯、O. 5%聚山梨酯80和O. 48%司盘85。这种佐剂称为‘MF59’ [42-44]，参考文献45的第10章和参考文献46的第12章更详细地描述了该佐剂。.MF59乳液宜包含朽1檬酸根离子,如IOmM朽1檬酸钠缓冲液。鲨烯、DL-α -生育酚和聚山梨酯80 (吐温80)的乳液。所述乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。其还可包含司盘85 (例如I %)和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10%角鲨烯、
2-10%生育酚和O. 3-3%吐温80，角鲨烯生育酚的重量比优选彡1，因为这可提供更稳定的乳液。角鲨烯和吐温80的体积比可以约为5 2，或者重量比约为11 5。可通过将吐温80溶解于PBS产生2%溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α -生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，随后使该混合物微流体化来制备一种这类乳液。得到的乳液可含有如平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。该乳液也可含有3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3d-MPL)。此种类型的另一有用乳液可包含(每人剂量)0. 5-10mg鲨烯、O. 5-llmg生育酚和O. l_4mg聚山梨酯80 [47]。 鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d_MPL (见下)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75 11 10(如750μ8/ml聚山梨酯80、110 μ g/ml曲通X-100和100 μ g/ml琥珀酸α -生育酚)，这些浓度应包括 抗原中这些组分的贡献。所述乳液还可包含鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401 ( “普流罗尼克(Plimmic) L121”)的乳液。所述乳液可用PH 7. 4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，且已与含苏氨酰基-MDP的“SAF-1”佐剂[48] (O. 05-1% Thr_MDP、5%鲨烯、2. 5%普流罗尼克L121和O. 2%聚山梨酸酯80) —起使用。也可不与Thr-MDP —起使用，例如用“AF”佐剂(5%鲨烯、I. 25%普流罗尼克L121和O. 2%聚山梨酸酯80)。优选微流体化。含有鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯
(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90%油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[50]。该乳液也可含有以下一种或多种物质糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。该乳液可包含TLR4激动剂[51]。这类乳液可冻干。鲨烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[52]。含佐剂疫苗中这些组分的终浓度(重量)是5%鲨烯、4%泊洛沙姆-105(普流罗尼克多元醇)和2%Abil-Care 85(双-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16 二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。含有O. 5-50%油、O. 1-10%磷脂和O. 05-5%非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献53所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如参考文献54所述)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N，N-双十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。 皂苷(例如QuilA或QS21)和固醇(例如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[55]。包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[56]。
包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[56]。在一些实施方式中，可在递送时临时将乳液与抗原混合，因此所述佐剂和抗原可单独地保存在包装或分销的疫苗中，以便在使用时配制成最终制剂。在其它实施方式中，在生产过程中将乳液与抗原混合，因此所述组合物以液体含佐剂形式包装。所述抗原通常是水性形式,从而最终通过混合两种液体制备疫苗。所述两种液体的混合体积比可变(例如5:1-1: 5)，但通常约为I : I。上述对具体乳液的说明给出组分浓度时，这些浓度通常用于非稀释组合物，因此与抗原溶液混合后浓度降低。包装疫苗组合物适用于本发明组合物(或药盒组分)的容器包括药瓶、注射器(如一次性注射器)、鼻喷雾等。这些容器应无菌。组合物/组分装在药瓶中时，药瓶优选由玻璃或塑料材料制成。在将组合物加入药瓶之前，优选对其进行灭菌。为了避免胶乳过敏患者可能产生的问题，药瓶优选用无胶乳塞子密封，且优选所有包装材料均不含胶乳。药瓶可包含单一剂量的疫苗，或者可以包含一个以上剂量Γ多剂量^药瓶)，如10个剂量。药瓶优选由无色玻璃制成。药瓶可以有适合的帽(如Luer锁)，以便将预填装注射器插入该帽，可以将注射器的内容物推入药瓶(如在其中重建冻干物质)，可以将药瓶的内容物吸回注射器中。从药瓶中拔出注射器后，可连上针头，将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子内侧，以便在封口或盖子打开后才能接触到该帽。药瓶，特别是多剂量药瓶可装有允许无菌地取出其内含物的瓶帽。某组分包装到注射器中时，该注射器可连有针头。如果未连接针头，可随注射器提供单独的针头以便组装和使用。这种针头可装在护罩中。优选安全性针头。一般是I-英寸23号、I-英寸25号和5/8-英寸25号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印上内含物的批号、流感季节和过期日期，以帮助记录保存。注射器的活塞优选带有防脱装置，以防止活塞在吸出时偶然脱出。注射器可以有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，所述顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则针头优选装有丁基橡胶护罩。优选的注射器是以商品名“ Tip-Lok” 销售的注射器。容器可标注有半剂量体积，以利于递送给儿童。例如，含有O. 5ml剂量的注射器可标有O. 25ml体积的标记。
采用玻璃容器(如注射器或药瓶)吋，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制成的容器。可将药盒或组合物与单页宣传品包装在一起(在同一个盒子中)，所述单页宣传品包括疫苗的详细情况如给药说明书、疫苗内所含抗原的详情等。说明书也可包含警告，(例如)准备好肾上腺素溶液以应对疫苗接种后发生过敏反应的情况等。治疗方法和所述疫苗给予本发明提供按本发明制备的疫苗。这些疫苗组合物适合给予人类或非人动物对象如猪，且本发明提供了引起对象免疫应答的方法，该方法包括将本发明组合物给予所述对象的步骤。本发明还提供用作药物的本发明组合物，并提供本发明组合物在生产引起对象免疫应答的药物中的应用。这些方法和应用引起的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。评价接种流感病毒疫苗后抗体应答、中和能力和保护水平的方法为本领域熟知。人类研究表明， 对人流感病毒血凝素的抗体效价与保护作用相关联(约30-40的血清样品血凝反应-抑制效价对同源病毒感染产生约50%保护作用)[57]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单径向免疫扩散(SRID)和/或单径向溶血(SRH)来測定抗体应答。本领域熟知这些測定技术。可以各种方式给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[58-60]、ロ服[61]、皮内[62，63]、经皮、透皮[64]等。可用按照本发明制备的疫苗治疗儿童和成年人。目前，推荐将流感疫苗用于年龄大于6个月的儿童和成年人免疫。因此，人类对象可以小于I岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受该疫苗的优选对象是老年人(例如> 50岁、> 60岁，优选> 65岁)、年轻人(如< 5岁)、住院对象、健康护理工作人员、军队服务人员和军人、妊娠妇女、慢性疾病对象、免疫缺陷对象、在接受该疫苗7天前接受过抗病毒化合物(如奥塞米韦或扎那米韦化合物；见下)的对象、对鸡蛋过敏的人和出国旅行者。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的人群。对于大流行株系，优选给予所有年龄的人。本发明优选组合物满足1、2或3个CPMP功效标准。在成年人(18_60岁)中，这些标准是⑴彡70%血清保护；⑵彡40%血清转化；和/或(3) GMT增加彡2. 5倍。在老年人(>60岁)中，这些标准是(I)彡60%血清保护；(2)彡30%血清转化；和/或(3)GMT增加彡2倍。这些标准基于至少50位患者的开放标记研究。可通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各剂量，例如采用胃肠道外初次免疫和粘膜加强免疫、粘膜初次免疫和胃肠道外加强免疫等。给予ー个以上剂量(一般是两个剂量)特别可用于免疫未曾免疫接触的患者，例如从未接受过流感疫苗的人，或者用于免疫接种新的HA亚型(如大流行爆发中的亚型)。一般以至少I周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时(在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或访问期间)给予患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的こ型流感嗜血杆菌疫苗、脊髄灰质炎病毒灭活疫苗、こ型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-Wl 35-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶联疫苗等同时给药。在老年患者中特别有用的是与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本同时给药。相似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，具体是对流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时给予患者(在对健康护理专业人员进行的同一用药咨询或访问期间)。这些抗病毒化合物包括神经氨酸酶抑制剂，如(3R，4R，5S)-4-こ酰基氨基-5-氨基-3(1-こ基丙氧基)-1_环己烯_1_羧酸或5-(こ酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2，6_脱水_3，4，5_三脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2_烯酮酸，包括它们的酷(如こ酷)和盐(如磷酸盐)。优选的抗病毒化合物是(3R，4R，5S) -4-こ酰基氨基-5-氨基-3 (I-こ基丙氧基)-I-环己烯-I-羧酸，こ酯和磷酸盐(I I)，也称为磷酸奥塞米韦(达菲(TAMIFLU) )。概述
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含” Y的组合物可能完全不含Y。与数值X相关的术语“约”是可选的并表示例如x±10%。除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的过程不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。在有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将合并物再与第三种组分混合等。将动物(特别是牛)材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源材料的情况下培养细胞。在将化合物作为组合物的一部分给予机体时，该化合物可另外由合适的前药替代。
图I :本发明的实施方式的示意图；MDCK 33016悬浮细胞(CDM中培养)接种在6孔盘A上(无血清培养基或DMEM+5%FBS) ；B :共转染MDCK33016 ；C :清洗2次，变为无血清DMEM、+胰蛋白酶(trypzean)、+/-新鲜的未感染MDCK细胞，D RG病毒图2 :使用PR8-A/CA骨架在MDCK 33016细胞中进行流感病毒拯救的效率；y轴显示感染效价(FFU/mL);空心框显示PR8-A/CA和5%血清的结果，斜纹框显示PR8-A/CA和无血清的结果；A表示加入新鲜的未感染细胞；B表示没有加入新鲜的未感染细胞。图3 :使用A/WSN/33骨架在MDCK 33016细胞中进行流感病毒拯救的效率；y轴显示感染效价(FFU/mL);空心框显示WSN和5%血清的结果，斜纹框显示WSN和无血清的结果；A表示加入新鲜的未感染细胞；B表示没有加入新鲜的未感染细胞。图4 :使用PR8-WSN骨架在MDCK 33016细胞中进行流感病毒拯救的效率；y轴显示FFU/mL ;空心框显示PR8-WSN和5%血清的結果，斜纹框显示PR8-WSN和无血清的结果；A表示加入新鲜的未感染细胞表示没有加入新鲜的未感染细胞。本发明实施方式病毒拯救
MDCK 33016细胞在CDM培养基中于37°C悬浮培养。转染一天前将6xl05细胞/孔接种到CELL-BIND 6孔盘的含5% FCS的2mL DMEM培养基中。平行实验中在无FCS下接种所述细胞。所述细胞37°C孵育过夜。第二天按照生产商实验方案用Lipofectamine LTX Plus转染试剂转染该接种细胞。简单的说，Iug 各质粒(PA、PB1、PB2、NP、NS、M、HA、NA 和(plus) TMPRSS2)在 500 μ I无血清DMEM培养基中稀释。向稀释的DNA中直接加入10 μ I Plus试剂。室温孵育所述混合物5分钟，然后向其中加入25 μ ILipofectamine0然后该混合物于室温孵育30分钟。孵育后，转染试剂=DNA复合物逐滴加入所述细胞。随后37°C孵育该细胞24小吋。孵育后，从所述细胞中抽吸培养基并在每孔中加入含I : 2000胰蛋白酶(Trypzean) 稀释液(lmg/mL储存液)的无血清DMEM培养基中的4xl05MDCK 33016细胞悬液。平行实验中，所述感染细胞中仅加入I : 2000胰蛋白酶(Trypzean) 稀释液(lmg/mL储存液)，即不添加细胞。然后所述细胞于37°C再孵育48小时或直到所述细胞裂解，之后用集落形成试验(Focus-Forming Assay)确定病毒效价。 集落形成试验未感染的MDCK细胞以6. 25xl04细胞/孔的密度接种入含500 μ I加有10% FCS的DMEM的48孔板中。第二天用病毒在100-150 μ I体积中37°C感染细胞2小吋。所述细胞用所述病毒的各种稀释液感染。感染2小时后吸弃培养基并每孔加入含10% FCS的500 μ IDMEM。细胞37°C孵育到第二天。感染24小时后，吸弃培养基并用PBS清洗所述细胞一次。每孔加入500 μ I冰冷的溶于PBS的80%丙酮然后4°C孵育30分钟。吸弃丙酮混合物并用PBST(PBS+0. 1%吐温)清洗所述细胞一次。每孔加入500 μ I溶于PBS的2% BSA然后室温(RT)孵育30分钟。将500 μ I I 6000稀释的抗NP加入封闭缓冲液然后室温孵育2小吋。吸弃抗体溶液并用PBST清洗所述细胞两次。ニ抗(山羊抗小鼠)以I : 2000稀释在500 μ I封闭缓冲液中，并将所述板RT孵育2小吋。吸弃抗体溶液并用PBST清洗所述细胞三次。每孔加入500 μ IKPL True Blue并孵育10分钟。通过吸弃True-Blue停止反应并用dH20清洗一次。吸弃水并晾干所述细胞。结果3种不同病毒骨架的集落形成试验结果示于图2-4。结果显示感染后24小时添加和不添加细胞的病毒拯救效率。可以看出在所有情况下，转染后24小时添加细胞的实验中病毒拯救的效率比不添加细胞的实验增加了最多3倍。这种效率増加可在含血清和无血清条件下所有检测的病毒骨架中观察到。应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和精神内。參考文献[I] Racaniello 和 Baltimore (1981) Science 214:916-919[2]Kaplan 等(1985)Proc Natl Acad Sci USA 82 :8424-8428[3]Fodor 等(1999) J. Virol 73(11) :9679-9682[4]Hoffmann 等(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99 :11411-11416[5]Kobayashi ^ (2007)Cell Host Microbe 19 ；1(2) :147-57
[6]W02009/000891[7] Sambrook 等 Molecular Cloning A Laboratory Manual (《分子克隆实验室手册》)，第2版，1989，冷泉港出版社，纽约冷泉港[8]Kistner 等(1998)Vaccine 16 :960-8.[9]Kistner 等(1999)Dev Biol St 和 98 :101-110.[10]Bruhl 等(2000) Vaccine 19:1149-58.[ll]Pau 等(2001) Vaccine 19:2716-21.
[12]http:// www. atcc. org/[13]http://locus, umdnj. edu/[14]W097/37000.[15]Brands ^ (1999) Dev Biol Stand 98:93-100.[16]Halperin 等(2002) Vaccine 20:1240-7.[17]EP-A-1260581(WOO1/64846)[18]W02006/071563[19]W02005/113758[20]W097/37001[21]Neumann 等(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102:16825-9[22]W002/28422.[23]W002/067983.[24]W002/074336.[25]W001/21151.[26]W002/097072.[27]W02005/113756.[28] Vaccines (《疫苗》)(Plotkins 和 Orenstein 编)·第 4 版，2004, ISBN 0-7216-9688-0[29]Huckriede 等(2003)Methods Enzymol 373 :74-91.[30]Treanor ^ (1996) J Infect Dis 173:1467-70.[31]Keitel 等(1996)Clin Diagn Lab Tmmunol 3:507-10.[32]Herlocher 等(2004)J Infect Dis 190(9) :1627-30.[33] Le 等(2005) Nature 437(7062) :1108.[34]W02008/068631.[35]Gennaro(2000)Remington The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿药物科学和实践》)·第20版，ISBN =0683306472.[36]Banzhoff(2000)Immunology Letters 71 :91-96.[37]Nony 等(2001) Vaccine 27:3645-51.[38]EP B 0870508.[39]US 5948410.[40]W02007/052163.[41]W02007/052061
[42]W090/14837.[43] Podda 和 Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203.[44]Podda(2001)Vaccine 19 :2673-2680.[45] Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach (《疫苗设计亚基和佐剂方法〉〉)(Powell和Newman编)普莱努出版社(Plenum Press) 1995 (ISBN0-306-44867-X).[46] Vaccine Adjuvants !Preparation Methods and Research Protocols (《疫苗佐剂制备方法和研究方案》)(分子药物方法丛书的第42卷)ISBN :1-59259-083-7.O，Hagan 编.[47]W02008/043774.[48] Allison 和 Byars (1992) Res Tmmunol 143:519-25.[49]Hariharan 等(1995) Cancer Res 55:3486-9.[50] US 2007/014805.[51]US-2007/0191314.[52]Suli ^ (2004)Vaccine 22(25-26) :3464-9.[53]W095/11700.[54]美国专利 6，080，725.[55]W02005/097181.[56]W02006/113373.[57]Potter 和 Oxford(1979)Br Med Bull 35 :69-75.[58]Greenbaum 等(2004)Vaccine 22 :2566-77.[59] Zurbriggen 等(2003) Expert Rev Vaccines 2:295-304.[60]Piascik(2003)J Am Pharm Assoc (Wash DC) · 43 :728-30.[61]Mann 等(2004) Vaccine 22:2425-9.
[62]Halperin ^ (1979)Am J Public Health 69 :1247-50.[63]Herbert ^ (1979)J Infect Dis 140 :234-8.[64]Chen 等(2003) Vaccine 21 :2830-6.
权利要求
1.一种制备病毒的方法，所述方法包括步骤α)用至少一种编码病毒RNA分子的表达构建体转染宿主细胞培养物；(ii)向(i)的转染宿主细胞中添加细胞以提供细胞混合物；和(iii)培养该细胞混合物产生病毒。
2.一种制备用于生产疫苗的病毒的方法，所述方法包括步骤(i)用至少一种编码病毒RNA分子的表达构建体转染宿主细胞培养物；(ii)向(i)的转染宿主细胞中添加细胞以提供细胞混合物；(iii)培养该细胞混合物产生病毒；和(iv)纯化步骤(iii)中获得的病毒。
3.如权利要求2所述的方法，所述方法还包括将步骤(iii)中纯化的病毒配制为疫苗的步骤。
4.如上述权利要求任一项所述的方法，其特征在于 ，所述宿主细胞是VERO、PER.C6或MDCK细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述MDCK细胞为细胞系MDCK33016 (DSMACC2219)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,所述细胞悬浮培养。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞贴壁培养。
8.如以上权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒为分段病毒。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒为负义链RNA病毒。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述病毒为流感病毒。
11.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒为双链RNA病毒。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述病毒为轮状病毒。
13.如权利要求1-9或11中任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒为非分段病毒。
全文摘要
提供通过反向遗传拯救病毒的方法，其中细胞在转染后添加。
文档编号C12N7/02GK102741399SQ201080047944
公开日2012年10月17日 申请日期2010年10月20日 优先权日2009年10月20日
发明者B·艾纳, J·乌伦多夫, M·弗兰蒂, M·马特洛索维基, P·苏帕菲帕特, P·道米策, P·马森 申请人:诺华有限公司