专利名称：毒力减弱的nsp4突变基因、重组质粒与重组牛轮状病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及毒力减弱的NSP4突变基因、重组质粒与重组牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV),及其构建方法,尤其是涉及ー种利用反向遗传技术(Reverse Genetics Technology)获得牛轮状病毒减毒株的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
牛轮状病毒(BRV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是非细菌性腹泻的主要病原之一。其主要感染I 7日龄的犊牛，具有流行广、发病率高、危害大等特点，现已成为ー种世界性疾病。BRV感染后易引起犊牛消化道机能紊乱，可继发细菌性腹泻，进而加重病情，造成犊牛死亡率提高和康复犊牛生产性能下降，严重阻碍养牛业的持续健康发展，给养牛业造成巨大的经济损失。
轮状病毒的基因组为双股RNA，分为11个节段，基因组的节段性赋予了该病毒的高变异率，带来了众多的血清型。据研究发现在全球范围内主要的流行毒株为G6血清型， 大约占55. 7%,GlO血清型次之。而轮状病毒(Rotavirus，RV)主要通过消化道感染，抵抗其感染的主要途径是肠道粘膜免疫。通过ロ服或经肠道免疫RV减毒疫苗，是阻止RV对肠道粘膜上皮细胞感染的最有效方法。早在1973年美国农业部就批准了第一支新生犊牛轮状病毒ロ服减毒疫苗，随后国外有不同的疫苗问世。到目前为止，国内还没有安全有效的牛轮状病毒减毒疫苗投放市场。尽管现有国外疫苗还存在ー些不足之处，但为BRV的防控做出了重要贡献。已有减毒疫苗是通过传代致弱、基因重配或筛选自然弱毒等传统方式获得的， 传统的方法筛选毒力致弱毒株耗时、费力、成功率低，而利用反向遗传技术拯救毒力位点变异的重组病毒，将为减毒毒株的获得提供快捷途径。
反向遗传技术是指在已知基因序列的基础上，利用现代生物理论与技术，通过改变基因序列创造突变体并研究突变所造成的表型效应的相关技术。其中，在病毒cDNA分子水平上对其进行体外人工操作，如进行基因点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造， 获得病毒的感染性分子克隆这一研究策略被称为“病毒拯救”技术，其为更精细地研究病毒基因功能及研制疫苗毒种提供了技术支撑。利用反向遗传技术，科学家们已成功地拯救了流感病毒、狂犬病病毒等RNA病毒。
自上个世纪九十年代以来，学者们一直致カ于建立轮状病毒(RV)的反向遗传操作系统，但由于轮状病毒(RV)为11节段的双链RNA病毒，体外合成11个片段并将其包装成完整病毒粒子非常困难，这ー技术瓶颈制约了该技术的应用。直至2006年，Satoshi Komoto 等尝试将体外合成的VP4基因正链RNA导入细胞，在辅助病毒作用下产生新的VP4基因突变(中和抗体识别位点变异)的重组RV，利用针对野生型的VP4中和抗体抑制辅助病毒复制的功能，富集并成功获得VP4基因变异的病毒。这是目前为止报道的轮状病毒反向遗传研究的唯一成功例子，但是由于受VP4中和抗体识别位点的限制，该技术体系不适用于拯救 VP4其它位点变异及病毒其它基因变异的病毒。
研究表明，RV编码的非结构蛋白NSP4(nonstructural protein 4, NSP4)是一种肠毒素，对病毒的复制和毒力非常重要(Ball等，1996)，在轮状病毒的致病中发挥重要作用。它是目前唯一能引起Ca2+转运的已知RV蛋白，通过调控胞内Ca2+浓度，最终导致腹泻 (Ruiz等，2000 ;MOTi Y等，2002)。体外合成的NSP4蛋白及其短肽可引起动物腹泻，临床症状与完整RV强毒相似，但持续时间较短(Zhang等，2000)。人轮状病毒NSP4 毒力位点有不同的报道，例如，55-72位氨基酸区可能是毒素功能的关键区(Ewton等，2001)，82-169位的不同氨基酸变异后对NSP4的毒力影响很大(Zhang等1998 ;Pager等，2000)。目前，被普遍接受的人的RV NSP4毒力位点主要是114-135位氨基酸残基。如何通过改变NSP4基因的毒力位点来获得致弱毒株是目前研究的热点问题之一。
NSP4蛋白属于非结构蛋白，不能通过中和抗体方法富集变异的病毒。本研究利用 RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)解决了 NSP4毒力位点变异的BRV的筛选和富集的问题。RNA干扰是指双链RNA引发的转录后基因沉默机制，它通过2f23bp的双链RNA或发夹状RNA与特异性mRNA的結合导致靶基因的降解，进而导致目的产物表达的下调。
本研究通过构建毒力位点变异的NSP4突变基因的转录质粒，在辅助病毒的帮助下，結合反向遗传技术拯救变异病毒；利用可阻断辅助病毒増殖的RNAi，富集并筛选重组突变病毒；动物实验检测结果表明，我们在国内外首次利用反向遗传技术获得毒力减弱的 BRV病韋株。
参考文献
[I]Parr RDj Storey SM，Mitchell DM,et al. The rotavirus enterotoxin NSP4directly interacts with the caveoIarstructural protein caveolin-1[J]. J Virol,2006;80(6):2842-2854.
[2]Satoshi Komoto, Jun Sasaki, Koki Taniguchi. Reverse genetic system for introduction of site—specificmutations into the double-stranded RNA genome of infectious rotavirus[J]. PNASj 2006;103 (12) :4646-4651.
[3]Roner MR, N. I. , Sherry B，Joklik WK. , Construction and characterization of a reovirus doubletemperature — sensitive mutant. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，1997，94: p. 6826-6830.
[4]Berkova Z. , Crawford S. E. , Crawford, Blutt S. E. , et. al. Expression of Rotavirus NSP4Alters the ActinNetwork Organization through the Actin Remodeling Protein Cofilin[J]. . Journal ofvirology, 2007;81 (7):3545 - 3553.
[5]Ball JMj Tian P，Zeng CQj Morris AP，Estes MK. Age-dependent diarrhea induced by a rotaviralnonstructural glycoprotein[J]. Science，1996;272:101-104.
[6] Troup in，C. a, Dehee, A. ab, Schnur iger, A. ab，Vende，P. c，Ponce t，D. c,Garbarg-Chenonj A. Rearranged genomicRNA segments offer a new approach to the reverse genetics of rotaviruses. JOURNAL OF VIROLOGY, July2010:6711 - 6719
[7] Pager CTj Aleander J，Steele ADj et al. Soouth African G4P [6] asymptomatic and symptomatic aneonatal rotavirus strains differ in theirNSP4, VP8, andVP7gene[J]. J MedVirolj2000, 62(20) :208-216.
[8] Gadlage MJj Sparks JSj Beachboard DC, Cox RGj Doyle JDj Stobart CC，Denison MR.Murine hepatitisvirus nonstructural protein 4regulatesvirus-induced membrane modifications and replication complexfunction. J Virol.2010 Jan;84(I):280-90.
[9]Zhang M, Zeng C Q Y, Dong Y, et al. Mutations in rotavirus nonst ructural glycoprotein NSP4 areassociated wit h altered virus virulence[J]. J Virol,1998，72:3666-3672.发明内容
针对上述现有技木，本发明的目的是提供ー种利用反向遗传技术获得牛轮状病毒减毒病毒株的方法，同时，也提供了毒力减弱的NSP4突变基因、重组质粒。
本发明是通过以下技术方案实现的
一种毒カ减弱的NSP4突变基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。
ー种包含毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒，是由毒力减弱的NSP4突变基因与空白质粒PEASY-T3连接构成的，所述毒カ减弱的NSP4突变基因的核苷酸序列如序列表中 SEQ IDN0. 2 所示。
所述的重组质粒的构建方法，步骤如下
(I)以常规方法构建的pEASY-T3-NSP4重组质粒为模板，分别在引物RNAi_Pl、 RNA1-P2和RNAi-P3、RNAi_P4的引导下，进行PCR扩增，扩增结束后于回收所有的PCR产物，然后将二者等量(摩尔数比为I :1)混合并作为新ー轮PCR的模板，在引物RNAi-Pl和 RNA1-P4的引导下，做重叠PCR扩增，扩增结束后，回收所有PCR产物，与pEASY_T3空载体连接，获得了重组质粒AABY-I ；
所述引物RNAi-Pl、RNAi-P2、RNAi_P3和RNAi_P4的核苷酸序列如下
RNAi-Pl GGCTTTTAAAAGTTCTGTTCCGAG ；
RNAi-P2 GTGTGTAAAGTACTATCCATTAGAGTGATTACACTCGATG ；
RNAi-P3 GATAGTACTTTACACACGATACTCGAGGATCCAGG ；
RNAi-P4 GGTCACATTAAGACCGTTCCTTCCA ;如 SEQ ID NO. 3、4、5、6 所示；
(2)以重组质粒AABY-1 为模板，分别在引物AABY-PI、AABY-P2和AABY-P3、AABY-P4 的引导下，进行PCR扩增，扩增结束后回收所有的PCR产物，然后将二者等量(摩尔数比为 1:1)混合并作为新ー轮PCR的模板，在引物AABY-Pl和AABY-P4的引导下，做重叠PCR，扩增结束后，回收所有PCR产物，与pEASY-T3空载体连接，即得到了包含毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒AABY ;该重组质粒为由17启动子驱动的NSP4毒力位点及NSP4_shRNA 识别位点双重变异的转录质粒AABY，其中，NSP4-shRNA识别位点的变异区为93-104，由 AACAGCACATTG变为GATAGTACTTTA ;而毒力位点的变异区位于444-455，由ATGATACGAGCA变为 TTAACACGCCCA ；
所述引物AABY-PI、AABY-P2、AABY-P3和AABY-P4的核苷酸序列如下
AABY-Pl GGCTTTTAAAAGTTCTGTTCCGAG ；
AABY-P2 CTACTGGGCGTGTTAACAATTTATCG ；
AABY-P3 GTTAACACGCCCAGTAGACGAAATA ；
AABY-P4 CACATTAAGACCGTTCCTTCCA ;如 SEQ ID NO. 7、8、9、10 所示。
具体步骤如下
(I)以 pEASY-T3-NSP4 重组质粒为模板，分别在引物 RNAi-Pl、RNAi_P2、RNAi_P3 和 RNAi-P4 的引导下，进行 PCR 扩增，反应条件为94°C 5min ;94°C 30s 65°C 30s 72°C lmin, 30个循环；72°C 8min ;反应结束后于1% (质量/体积百分比，単位g :ml，下同)琼脂糖凝胶上回收所有的PCR产物，作为下一次PCR反应的模板，在引物RNAi-PI和RNAi-P4的引导下， 做重叠 PCR，反应条件为94°C 5min ；94°C 30s 55°C 30s 72°C lmin，30 个循环；72°C 8min, PCR产物于1%琼脂糖凝胶上回收，与pEASY-T3空载体连接，获得了重组质粒AABY-I ；
(2)以重组质粒 AABY-I 为模板，分别在引物 AABY-Pl、AABY-P2 和 AABY_P3、AABY_P4 的引导下，进行PCR扩增，反应条件为94°C 5min ；94°C 30s 60°C 30s 72°C lmin，30个循环；72°C8min ;反应结束后于1%琼脂糖凝胶上回收所有的PCR产物，作为下一次PCR反应的模板，在引物AABY-Pl和AABY-P4的引导下，做重叠PCR，反应条件为94°C 5min ；94°C 30s 57 °C 30s 72 °C lmin，30个循环；72°C 8min，PCR产物于1%琼脂糖凝胶上回收，与pEASY_T3 空载体连接，即得到了包含毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒AABY。
一种毒カ减弱的重组牛轮状病毒，是通过以下方法得到的将上述的重组质粒 AABY与常规方法构建的pcDNA3. 1-T7RNAP重组质粒共转染恒河猴肾细胞MA104后，接种辅助病毒(野生型病毒)，利用反向遗传技术拯救变异病毒，再通过RNAi技术富集和筛选得到。
所述毒カ减弱的重组牛轮状病毒的构建方法，步骤如下将上述的重组质粒AABY 与pcDNA3. 1-T7RNAP重组质粒共转染恒河猴肾细胞MA104，然后接种野生型牛轮状病毒，利用反向遗传技术拯救变异病毒，再通过RNAi技术富集和筛选，即得毒力减弱的重组牛轮状病毒。
所述的构建方法，具体步骤为
(I)将长满单层的MA104细胞用0.25% (质量/体积百分比，単位g :ml，下同)胰蛋白酶消化，传至60mm的平皿中，置37°C，5% CO2培养箱培养，待细胞融合度达到90%吋， 用于转染；
(2)用Opti-MEM洗I次细胞，在脂质体Lipofectamine 2000的介导下，将构建好的重组质粒AABY与pcDNA3. 1-T7RNAP重组质粒共转染MA104细胞，其中，质粒DNA与脂质体LipOfectamineTM2000的质量比为I :3，转染5h后换正常细胞培养液，转染24h后接种野生型牛轮状病毒，48h后收集混合病毒，利用RNAi技术富集和筛选毒力减弱的重组牛轮状病毒。
所述利用RNAi技术富集和筛选毒力减弱的重组牛轮状病毒，方法为将所收获的混合病毒以10 u g/mL浓度的胰酶37°C预处理60min，接种长满单层的NSP4_shRNA细胞，吸附Ih后，于未含犊牛血清且胰酶浓度为I y g/mL浓度的DMEM营养液中37°C培养48 76h， 收集出现细胞病变的病毒培养液，反复冻融3次后，再次接种长满单层的NSP4-shRNA细胞， 如此连续筛选数代后，最终获得稳定的NSP4基因变异的病毒BRV-AABY，即为毒力减弱的重组牛轮状病毒。
所述NSP4_shRNA细胞是通过以下方法得到的
(I)针对NSP4基因的shRNA重组慢病毒质粒的构建
将人工设计并化学合成的NSP4-shRNA_l和NSP4_shRNA_2分别退火后，与慢病毒 Hl载体经XbaI和AgeI双酶切后回收的12. 5kb片段以及经SmaI和AgeI双酶切所获得的 I. 5kb片段按照如下体系12. 5kb载体片段，IOOng ；1. 5kb载体片段，50ng ；shRNA oligo,50ng ；T4DNA 连接酶，0. 5 u L ；10XT4DNA 连接酶 buffr，2 u L,补足 H2O 使体系至 20 u L, 16°C 过夜连接；转化大肠杆菌DH5 a株感受态细胞，挑选克隆，提取质粒DNA，经PCR鉴定并经测序确认获得了相应的shRNA重组Hl载体，用于后续试验。
所述NSP4-shRNA_l 和 NSP4_shRNA_2 的序列如下
NSP4-shRNA-l
TGAACAGCACATTGCACAC TTCAAGAGAG7'G7'G'( 'AATGTGCTGTn 'A TTTTTTGT ；
NSP4-shRNA-2
丨ctag|acaaaaaatgaacagcacattgcacac tctcttgaagtgtgcaatgtgctgt/( 4 如 SEQ ID NO. 11、12 所示。
L0053」PCR鉴定阳性重组质粒的方法是以小提质粒为模板，以已知重组阳性质粒及空载体为对照，在引物LT-PI和引物LT-P2的引导下，进行PCR扩增反应，反应条件为94°C 30s ; 94°C 20s 57°C 20s 68°C 30s，35个循环；68°C 3min，反应结束后对PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳检测，重组shRNA的质粒PCR扩增结果为300bp片段，空载体的扩增结果为250bp 片段。
所述引物LT-Pl 的序列为5’ -TGTCGCTATGTGITCTGGGA-3’ ；
所述引物LT-P2 的序列为5’-GGTACAGTGCAGGGGAAAGA-3’JBSEQ ID NO. 15、16所/Jn o
(2) shRNA稳定细胞系的建立
将长满单层的MA104细胞用0. 25%胰蛋白酶消化，传至60mm的平皿中，置37°C， 5% CO2培养箱培养，待细胞融合度达到90%时用于转染。用Opti-MEM洗I次细胞，在脂质体Lipofectamine 2000的介导下，将构建好的NSP4_shRNA重组质粒(8ug)转染MA104细胞(DNA :脂质体2000=1 :3)，待细胞生长至单层后，用0. 25%胰蛋白酶消化传代，连续传代5 次后利用报告基因GFP、通过流式细胞分选仪进行筛分，将筛选的阳性细胞进行扩增，待细胞长至单层后，用0. 25%胰蛋白酶消化传代I次，液氮保存(冻存液成分为80%DMEM，10%新生牛血清和10%DMS0)，获得稳定细胞系NSP4-shRNA。
得到毒カ减弱的重组牛轮状病毒后，通过PCR产物测序方法鉴定所拯救的NSP4基因变异的病毒，其中，PCR检测使用的引物为
Pl :5’ -GTAATCACTCTAATGGATAGTACTTTA-3’ ；
P2 :5，-CCATTCTTCTAGTGTTCTAACATC-3，；如 SEQ ID NO. 17、18 所示。
本发明的牛轮状病毒减毒病毒株，构建原理是根据牛轮状病毒NSP4基因序列， 设计并构建毒カ减弱NSP4突变基因的转录质粒(毒力位点及已知RNAi位点双重变异)，与 pcDNA3. 1-T7RNAP重组质粒共转染恒河猴肾细胞MA104后，接种辅助病毒(野生型病毒)，利用反向遗传技术拯救变异病毒，通过可抑制辅助病毒増殖的RNAi稳定细胞系进行富集并筛选阳性重组NSP4基因变异病毒；利用乳鼠感染实验检测所拯救病毒毒カ变化，实验结果表明，获得了毒カ减弱的BRV病毒株。
本发明的毒力减弱的NSP4突变基因，与野生型的NSP4基因(如序列表中SEQ ID NO. I所示)比较，其编码基因包含两处变异，分别为142-153和493-502nt，见序列表中SEQ ID NO. 2 所示。
本发明所设计的可特异性沉默野生型NSP4基因的shRNA所识别序列为TGAACAGCACATTGCACAC,如SEQ ID NO. 19所示，合成shRNA序列并构建可特异沉默NSP4基因的重组慢病毒表达载体RNAi-I。将RNAi-I转染MA104细胞，建立可稳定表达沉默NSP4 基因RNAi的细胞系NSP4-shRNA。利用NSP4_shRNA稳定细胞系对所拯救的混合病毒进行传代培养，经过数代筛选并富集，通过RT-PCR产物测序方式确认，最终获得了 NSP4基因变异的病毒。
乳鼠感染实验检测结果表明，我们在国内外首次利用反向遗传技术获得毒カ减弱的BRV病毒株。与传统获得减毒株方法比较，本发明利用反向遗传技术并结合RNA干涉方法，成功获得毒力减弱的牛轮状病毒，为BRV减毒疫苗侯选株的获得提供了快捷途径。
图I为反向遗传技术获得毒力位点变异的牛轮状病毒的技术路线图。
图2 为 Lenti-virus Hl 载体酶切结果，其中，M:DL marker 15,000 ；I SmaI 和 AgeI双酶切Hl载体；2 =XbaI和AgeI双酶切Hl载体。
图3为shRNA重组Hl质粒的PCR鉴定结果，其中，M:DL marker 500 ；1 :空载体阴性对照；2 :阳性对照；3 LacZ-shRNA ；4 :NSP4_shRNA。
图4 为 shRNA 稳定细胞系的建立，其中 A :LacZ_shRNA ；B :NSP4_shRNA。
图5为shRNA抑制野生型牛轮状病毒所产生的细胞病变結果，A :NSP4_shRNA细胞；B LacZ-shRNA 细胞。
图6为shRNA抑制野生型牛轮状病毒增殖滴度的测定結果，A :NSP4_shRNA ；B LacZ-shRNA。
图7为变异病毒与野生型病毒的NSP4基因ORF的核酸比对結果，与野生型病毒BRV (NSP4)比较，变异病毒(AABY)的NSP4基因毒力位点(444-455)和RNAi识别位点 (93-104)均发生了预期变异。
图8为变异病毒与野生型病毒的NSP4基因的氨基酸比对結果，与野生型病毒BRV (NSP4)比较，变异病毒(AABY)的NSP4基因毒力位点处发生了如下变异，即M135L、I136T及 A138P。
图9为接种BRV后乳鼠是否发生腹泻及其腹泻程度的判断标准，其中，A :黄色水样便:肛周粪便污染；C :黄色软大便；D :未见大便。
图10为接种病毒后不同实验组发生腹泻乳鼠的比例的比较結果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进ー步的说明，但不用来限制本发明的保护范围。
下述实施例中无特别说明均为常规方法，所用试剂及药品如无特别说明均为常规试剂。
利用反向遗传技术获得毒力位点变异的牛轮状病毒的技术路线，见图I。
实施例I :利用反向遗传技术拯救NSP4基因毒力位点变异的牛轮状病毒
lNSP4-shRNA识别位点变异的重组质粒的构建
本实验室已分离获得ー株牛轮状病毒G6，并将经鉴定的NSP4基因序列投递至GenBanK中，其编码序列(FJ972713. I)见SEQ ID NO. 1，该株牛轮状病毒G6为常规的野生型牛轮状病毒。參照其序列，应用Applied Biosystems公司提供的siRNA设计软件,确定了 RNAi 的靶基因序列为 5’-TGAACAGCACAITGCACAC-3’(如 SEQ ID NO. 20 所示)，其在 NSP4 基因上的识别位点为91-109区。以常规方法构建的PEASY-T3-NSP4重组质粒为模板，分别在引物RNAi-Pl、RNA1-P2和RNAi_P3、RNAi_P4 (见表I)的引导下，PCR扩增，反应条件如下94°C 5min ；94°C 30s 65°C 30s 72°C lmin, 30 个循环；72°C 8min。反应结束后于 1% 琼脂糖凝胶上回收所有的PCR产物，作为下一次PCR反应的模板，在引物RNAi-Pl和RNAi-P4 的引导下，做重叠PCR，反应条件如下94°C 5min ；94°C 30s 55°C 30s 72°C lmin，30个循环； 72°C 8min, PCR产物于1%琼脂糖凝胶上回收，回收PCR产物与pEASY_T3空载体连接，获得了靶基因序列变异的重组质粒AABY-I。
表I构建NSP4_shRNA识别序列变异重组质粒的引物序列名称序列(5’-3’)
权利要求
1.一种毒力减弱的NSP4突变基因，其特征在于其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO. 2所示。
2.一种包含毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒，其特征在于是由毒力减弱的NSP4突变基因与空白质粒PEASY-T3连接构成的，所述毒力减弱的NSP4突变基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。
3.权利要求2所述的重组质粒的构建方法，其特征在于步骤如下 (1)以常规方法构建的PEASY-T3-NSP4重组质粒为模板，分别在引物RNAi-Pl、RNAi_P2和RNAi-P3、RNAi-P4的引导下，进行PCR扩增，扩增结束后，分别回收对应的PCR产物；然后将二者等量混合并作为新一轮PCR的模板，在引物RNAi-Pl和RNAi-P4的引导下，做重叠PCR扩增，扩增结束后，回收PCR产物，与pEASY-T3空载体连接，获得了重组质粒AABY-I ； 所述引物RNAi-Pl、RNAi-P2、RNAi_P3和RNAi_P4的核苷酸序列如下RNAi-Pl GGCTTTTAAAAGTTCTGTTCCGAG ；RNAi-P2 GTGTGTAAAGTACTATCCATTAGAGTGATTACACTCGATG ；RNAi-P3 GATAGTACTTTACACACGATACTCGAGGATCCAGG ；RNAi-P4 GGTCACATTAAGACCGTTCCTTCCA ;如 SEQ ID NO. 3、4、5、6 所示； (2)以重组质粒AABY-I为模板，分别在引物AABY-Pl、AABY-P2和AABY_P3、AABY_P4的引导下，进行PCR扩增，分别回收对应的PCR产物；然后将二者等量混合并作为新一轮PCR的模板，在引物AABY-Pl和AABY-P4的引导下，做重叠PCR，扩增结束后，回收PCR产物，与PEASY-T3空载体连接，即得到了包含毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒AABY ； 所述引物AABY-Pl、AABY-P2及AABY-P3、AABY-P4的核苷酸序列如下AABY-P I GGCTTTTAAAAGTTCTGTTCCGAG ；AABY-P2 CTACTGGGCGTGTTAACAATTTATCG ；AABY-P3 GTTAACACGCCCAGTAGACGAAATA ；AABY-P4 CACATTAAGACCGTTCCTTCCA ;如 SEQ ID NO. 7、8、9、10 所示。
4.根据权利要求3所述的重组质粒的构建方法，其特征在于具体步骤如下 (1)以pEASY-T3-NSP4重组质粒为模板，分别在引物RNAi-Pl、RNAi_P2及RNAi_P3和RNAi-P4 的引导下，进行 PCR 扩增，反应条件为94°C 5min ；94°C 30s 65°C 30s 72°C lmin,30个循环；72°C 8min ;反应结束后于1%琼脂糖凝胶上电泳并回收PCR产物，作为下一次PCR反应的模板，在引物RNAi-Pl和RNAi-P4的引导下，做重叠PCR，反应条件为94°C 5min ；94°C 30s 55°C 30s 72°C lmin, 30个循环；72°C 8min，反应产物于1%琼脂糖凝胶上电泳并回收PCR产物，与pEASY-T3空载体连接，获得了重组质粒AABY-I ； (2)以重组质粒AABY-I为模板，分别在引物AABY-Pl、AABY-P2和AABY_P3、AABY_P4的引导下，进行PCR扩增，反应条件为94°C 5min ；94°C 30s 60°C 30s 72°C lmin，30个循环；72°C 8min ;反应结束后于1%琼脂糖凝胶上电泳并回收PCR产物，作为下一次PCR反应的模板，在引物AABY-Pl和AABY-P4的引导下，做重叠PCR，反应条件为94°C 5min ；94°C 30s57°C 30s 72°C lmin, 30个循环；72°C 8min, PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳并被回收，与PEASY-T3空载体连接，即得到了包含毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒AABY。
5.一种毒力减弱的重组牛轮状病毒，其特征在于是通过以下方法得到的将权利要求3所述的重组质粒与常规方法构建的pcDNA3. 1-T7RNAP重组质粒共转染恒河猴肾细胞MA104后，接种野生型牛轮状病毒，利用反向遗传技术拯救变异病毒，再通过RNAi技术富集和筛选得到。
6.权利要求5所述的毒力减弱的重组牛轮状病毒的构建方法，其特征在于步骤如下将权利要求3所述的重组质粒与pcDNA3. 1-T7RNAP重组质粒共转染恒河猴肾细胞MA104，然后接种野生型牛轮状病毒，利用反向遗传技术拯救变异病毒，再通过RNAi技术富集和筛选得到毒力减弱的重组牛轮状病毒。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于具体步骤为 (1)将长满单层的MA104细胞用O.25%胰蛋白酶消化，传至60mm的平皿中，置37°C，.5% C02培养箱培养，待细胞融合度达到90%时，用于转染； (2)用Opti-MEM洗I次细胞，在脂质体Lipofectamine 2000的介导下，将构建好的重组质粒AABY与pcDNA3. 1-T7RNAP重组质粒共转染MA104细胞，其中，质粒DNA与脂质体Lipofectamine 2000的质量比为I :3，转染5h后换正常细胞培养液，转染24h后接种野生型牛轮状病毒，48h后收集混合病毒，利用RNAi技术富集和筛选毒力减弱的重组牛轮状病毒。
8.根据权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于所述利用RNAi技术富集和筛选毒力减弱的重组牛轮状病毒，方法为将所收获的混合病毒以10μ g/mL浓度的胰酶37°C预处理60min，接种长满单层的NSP4-shRNA细胞，吸附Ih后，于未含犊牛血清且胰酶浓度为Iμ g/mL浓度的DMEM营养液中37°C培养48 76h，收集出现细胞病变的病毒培养液，反复冻融3次后，再次接种长满单层的NSP4-shRNA细胞，如此连续筛选数代后，最终获得NSP4基因变异的病毒BRV-AABY，即为毒力减弱的重组牛轮状病毒。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于所述NSP4-shRNA细胞是通过以下方法得到的 (1)针对NSP4基因的shRNA重组慢病毒质粒的构建 将人工设计并化学合成的NSP4-shRNA-l和NSP4_shRNA_2分别退火后，与慢病毒Hl载体经XbaI和AgeI双酶切后回收的12. 5kb片段以及经SmaI和AgeI双酶切所获得的I. 5kb片段按照如下体系12. 5kb载体片段，IOOng ；1. 5kb载体片段，50ng ；shRNAoligo, 50ng ；T4DNA连接酶，O. 5 μ L ;10 X T4DNA连接酶buffr，2 μ L，补足H2O使体系至20 μ L，16°C过夜连接；转化大肠杆菌DH5 α株感受态细胞，挑选克隆，提取质粒DNA，经PCR鉴定并经测序确认获得了相应的shRNA重组Hl载体——NSP4-shRNA重组质粒，备用；所述NSP4-shRNA_l和NSP4-shRNA-2的序列如下NSP4-shRNA-l TGAACAGCACATTGCACAC TTC A AG AG A GTGTG( ViA G XK TG TC /I TTTTTTGT ；NSP4-shRNA-2 |CTAG{ ACAAAAAATGAACAGCACATTGCACAC rTCTCTTGAAGTGTGCAATGTGCTGTT CA；如 SEQ ID NO. 11、12 所示； (2)shRNA稳定细胞系的建立 将长满单层的MA104细胞用O. 25%胰蛋白酶消化，传至60mm的平皿中，置37°C，5%CO2培养箱培养，待细胞融合度达到90%时，用于转染；用Opti-MEM洗I次细胞，在脂质体Lipofectamine 2000的介导下，将构建好的NSP4_shRNA重组质粒转染MA104细胞，转染5h后换液，待细胞生长至单层后，用O. 25%胰蛋白酶消化传代，连续传代5次后利用报告基因GFP、通过流式细胞分选仪进行筛分，将筛选的阳性细胞进行扩增，待细胞长至单层后，用O.25%胰蛋白酶消化传代I次，液氮保存，即获得稳定细胞系NSP4-shRNA。
10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于得到毒力减弱的重组牛轮状病毒后，通过PCR产物测序方法鉴定所拯救的NSP4基因变异的病毒，其中，PCR检测使用的引物为Pl :5’ -GTAATCACTCTAATGGATAGTACTTTA-3’ ；P2 :5，-CCATTCTTCTAGTGTTCTAACATC-3’ ；如 SEQ ID NO. 17、18 所示。
全文摘要
本发明公开了一种毒力减弱的NSP4突变基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种包含该毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒，还公开了一种包含该毒力减弱的NSP4突变基因的重组牛轮状病毒，构建方法为将重组质粒与pcDNA3.1-T7RNAP重组质粒共转染恒河猴肾细胞MA104，然后接种野生型牛轮状病毒，利用反向遗传技术拯救变异病毒，即得毒力减弱的重组牛轮状病毒。本发明的重组牛轮状病毒，为国内外首次利用反向遗传技术获得的毒力减弱的BRV病毒株，与传统获得减毒株方法比较，本发明利用反向遗传技术并结合RNA干涉方法，成功获得毒力减弱的牛轮状病毒，为BRV减毒疫苗侯选株的获得提供了快捷途径。
文档编号C12N7/01GK102703475SQ20121015102
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者何洪彬, 宋玲玲, 杨宏军, 王洪梅 申请人:山东省农业科学院奶牛研究中心