专利名称：一种端粒位置效应细胞模型及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于筛选影响端粒功能的药物或化合物的细胞模型，具体地说，是一种端粒位置效应细胞模型及其用途。
背景技术：
端粒是染色体末端具有重复序列的特殊结构，它是由简单的DNA高度重复序列组成的，染色体末端沿着5’到3’方向的链富含GT。在酵母和人体中，端粒序列分别为C1-3A/TG1-3和TTAGGG/CCCTAA，并有许多端粒蛋白与端粒结合。端粒的主要功能有:第一，保护染色体不被核酸酶降解；第二，防止染色体相互融合；第三，为端粒酶提供底物，解决DNA复制的末端隐缩，保证染色体的完全复制。端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。同时，端粒又是基因调控的特殊位点，常可抑制位于端粒附近基因的转录活性，沉默它附近基因的表·达，并与端粒长度有关，称之为端粒位置效应(Telomere PositionEffect，TPE)，而正常细胞端粒随细胞分裂逐渐缩短，端粒附近沉默的基因是重新表达的。已有研究表明证实TPE与细胞老化和肿瘤存在密切联系。中国期刊《第三军医大学学报》，2005年4月，第27卷第8期，刊出的论文“胃癌细胞中端粒位置效应研究”，作者将pTET-OFF调节质粒和携带荧光素酶报道基因的pTRE2-Hyg-Luc if erase反应质粒共转染胃癌细胞SGC7901，经强力霉素诱导24h后检测报道基因活性，观察强力霉素诱导的抑制反应。然后将插入有端粒片段的荧光素酶报道质粒PBX质粒和对照质粒pBX-ntf (noteloemere fragment)分别与pTET_0FF调节质粒共转染细胞,在强力霉素诱导下,检测报道基因活性的改变。结果发现共转染pTET-OFF和pTRE-Hyg-Luc if erase质粒的SGC7901细胞在强力霉素作用下荧光素酶报道基因的活性逐渐降低。强力霉素诱导分别共转染有pTET-OFF和pBX质粒或pTET-OFF和pBX-ntf的细胞时，前者荧光素酶活性较后者降低4倍。得出结论:转染TET-OFF基因表达调控系统的胃癌细胞SGC7901受强力霉素的诱导抑制；转染入胃癌细胞中的端粒片段降低了存在它附近荧光素酶报道基因的表达水平，也即TPE引起基因的不稳定。中国期刊《细胞生物学杂志》，2004，26:513_515，刊出的论文“端粒位置效应与人类衰老”表明TPE可能对细胞生长停止、以及衰老发生时等许多随端粒缩短密切相关基因的程序性表达产生重要作用。总之，端粒在细胞老化和肿瘤中起着重要作用，成为抗衰老和抗肿瘤治疗的重要靶点。筛选对端粒功能有影响的药物，进一步开发以端粒为靶点的临床药物对于肿瘤或其他相关疾病的治疗以及延缓衰老具有重要意义。但是目前并没有方法可以高通量筛选影响端粒功能的药物，尤其是影响TPE的药物。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种端粒位置效应质粒。本发明的再一的目的是，提供上述端粒位置效应质粒的用途。本发明的另一的目的是，提供一种端粒位置效应细胞模型。
本发明的第四个目的是，提供端粒位置效应细胞模型的用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
一种端粒位置效应质粒，它是在pCMV-GFP载体的GFP基因或pCMV-Luciferase载体的Lucif erase基因的下游插入如SEQ ID N0.1所示的T2AG3序列构建得到的；所述的pCMV-Luciferase载体是用Luciferase基因片段置换pCMV_GFP载体的GFP基因片段构建得到的。其中，所述的端粒位置效应质粒的具体构建方法是:使用NotI和PvuI双酶切pSXneo270 (T2AG3)质粒，回收T2AG3序列片段；使用NotI酶切pCMV-Luc if erase载体或pCMV-GFP载体，回收大片段；再使用连接酶连接上述T2AG3序列片段和大片段，并用补齐酶补齐一端酶切位点不匹配导致的碱基缺损；最后经转化，筛选，一代测序获得正确连接的克隆。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
如上所述的端粒位置效应质粒在建立端粒位置效应细胞模型中的用途；
如上所述的端粒位置效应质粒在高通量筛选抑制端粒位置效应的药物中的用途。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:
一种端粒位置效应细胞模型，它是含有如上所述的端粒位置效应质粒的细胞；
其中，所述的端粒位置效应细胞模型可以是含有如上所述的端粒位置效应质粒的C33A宫颈癌细胞。为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是:
如上所述的端粒位置效应细胞模型在高通量筛选影响端粒功能的药物中的用途；如上所述的端粒位置效应细胞模型在高通量筛选增强或抑制端粒位置效应的药物中的用途。本发明优点在于:
本发明成功构建了端粒位置效应质粒和细胞模型，运用该细胞模型可以高通量筛选对端粒功能有影响的药物，尤其是筛选抑制端粒位置效应的药物，弥补了高通量筛选影响端粒功能药物方面的空白，为进一步开发以端粒为祀点的涉及肿瘤、衰老的临床药物打下基础。
附图1 是 PGL3_Luciferase 载体图谱。附图2是pCMV-GFP载体图谱。附图3是pCMV质粒、Luciferase-TPE质粒、GFP-TPE质粒的结构示意图。其中，pCMV为对照质粒；TPE-Telo为Luciferase-TPE质粒和GFP-TPE质粒，其可通过TPE作用影响报告基因Luciferase或GFP的表达。附图4是对照C33A细胞株和Luciferase-ΤΡΕ细胞模型的Luciferase检测结果。其中，三角形代表对照细胞株，正方形代表Luciferase-TPE细胞模型；横坐标为不同时间段，纵坐标为Luciferase的化 学发光强度。附图5是运用Luciferase-ΤΡΕ细胞模型高通量自动筛选Prestwick Chemicals药库结果。其中，横坐标是被筛选的药物名称，纵坐标是Luciferase表达量；pCMV_24hr表示pCMV对照组经药物处理24h，pCMVTelo-24hr表示Luciferase-ΤΡΕ细胞模型经药物处理24h，pCMV-72hr 表示 pCMV 对照组经药物处理 72h，pCMVTelo_72hr 表示 Luciferase-ΤΡΕ 细胞经药物处理72h。附图6是在GFP-TPE模型中，运用GFP作为报告基因，用流式细胞仪检测证实Acacetin和Chrysin作用后GFP表达量升高，提示该药物对端粒的TPE作用有影响。附图7A、7B和7C是运用分子生物学方法证实chrysin和acacetin对TPE的抑制作用的结果。图7A为C33A肿瘤细胞经Chrysin和Acacetin处理后，表现出经典的TIF信号(Telomere dysfunction Induced Foci,即端粒受DNA损伤通路攻击的特异性信号)明显增多；图7B为MR90正常成纤维细胞经Chrysin和Acacetin处理后，表现出经典的TIF信号明显增多。其中，图7A、图7B中上端的图片为代表性TIF信号图，下端的柱状图是根据TIF信号图定量计算得到的TIF信号值。图7C为Chrysin和Acacetin处理后引起端粒失功能特异性的染色体末端畸变等表型(C左)和定量分析结果(C右)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。需要说明的是，下述免疫荧光法结合激光共聚焦检测的方法及染色体中期端粒原位杂交法均属于本领域技术人员公知常识。实施例1
1、材料
PGL3-Luc if erase载体，载体图谱如图1所示，购自Promega公司；pCMV_GFP载体，载体图谱如图2所示，购自Addgene公司；pSXneo270 (T2AG3)质粒，购于Addgene公司，载体图谱见Addgene公司网站http://www.addgene.0rg/ ；C33A宫颈癌细胞系来源于LifeTechnology公司细胞库。Lipofectamine 2000 细胞转染试剂购自 Invitrogen ;Luciferase/Renilla 化学发光试剂盒购于Promega公司；潮霉素(Hygromycin)购自Invitrogen ；5, 7-二轻基-4’ -甲氧基黄丽(acacetin)和 5，7_ 二轻基黄丽(chrysin)购自 Sigma 公司。acacetin 和 chrysin的结构式如下:
权利要求
1.一种端粒位置效应质粒，其特征在于，它是在PCMV-GFP载体的GFP基因或pCMV-Luciferase载体的Luciferase基因的下游插入如SEQ ID N0.1所不的T2AG3序列构建得到的；所述的pCMV-Luciferase载体是用Luciferase基因片段置换pCMV_GFP载体的GFP基因片段构建得到的。
2.根据权利要求1所述的端粒位置效应质粒，其特征在于，所述的端粒位置效应质粒的具体构建方法是:使用NotI和PvuI双酶切pSXneo270 (T2AG3)质粒，回收T2AG3序列片段；使用NotI酶切pCMV-Luciferase载体或pCMV_GFP载体，回收大片段；再使用连接酶连接上述T2AG3序列片段和大片段，并用补齐酶补齐一端酶切位点不匹配导致的碱基缺损；最后经转化，筛选，一代测序获得正确连接的克隆。
3.权利要求1或2所述的端粒位置效应质粒在建立端粒位置效应细胞模型中的用途。
4.权利要求1或2所述的端粒位置效应质粒在高通量筛选抑制端粒位置效应的药物中的用途。
5.一种端粒位置效应细胞模型，其特征在于，它是含有权利要求1或2所述的端粒位置效应质粒的细胞。
6.根据权利要求4所述的端粒位置效应细胞模型，其特征在于，它是含有权利要求1或2所述的端粒位置效应质粒的C33A宫颈癌细胞。
7.权利要求5或6所述的端粒位置效应细胞模型在高通量筛选影响端粒功能的药物中的用途。
8.权利要求5或6所述的端粒位置效应细胞模型在高通量筛选增强或抑制端粒位置效应的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种端粒位置效应细胞模型及其用途。具体的，本发明提供一种端粒位置效应质粒，它是在pCMV-GFP载体的GFP基因或pCMV-Luciferase载体的Luciferase基因的下游插入如SEQIDNO.1所示的T2AG3序列构建得到的；另提供了含有上述端粒位置效应质粒的细胞模型；还提供了上述细胞模型在高通量筛选影响端粒功能的药物中的用途。运用本发明的细胞模型可以高通量筛选对端粒功能有影响的药物，尤其是筛选抑制端粒位置效应的药物，弥补了高通量筛选影响端粒功能药物方面的空白，为进一步开发以端粒为靶点的涉及肿瘤、衰老的临床药物打下基础。
文档编号C12N15/63GK103074355SQ20131000822
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者叶静, 陆一鸣, 魏波华, 应亦林, 梁慧欣 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院