专利名称：包含wnt信号转导途径活化剂的用于诱导视网膜祖细胞分化成为视网膜细胞或用于诱导 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于诱导视网膜细胞增殖以及视网膜祖细胞分化成为视网膜细胞的组合物。更具体而言，本发明涉及包含fct信号转导途径活化剂的用于诱导视网膜祖细胞分化成为视网膜细胞(尤其是感光细胞)以及用于诱导感光细胞增殖的组合物。
背景技术：
失明是由于生理学或神经学原因而丧失视觉感知的医学病症。数以千万计的人(占世界人口的0. 2-0. 5%)受到失明的影响，并且在个人、社会和经济方面正遭受巨大的损失。视网膜光受体退化是先天或通过其它多种因素引起的失明的更占主导地位的病因之一，包括视网膜发育异常、视网膜退化、老年黄斑退化、糖尿病视网膜病变、视网膜色素变性、先天性视网膜失养症、Leber先天性黑朦、视网膜脱落、青光眼、视神经病变和外伤。迄 今还没有开发出用于对这类疾病进行基础治疗的药物。到目前为止，用新的感光细胞替换这些视网膜疾病的a型和Co型异常感光细胞被认为是唯一有前景的疗法。感光细胞植入被认为通过延迟或抑制视网膜退化、再生退化的视网膜以及增强视网膜功能来预防失明或恢复有缺陷的视力。干细胞已经成为用于视网膜疾病的细胞疗法的有用备选者，所述干细胞包括骨髓干细胞(BMSC)、脐带血干细胞、羊水干细胞、脂肪干细胞、视网膜干细胞(RSC)、胚胎干细胞(ESC)、诱导型多能干细胞(iPSC)和体细胞核移植细胞(SCNT)。对于干细胞分化成为视网膜细胞(尤其是感光细胞)以及基于此的细胞疗法还没有得出有意义的研究结果。这些干细胞向视网膜细胞的分化可使以下几点成为可能1)保证了用于有效细胞疗法的无限细胞来源，2)识别尚不清楚的由胚胎细胞和视网膜前体细胞成为视网膜细胞的分化机制，3)发现视网膜分化相关基因和分子及其损伤疗法，4)理解视网膜退化性疾病的发病机理，以及5)开发用于预防视网膜退化和保护视网膜的药物。自从其首次确立，人胚胎干细胞系就被认为具有分化成为可用于多种疾病的细胞 疗法的有用的各种类型细胞的能力。当人胚胎干细胞允许在临床治疗中精确检查发病机理并提供能够替代异常细胞的新鲜细胞时，其似乎具有高潜能。在完全确定的可再生条件下产生人ESC来源的视网膜感光细胞及其在植入法中的用途保证了其是用于视网膜感光细胞相关疾病的极其有力可能且有效的疗法。假设人ESC来源的细胞与通过正常分化过程所形成的细胞具有相同的性质和功能。基于这种假设，以与产生以下细胞的发育阶段相似的条件下诱导分化表达胰激素的内分泌细胞(D’Amour, et al.，Nat. Biotechnol.，2006 ；24:1392-401)、神经元(Pankratz，et al. , Stem Cells 2007;25:1511-20)、肌细胞(Barberi et al. , Nat. Med. , 2007 ; 13:642-8)和血管内皮细胞(Wang, et al. , Nat.Biotechnol. , 2007 ;25:317-8)。并且，已经进行多次尝试来将人类ESC分化成为可有效用于治疗视网膜疾病的感光细胞，但是大多数情况都以失败告终。实际上，从人胚胎干细胞分化成为视网膜祖细胞是在该领域内迄今为止所作出的最大成就，但是从视网膜祖细胞分化成为感光细胞却失败了(分化率低于0. 01%) (Lambaet al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006 ; 103:12769-74)。一项报道称，人胚胎干细胞被成功诱导分化成为感光细胞，但是其中所用的方法对于分化总共需要超过200天，而其中的分化率低至8%,因此不可能用于临床治疗失明(Osakada et al. , Nat. Biotechnol. , 2008 ；26:215-24)。Wnt信号转导途径参与调节胚胎发生期间的多个过程，包括组织发育、细胞增殖、形态、运动性以及细胞命运决定等(Wodarz & Nusse, Annu. Rev. Cell Dev.Biol.，1998; 14:59-88)。已知促进或调节分化取决于组织类型和分化水平。至今，在胚胎发育和细胞生物学的背景下，已报道fct信号转导途径包括Wnt3a密切参与细胞分化的调节和未分化细胞的维持和增殖(Aubert, et al.，Nat. Biotechnol.，2002; 20:1240-5)。现有技术尚未报道fct信号转导途径对与脊椎动物眼模式发生和神经发生相关的细胞分化和 成熟的影响
发明内容
技术问题由本发明人利用化学限定的方法对人ESC向视网膜细胞，尤其是感光细胞分化进行广泛且深入的研究，产生了本发明，导致以下发现当应用与体内条件相似的用于分化成为感光细胞的体外条件(其中利用分化相关因子及其抑制剂)时，fct信号转导途径活化剂在视网膜细胞增殖以及使干细胞向视网膜细胞(尤其是感光细胞)分化并成熟中起重要作用。技术方案因此，本发明的目的是提供包含Wnt信号转导途径活化剂的用于诱导视网膜细胞增殖的组合物。本发明的另一目的是提供包含Wnt信号转导途径活化剂的用于诱导视网膜祖细胞分化成为视网膜细胞(尤其是感光细胞)的组合物。有益效果如上文所述，本发明的组合物允许干细胞在无需其它基因转移的情况下在短期内以高产量分化成为大量感光细胞。本发明的组合物既不需要通过流式细胞术分离感光细胞也无需额外的感光细胞增殖，就能够以高产量产生大量感光细胞，以便分化的感光细胞可容易地被植入退化或受损的视网膜中。此外，分化的感光细胞可用于细胞疗法，因为被植入退化或受损的视网膜中时，这些分化的感光细胞能够在视网膜内植入并融合，从而预防或治愈视网膜退化。附图简要说明图I是细胞形态的显微镜照片(A)左图，来自第28代的细胞在培养5天之后，处于未分化状态的hESC的典型细胞絮凝物(第29代；40X放大倍数)。通过与邻近的MEF饲养细胞明确分离来表征。具有光滑的表面和均匀的形态。(A)右图，从图IA左图的hESC絮凝物分离之后，在超低吸附平板培养4天的悬浮聚集物(40X放大倍数)。球形形态，每个悬浮聚集物由大约292±53个细胞组成。
(B)-(D).分化成为视网膜细胞的细胞形态的显微镜照片。(B).诱导分化后第14天，即在悬浮聚集物被转移至聚D赖氨酸/层粘连蛋白包被的平板并在其中培养10天的细胞，其为诱导未分化的hESC分化后的第14天。观察到细胞从悬浮聚集物分离并经历分化。分化早期的细胞形态具有较少的细胞质和既圆又大的细胞核。(C).诱导分化后第19天的细胞，即未分化的hESC在诱导分化19天后的细胞。这些细胞分化成为视网膜祖细胞，并伴随活性增殖。活性增殖和分化状态下的细胞絮凝物形成漩涡排列或玫瑰样结构。(D).诱导分化后第21天的细胞，显示出由活性增殖导致的细胞数量的增加。这些细胞变得更富含细胞质，且它们的细胞核大小比图IC中进行分化的细胞的细胞核更小。这些细胞似乎起对光响应的作用。(E)-(H).诱导分化后第29天的细胞絮凝物的各种形态。 (E).大多数细胞，尤其是在细胞密集区所观察到的细胞的形态。随着分化的进行，与诱导后第21天的细胞相比，细胞显示出相同的细胞结构，但具有更丰富的细胞质和更小且更致密的细胞核。(F).细胞稀少区的细胞的形态。细胞絮凝物表现出方向性并向依赖于细胞簇的某个点移动。观察到更丰富的向两端聚集的细胞质和纺锤样的细胞核。(G).细胞絮凝物，某些具有多个神经束。(H)左图，细胞絮凝物，某些显示出长的神经轴突。(H)右图，细胞絮凝物，某些表现出分化的神经元的形态。*显微镜视野(A)(左图，右图40X放大倍数)；(B)_(G)(左图50X放大倍数；右图200 X放大倍数)；(H)(左图和右图200 X放大倍数)。图2显示视网膜细胞标志物Crx、恢复蛋白(recoverin)、视紫红质(rhodopsin)、外周蛋白2(peripherin2)和Ki67的表达水平随培养时间的变化。图3是一组显示向视网膜细胞分化29天所获得的细胞并对恢复蛋白和视紫红质(二者指示感光细胞)进行免疫染色的显微镜照片。在hESC被诱导分化成为感光细胞之后，对感光细胞特异性蛋白的表达进行检测。受试的分化细胞中超过80%对恢复蛋白(通用感光细胞标志物)和视紫红质(视杆细胞特有的)为阳性。(A)和(B).分化的感光细胞絮凝物。(C).细胞稀少区的个体细胞恢复蛋白和视紫红质在分化的感光细胞中表达不同。*显微镜视野(A) 100 X放大倍数；(B) 200 X放大倍数；(C) 400 X放大倍数。*合并对恢复蛋白和视紫红质进行荧光免疫染色的细胞的叠加照片。表达两种抗原的细胞显黄色(绿+红)。+合并/DAPI =DAPI是细胞核染色的细胞群。合并/DAPI图像是用于检测恢复蛋白和视紫红质表达以及DAPI表达的叠加荧光照片，同时显示了细胞轮廓和两种抗原的表达模式。图4是诱导向视网膜细胞分化29天之后所获得的细胞的荧光显微镜照片，显示了感光细胞标志物视紫红质、rom-1和外周蛋白2的表达。观察到分化的感光细胞表达Rom-I和外周蛋白2 ( 二者是视紫红质阳性的视杆细胞外段特有的)。(A).对视紫红质和rom-1都为阳性的细胞絮凝物。
(B).对视紫红质和rom-1都为阳性的个体细胞。在每个细胞中，视紫红质和!"om-l在明显不同的位置处表达。随着分化的进行，视紫红质在内部细胞质中表达，而rom-1定位在最外部的细胞质。(C).对视紫红质和外周蛋白2都为阳性的分化的感光细胞的絮凝物。(D).对视紫红质和外周蛋白2为阳性的个体细胞。*显微镜视野(A) 100X放大倍数；(B)400X放大倍数；(C) 100X放大倍数；(D) 400 X放大倍数。图5是诱导向视网膜细胞分化29天后所获得的细胞的荧光显微镜照片，显示了感光细胞标志物视紫红质、光导蛋白(phosducin)和Pde6b的表达。这些蛋白负责对光响应，表明分化的感光细胞表现出其特有的功能。(A).对视紫红质和光导蛋白都为阳性的分化的感光细胞的絮凝物。⑶.对视紫红质和光导蛋白都为阳性的个体细胞。(C).对视紫红质和Pde6b都为阳性的分化的感光细胞的絮凝物。⑶.对视紫红质和Pde6b为阳性的个体细胞。*显微镜视野(A) 100X放大倍数；(B)400X放大倍数；(C) 100X放大倍数；(D) 400 X放大倍数。图6是诱导向视网膜细胞分化29天后所获得的细胞的荧光显微镜照片，显示了感光细胞标志物视紫红质和突触蛋白(synaptophysin)的表达。(A).对视紫红质和突触蛋白都为阳性的分化的感光细胞的絮凝物。这些蛋白的表达表明，分化的感光细胞与其它视网膜神经元发生突触相互作用，并参与视网膜神经回路的形成。(B).对视紫红质和突触蛋白为阳性的个体细胞。*显微镜视野(A) 100 X放大倍数；⑶400 X放大倍数。图7是诱导向视网膜细胞分化29天后所获得的细胞并针对视锥细胞进行免疫染色的荧光显微镜照片。左图，对蓝视蛋白(blue-opsin)为阳性的细胞絮凝物。右图，对蓝视蛋白为阳性的个体细胞。蓝视蛋白的表达表明分化的细胞是蓝视蛋白-视锥细胞。*显微镜视野(左)100 X放大倍数；(右)400 X放大倍数.图8是诱导向视网膜细胞分化29天后所获得的细胞并对典型的感光细胞进行免疫染色的荧光显微镜照片。观察到已经历进一步分化的各种类型的细胞。左图，对恢复蛋白和视紫红质都为阳性的细胞，显示了感光细胞的特有形态。中图，对突触蛋白和视紫红质为阳性的细胞，显示了进一步的成熟分化。右图，通过细胞质内丰富的视紫红质分子表征的视紫红质阳性细胞。*显微镜视野400 X放大倍数。
图9是诱导向视网膜细胞分化29天后所获得的细胞并针对神经视网膜祖细胞和感光细胞前体细胞进行免疫染色的荧光显微镜照片。(A).对Rax和Pax6都为阳性的细胞絮凝物。(B).对Rax和Pax6都为阳性的个体细胞。观察到大多数细胞都表达两种抗原，但是它们之间的表达水平不同，这表明分化诱导29天后所获得的视网膜细胞来源于神经视网膜祖细胞。(C).对增殖性标志物Ki67和感光细胞前体细胞标志物Crx为阳性的细胞絮凝物。(D).对Ki67和Crx都为阳性的个体细胞。大多数Crx阳性细胞不表达Ki67。这与感光细胞前体细胞离开细胞增殖周期后立 即表达Crx这一事实相符。有时，少量Crx阳性细胞仍继续表达Ki67。*显微镜视野(A)IOOX放大倍数；(B)400X放大倍数；(C) 100X放大倍数；(D) 400 X放大倍数。
图10是诱导向视网膜细胞分化29天后所获得的细胞并针对视网膜细胞而非感光细胞进行免疫染色的荧光显微镜照片。(A).对Islet-I和NF-200都为阳性的细胞絮凝物(左)和个体细胞，这证实为视网膜神经节细胞，因为细胞核和轴突分别对Islet-I和NF-200为阳性。(B).对PKC-a为阳性的细胞絮凝物(左)和个体细胞(右)，这证实为双极细胞。(C).对Prox-I为阳性的细胞絮凝物(左)和个体细胞(右)，这证实为水平细胞。⑶.对GFAP为阳性的细胞絮凝物(左)和个体细胞(右)，这证实为米勒胶质细胞。(E).对Rpe65和Z0_1都为阳性的细胞絮凝物(左)和个体细胞(右)，这证实为视网膜色素上皮。*显微镜视野(A).左，100 X放大倍数，右，400 X放大倍数；(B)左，100 X放大倍数，右，400 X放大倍数；(C)左，100X放大倍数，右，400 X放大倍数；(D)左，100X放大倍数，右，400 X放大倍数；(E)左，100X放大倍数，右，400 X放大倍数。图11是分别用BIO和purmorphamine而不是Wnt3a和Shh诱导向视网膜细胞分化29天所产生的细胞并针对感光细胞前体细胞和感光细胞进行免疫染色的荧光显微镜照片。(A).对增殖性细胞标志物Ki67和感光细胞前体细胞特异性抗原Crx都为阳性的细胞絮凝物。(B).对Ki67和Crx都为阳性的个体细胞。(C).对感光细胞标志物恢复蛋白和视紫红质为阳性的细胞絮凝物。(D).对恢复蛋白和视紫红质为阳性的个体细胞。*显微镜视野(A)IOOX放大倍数；(B)400X放大倍数；(C) 100X放大倍数；(D) 400 X放大倍数。图12是分别用BIO和purmorphamine而不是Wnt3a和Shh诱导向视网膜细胞分化29天所产生的细胞并针对感光细胞标志物视紫红质、外周蛋白2和rom-1进行免疫染色的荧光显微镜照片。(A).对视紫红质和外周蛋白2都为阳性的细胞絮凝物。
(B).对视紫红质和外周蛋白2都为阳性的个体细胞。(C).对视紫红质和rom-1都为阳性的细胞絮凝物。⑶.对视紫红质和！"om-l都为阳性的个体细胞。*显微镜视野(A) 100X放大倍数；(B)400X放大倍数；(C) 100X放大倍数；(D) 400 X放大倍数。图13是分别用BIO和purmorphamine而不是Wnt3a和Shh诱导向视网膜细胞分化29天所产生的细胞并针对视锥细胞进行免疫染色的荧光显微镜照片。
左图，蓝视蛋白阳性的细胞絮凝物。右图，蓝视蛋白阳性的个体细胞。*显微镜视野(左)100 X放大倍数；(右)400 X放大倍数。图14是人iPSC的显微镜照片。(A).细胞形态显微镜照片。(A)左图，来自第43代的细胞在培养6天后处于未分化状态的人iPSC的典型细胞絮凝物(第43代；显微镜视野40X放大倍数)。通过与邻近的MEF饲养细胞明确分离来表征。具有光滑的表面和均匀的形态，这也是未分化的hESC所特有的。(A)右图，从图14A左图的人iPSC絮凝物分离后，在超低吸附平板培养4天的悬浮聚集物(显微镜视野40X放大倍数)。(B)对特征标志物进行免疫染色的未分化的人iPSC的荧光显微镜照片。细胞絮凝物中的大多数细胞对SSEA4和Nanog都为阳性，这证实保持在未分化状态。*显微镜视野(最左)40X放大倍数；(其它)100X放大倍数。图15是一组显示诱导人iPSC向视网膜细胞分化29天所获得的细胞，并对恢复蛋白和视紫红质(二者均为感光细胞特有的)进行免疫染色的显微镜照片。分析由人iPSC分化的感光细胞的感光细胞特异性蛋白的表达。(A).分化的感光细胞絮凝物。(B).低细胞密度区的个体细胞。(C).细胞稀少区的个体细胞。恢复蛋白和视紫红质在分化的感光细胞中表达不同。*显微镜视野(A) 100 X放大倍数；(B) 400 X放大倍数；(C) 400 X放大倍数.图16是显示对视网膜细胞特异的基因的RT-PCR照片。利用RT-PCR测定通过诱导未分化的hESC向视网膜细胞分化29天所产生的细胞中与视网膜祖细胞、感光细胞和其它视网膜细胞相关的基因的mRNA表达水平。(A).视网膜祖细胞特异的基因 RAX(495bp)、PAX6 (275bp)、SIX3 (307bp)、SIX6 (272bp)、LHX2 (285bp)和 CHXlO (281bp)的 RT-PCR 产物。其中，RAX 和 PAX6 的表达程度同定量对照基因GAPDH(PCR产物大小302bp) —样高。相比之下，在RT-PCR产物中未见发育中的大脑皮层相关基因ARX(462bp)，发育中的中胚层基因T(541bp)或发育中的内胚层基因AFP (318bp)，这表明本发明的方法特异地针对视网膜相关基因的mRNA表达。(B).感光细胞和其它视网膜细胞相关基因的RT-PCR产物。通过RT-PCR扩增观察到感光细胞相关基因 CRX(353bp)、NRL(206bp)、RCVRN (150bp)、RH0(258bp)、PDE6B(409bp)、SAG(400bp)和OPNlSW(206bp)。在RT-PCR产物中还发现视网膜神经节细胞基因ATH07(246bp)和P0U4F2 (175bp)，无长突细胞基因NEUR0D1 (523bp)和双极细胞基因ASCLl(467bp)。感光细胞相关基因的特征如下CRX和NRL分别为感光细胞前体细胞和视杆细胞特有的转录基因。RCVRN(恢复蛋白)是对视锥细胞和视杆细胞测试均为阳性的通用感光细胞基因。RHO(视紫红质)是视杆细胞特异的。PDE6B和SAG(Aarrestin)参与感光细胞的光转换。这些基因的表达证实感光细胞自身功能的发育和成熟。OPNlSW是短波(蓝视蛋白)_视锥细胞特有的。M:标志物。图17显示了感光细胞特征基因的RT-PCR和碱基测序结果。
对诱导未分化的hESC向视网膜细胞分化29天所产生的细胞进行RT-PCR，以便能够检测感光细胞特异性基因RCVRN(NM 002903. 2)和RHO (NM_000539. 3)。通过碱基测序鉴定RT-PCR产物为RCVRN和RH0。⑷.RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示RCVRN为150bp，RHO为258bp。M :标志物。⑶.碱基测序分析的色谱图，显示RCVRN的碱基序列(顶图)和RHO的碱基序列(底图)。发现RCVRN和RHO基因的碱基序列与人类标准序列(http://www. ncbi. nlm. nih.gov/)完全一致，这表明感光细胞表达人RCVRN和RHO基因。图18是已植入hESC来源的感光细胞或未植入hESC来源的感光细胞的视网膜退化小鼠rd/SCID的视网膜电图。(A). 8周龄未植入小鼠的视网膜电图。未发现特征ERG波形。ERG b_波对于右眼的振幅为6. 29 u V，对于左眼为0. 0542 U V。(B). 8周龄小鼠在植入后4周的视网膜电图。与未植入的右眼相比，来自感光细胞植入的左眼的ERG b-波形成了特征波形，振幅高达74. 5 y V。如视网膜电图描记术所测量，植入了 hESC来源的感光细胞的rd/SCID小鼠对光刺激表现出明确应答。图19是对已植入或未植入hESC来源的感光细胞的视网膜退化rd/SCID小鼠之间的b-波振幅进行比较的图。来自植入感光细胞的rd/SCID小鼠的ERG b_波形成了特征波形，振幅为48. 4(±3. 4) UV(样品大小=13)。相比之下，在未植入组的ERG中没有发现任何一处形成特征波形，其显示b-波振幅为10.3(±2. 5) y V(样品大小=17)，这在统计学上显著不同于植入组(P〈0. 0001)(表 6，图 19)。图20是hESC来源的感光细胞被植入入视网膜退化的小鼠模型(rd/SCID)后的荧光显微镜照片。植入后4周，利用视紫红质和恢复蛋白(二者是人线粒体和感光细胞特有的)分析hESC来源的感光细胞是否植入视网膜。当视紫红质和恢复蛋白阳性细胞对人类线粒体抗原表现出阳性应答时，可以确定这些细胞是hESC来源的感光细胞。(A).对植入组中的人特异的线粒体和视紫红质进行的免疫染色。所形成的新的外核层(ONL)为视紫红质阳性感光细胞层的4或5倍。(B).对作为对照的同龄(8周龄)的未植入组rd/SCID小鼠的人特异的线粒体和视紫红质进行的免疫染色。观察到仅有一层外核层，主要由视锥细胞组成。由于退化几乎没有观察到视杆细胞，而仅检测到正在茎退化的两个残留细胞。(C).对植入组中的人特异的线粒体和恢复蛋白进行的免疫染色。4或5倍的恢复蛋白阳性细胞层形成了新的外核层。在植入组中，在外核层和内核层(INL)中形成了 4或5倍的恢复蛋白阳性细胞层。(D).对作为对照的未植入组中的人特异的线粒体和恢复蛋白进行的免疫染色。在全部40个细胞中检测到阳性应答。单层恢复蛋白阳性外核层由视锥细胞组成，而恢复蛋白阳性内核层由锥形双极细胞形成。*显微镜视野(A)和(C)左图，200 X放大倍数；(A)-⑶400 X放大倍数。*0NL:外核层INL:内核层RGC:视网膜神经节细胞
图21是显示人ESC来源的感光细胞被植入入视网膜退化的小鼠模型(rd/SCID)后的植入结果的图。在未植入组中，在每个所观察的显微镜视野的共199个细胞中，只有2个检测到视紫红质(阳性率1.0%)。另一方面，在植入组中，每个显微镜视野的共215个细胞中，有88个为视紫红质阳性(阳性率40. 8%) (p〈0. 0001)。因此，发现植入的视杆细胞占视网膜切片总面积的大约40%。在未植入组中，在每个显微镜视野的共168个细胞中，有40个检测到对恢复蛋白的阳性应答(阳性率23. 8%)，但在植入组中，在每个显微镜视野的共292个细胞中，有120个检测到对恢复蛋白的阳性应答(阳性率41. 0%)，具有统计学显著性(p〈0. 0001)。图22是hESC来源的感光细胞被植入入视网膜退化的小鼠模型(rd/SCID)后的荧光显微镜照片。植入后4周，对人类线粒体和感光细胞抗原突触蛋白进行免疫染色和分析。在未植入组中，恢复蛋白表示内核层的双极细胞和外核层的视锥细胞。在植入组中，发现4或5倍的突触蛋白阳性细胞层形成新的外核层，这表明新形成的外核层中的感光细胞与植入小鼠视网膜的其它视网膜内细胞发生突触相互作用。*显微镜视野左.200X放大倍数；其它为400 X放大倍数。图23是显示按照分化因子Wnt3a(W)、Shh(S)和视黄酸(R)的组合进行的平均细胞计数的图。图24是显示在不存在Shh和视黄酸的条件下，感光细胞标志物相对于fct3a及其抑制剂Dkk-I的浓度的阳性率的图(*:P〈0. 0001 ;#:P=0. 0381)。实施发明的最佳方式一方面，本发明涉及包含Wnt信号转导途径活化剂的用于促进视网膜细胞增殖的组合物。本文所用的术语“Wnt信号转导途径活化剂”意指能够活化Wnt信号转导途径的物质，其被发现调控胚胎发生期间的多个过程，包括细胞命运决定、组织重建、极性、形态、粘附和生长，以及未分化细胞的维持和增殖(Logan&Nusse, Annu Rev Cell Dev Biol. 2004 ；20:781-810)。只要其能转导Wnt介导的或P -连环蛋白介导的信号，任何活化剂都可以包括在fct信号转导途径中。Wnt信号转导途径是由引发物Wnt与其受体结合启动的或由下游因子￠-连环蛋白的稳定性所介导的一系列过程。接下来描述如何活化fct信号转导途径。
I)通过添加Wnt蛋白Wnt为Wnt信号转导途径的第一引发物，属于分泌糖蛋白家族。已经鉴定出 19 种 Wnt ffntl> Wnt2> Wnt2b> Wnt3> Wnt3a> Wnt4> Wnt5a> Wnt5b> Wnt6>Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b> Wnt9a> Wnt9b> WntlOa、WntIOb> Wntll 和 Wntl6b。2)通过增加￠-连环蛋白的水平大多数细胞通过增加￠-连环蛋白水平而响应于Wnt信号转导途径。即去磷酸化的￠-连环蛋白水平的增加或￠-连环蛋白的稳定表示^-连环蛋白转移入细胞核。3)通过蓬乱蛋白(dishevelled)的磷酸化或Wnt相关受体即LRP尾的磷酸化。4)通过使用GSK3 (糖原合酶激酶3)抑制剂锂(Li)、LiCl、二价ZruBIO (6-溴靛玉红 _3，-月亏)、SB216763、SB415286、QS11 水合物、TWS119、Kenpaullone、alsterpaullone、靛红_3，-肟、TDZD-8和Ro 31-8220甲磺酸盐。5)通过阻断Wnt信号转导途径的负调节剂，例如Axin和APC或通过使用RNAi。 6)使用 Wnt 途径的活化剂,例如 norrin 和 R_spondin2 :Norrin 结合 Frizzled4 受体，而 R-spondin2 与 Frizzled8 和 LRP6 相互作用。7)通过基因转移，包括转染使用Wnt过表达构建体或￠-连环蛋白过表达构建体能够活化fct信号转导途径。在优选实施方案中，可以不受限制地使用Wnt信号转导途径活化剂。优选Wntl、Wnt2> Wnt2b> Wnt3> Wnt3a> Wnt4> Wnt5a> Wnt5b> Wnt6> Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b> Wnt9a>Wnt9b、WntlOa、WntlOb、WntlI、Wntl6b ;增加P -连环蛋白水平的物质；GSK3抑制剂，如锂、LiCl、二价锌、BIO、SB216763、SB415286、CHIR99021、QSll 水合物、TWS119、Kenpaullone,alsterpaullone、靛红 _3，-肟、TDZD-8 和 Ro 31-8220 甲磺酸盐；Axin 抑制剂、APC 抑制剂、norrin 和 R-spondin 2,且最优选 Wnt3a> ffntl> Wnt5a> WntlI、norrin、LiCl、BIO 和SB415286。在本发明的优选实施方案中，用于诱导视网膜细胞增殖的组合物含有除LiCl、BI0和SB415286之外的Wnt信号转导途径活化剂，其量为0. 01至500ng/ml，优选量为0. I至200ng/ml，且更优选量为I至100ng/ml。在Wnt信号转导途径活化剂中，培养基中用到的LiCl的量为0. I至50mM，优选量为0. 5至10mM，且更优选量为I至IOmM ;使用BIO的量为0. I至50 ii M，优选量为0. I至10 ii M，且更优选量为0. 5至5 ii M ;使用SB415286的量为0. I至500iiM，优选量为I至100 ii M，且更优选量为5至50 ii M。在改良的实施方案中，培养基可以含有 50ng/ml 的 Wnt3a 或 Wntl ；50 或 100ng/ml 的 Wnt5a 和 Wntll ；50ng/ml 的 norrin ；2. 5 或 5mM 的 LiCl ;2 y M 的 BIO 或 30 y M 的 SB415286。本文所用的术语“视网膜”指感光组织。视网膜是眼球内最深处的(感觉)透明层，且与视觉直接相关。正好在感觉神经性视网膜外侧的是由色素细胞组成的视网膜色素上皮。在更广泛的含义上，视网膜包括内部感觉层和外部视网膜色素上皮。视网膜位于眼后面，并且在胚胎发育中作为发育大脑的副产物而产生。视网膜像一块五层的蛋糕，由三层核心层和穿插在它们之间的两层网络层组成。三层核心层是由感光细胞组成的最外层的核心层；由水平细胞、双极细胞、无长突细胞和米勒胶质细胞组成的内核层；以及由视网膜神经节细胞核心组成的最内层的视网膜神经节细胞层。通过眼睛的眼角膜和晶状体之后，光线依次通过视网膜神经节细胞层和内层达到外核层，在感光细胞处产生神经冲动。这些神经冲动向反方向转换。即，当感光细胞受神经冲动刺激时，神经电流传导至内核层，然后通过视网膜神经节细胞层进入视神经纤维。本文所用的术语“视网膜细胞”意指构成视网膜部分的细胞，包括诸如视杆细胞和视锥细胞的感光细胞、视网膜神经节细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、米勒胶质细胞和视网膜色素上皮细胞。本发明的组合物诱导视网膜细胞尤其是感光细胞增殖。本文所用的术语“感光细胞”是指存在于眼睛视网膜中能够光转换并允许识别形状和颜色的特化类型的神经元当光通过眼角膜和晶状体到达视网膜时，感光细胞将光能转化为电能，然后该电能被传入大脑。存在两种主要的感光细胞类型视杆细胞和视锥细胞，二者分别适合暗光和亮光。视锥细胞向视网膜的中央(即黄斑)逐渐变密，起到感知图像和色彩的作用，而视杆细胞主要分布在视网膜的周围，允许感知图像和光。感光细胞通过表达选自以下的至少一种、两种或三种标志物的能力来表征恢复蛋白(视杆细胞，视锥细胞)、视紫红质(视杆细胞)、外周蛋白2 (视杆细胞)、roml (视杆细胞，视锥细胞)、Pde6b (视杆细胞)、arrestin sag(视杆细胞)、光导蛋白(视杆细胞,视锥细胞)、突触蛋白(视杆细胞，视锥细胞)、红绿视蛋白(red/green opsin,视锥细胞)和蓝视蛋白(视锥细胞)。在优选实施方案中，本发明的视网膜细胞或感光细胞可以来源于包括人在内的动物。本文所用的术语“动物”意图包括人类、灵长类动物、牛、猪、绵羊、马、狗、小鼠、大鼠和猫，优选人类。在本发明的一实施方案中，Wnt信号转导途径活化剂被鉴定为在视网膜细胞增殖中起重要作用。关于这方面，将fct信号转导途径活化剂Wnt3a (W)、Shh信号转导途径活化剂Shh(S)和视黄酸(R)相互组合，以提供多种组合物，然后将这些组合物在不同时间点应用于hESC，随后培养该hESC细胞29天。完成分化之后，对分化的视网膜细胞进行计数(实施例9)。使用W+/S+/R+时测量到了最高的细胞群(3. 98 (±0. 64) X IO6个细胞)，随后为 W+/S-/R+ 中的 2. 74( + 0. 36) X IO6 个细胞和 W+/S+/R-中的 2. 21 (±0. 67) X IO6个细胞。W-/S-/R-和W-/S+/R+中增殖细胞的密度分别低至0. 87 (±0. 38) X IO6和0. 73 (±0. 16) X IO6 (图23和表8)。数据表明，细胞增殖不依赖于S和R的存在，但依赖于W。大部分细胞增殖由fct3a的作用引起。当比较两种介质W+/S+/R+和W-/S+/R+时，细胞群(3. 98X IO6与0. 73X IO6)相差5倍(图23和表8)。这再一次表明Wnt3a在细胞增殖中起重要作用。在(W+/S+/R+)培养基中培养4周之后，未分化的细胞增殖至3. 98X IO6个分化的细胞(图23和表8)，这比初始细胞群更高257倍，这首次表明Wnt信号转导途径活化剂能用于使视网膜细胞增殖。本文所用的术语“干细胞”指能够产生三种原胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的所有衍生物的多能细胞或能够分化成为在组织类型和功能上密切相关的成熟细胞的多能细胞。本文所用的术语“动物”意图包括人类、灵长类动物、牛、猪、绵羊、马、狗、小鼠、大鼠和猫，优选人类。本文所用的术语“胚胎干细胞”指来源于受精卵刚要着床于子宫壁之前的胚泡内细胞团的多能细胞，其能够分化成为任何类型的动物细胞，并且更广泛的含义意图包括干 细胞样细胞如类胚体和诱导型多能干细胞(iPS)。
本文所用的术语“成体干细胞”意指从组织分离并离体培养的多能细胞，并且意图包括骨髓干细胞、脐带血干细胞、羊水干细胞、脂肪干细胞、视网膜干细胞、视网膜内的米勒胶质细胞和神经干细胞。另一方面，本发明涉及包含Wnt信号转导途径活化剂的用于诱导视网膜祖细胞分化成为视网膜细胞的组合物。优选地，视网膜细胞是感光细胞。本文所用的术语“视网膜祖细胞”意指能够分化成为存在于视网膜中的细胞和视网膜色素上皮细胞的多能祖细胞。视网膜祖细胞可以是从多种干细胞分化的细胞或者可以是存在于视网膜内或从视网膜分离的细胞，所述干细胞即视网膜干细胞、脐带血干细胞、羊水干细胞、脂肪干细胞(fat stem cell)、骨髓干细胞、脂肪干细胞(adipose stem cell)、神经干细胞、胚胎干细胞、诱导型多能干细胞或体细胞核移植细胞。通常，视网膜祖细胞可经历对称或不对称分裂，因而或者可分化成为多种类型的视网膜细胞或视网膜色素上皮细胞，或者可产生另外两个视网膜祖细胞。因此，应当理解的是，培养步骤中所用的用于分化成为视网膜祖细胞的细胞包括在干细胞分化成为视网膜细胞期间所产生的多种类型的细 胞以及视网膜祖细胞。视网膜祖细胞包括神经视网膜祖细胞和视网膜色素上皮祖细胞，并且通过选自以下的至少一种、两种或三种标志物来表征Rax、Pax6、ChxlO、0tx2、Sox2、Lhx2、Six3、Six6 和 Mitf0本文所用的术语“祖细胞”或“前体细胞”指能够进行不对称分裂的细胞。不对称分裂指这样的情况，其中祖细胞或前体细胞或者能够以特定概率产生另外的两个祖细胞或前体细胞，或者能够分化，使得尽管它们经历相同轮数的传代，但是所产生的细胞可具有不同的年龄和性质。如上文提到的与视网膜发育相关，视网膜祖细胞能够分化成为多种类型的视网膜内细胞(视杆细胞和视锥细胞、视网膜神经节细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、米勒胶质细胞等)和视网膜色素上皮，特征为诸如Crx、恢复蛋白、视紫红质、红绿视蛋白、蓝视蛋白、外周蛋白 2、PDE6B、SAG、Isletl/NF200、Proxl、PKC-a、Hu C/D、GFAP 和 RPE65 的标志物为阳性表达。然而，这些标志物的表达水平和阳性率在视网膜祖细胞中变得比在成熟视网膜细胞或视网膜色素上皮中更弱。本文所用的术语“神经视网膜祖细胞”意图表示偏爱神经元的视网膜祖细胞。SP，本文的神经视网膜祖细胞是决定分化成为视网膜内神经元(视杆细胞和视锥细胞、视网膜神经节细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞及米勒胶质细胞)的祖细胞。通常，神经视网膜祖细胞可经历对称或不对称分裂，或者分化成为多种类型的视网膜细胞或视网膜色素上皮细胞，或者产生另外两个视网膜祖细胞。因此，应当理解的是，在分化成为神经视网膜祖细胞的培养步骤中包括干细胞分化成为视网膜细胞以及神经视网膜祖细胞期间所产生的各种类型的细胞。神经视网膜祖细胞通过表达选自以下的至少一种、两种或三种标志物来表征Rax、Pax6、ChxlO 和 Crx。除了表达这些标志物之外，神经视网膜祖细胞还可以通过表达Crx、恢复蛋白和视紫红质的能力来表征，所述Crx、恢复蛋白和视紫红质是下一分化阶段的细胞，即感光细胞前体细胞和感光细胞的标志物。相反，观察到神经视网膜祖细胞的以下标志物的表达水平降低0tX2、SOX2、Lhx2、SiX3、SiX6和Mitf，这些是表明它们自身为前一分化阶段的视网膜祖细胞的特征标志物。
本文所用的术语“视网膜色素上皮祖细胞”意指偏爱视网膜色素上皮的分化的视网膜祖细胞。视网膜色素上皮祖细胞通过表达选自Mift和Pax6的一种或多种标志物来表征。在优选实施方案中，可以通过以下步骤来实现从视网膜祖细胞向视网膜细胞的分化(a)在含有Wnt信号转导途径活化剂的组合物中培养干细胞来源的视网膜祖细胞，以使它们分化成为神经视网膜祖细胞；(b)在含有Wnt信号转导途径活化剂的组合物中培养所述神经视网膜祖细胞，以使它们分化成为感光细胞前体细胞；以及(c)在含有fct信号转导途径活化剂的组合物中培养所述感光细胞前体细胞，以使它们分化成为包括感光细胞在内的视网膜细胞。本文所用的术语“感光细胞前体细胞”表示偏爱分化成为感光细胞的前体细胞，通过具有选自Crx (视杆细胞和视锥细胞前体细胞)和Nrl (视杆细胞前体细胞)的一种或多种标志物来表征。除了表达标志物之外，感光细胞前体细胞还可以通过表达恢复蛋白、视紫红质、外周蛋白2和!"oml中的至少一种、两种或三种的能力来表征，这些标志物是分化的感 光细胞特有的。只要其能活化Wnt信号转导途径，任何Wnt信号转导途径活化剂都可以用于本发明中。用于本发明中的Wnt信号转导途径活化剂的实例包括Wntl、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a> Wnt4> Wnt5a> Wnt5b> Wnt6> Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b> Wnt9a> Wnt9b> WntlOa、WntlOb、WntlI、Wnt 16b ;增加P -连环蛋白水平的物质；GSK3抑制剂如锂、LiCl、二价锌、BI0、SB216763、SB415286、CHIR99021、QS11 水合物、TWS119、Kenpaullone、alsterpaullone、靛红_3’ -肟、TDZD-8和Ro 31-8220甲磺酸盐；Axin抑制剂、APC抑制剂、norrin和R-spondin 2，且优选 Wnt3a、Wntl、Wnt5a、WntlI、norrin、LiCl、BIO 和 SB415286。在本发明的优选实施方案中，用于诱导视网膜细胞增殖的组合物含有除LiCl、BI0和SB415286之外的Wnt信号转导途径活化剂，其量为0. 01至500ng/ml，优选量为0. I至200ng/ml，且更优选量为I至100ng/ml。在Wnt信号转导途径活化剂中，培养基中用到的LiCl的量为0. I至50mM，优选量为0. 5至10mM，且更优选量为I至IOmM ;使用BIO的量为0. I至50 ii M，优选量为0. I至10 ii M，且更优选量为0. 5至5 ii M ;使用SB415286的量为0. I至500iiM，优选量为I至100 ii M，且更优选量为5至50 ii M。在改良的实施方案中，培养基可以含有 50ng/ml 的 Wnt3a 或 WntI ；50 或 100ng/ml 的 Wnt5a 和 Wntll ；50ng/ml 的 norrin ；2. 5 或 5mM 的 LiCl ;2 y M 的 BIO 或 30 y M 的 SB415286。在优选实施方案中，步骤(a)中用于诱导视网膜祖细胞分化成为神经视网膜祖细胞的组合物还可以包含IGFlR活化剂、BMP信号转导途径抑制剂和FGF信号转导途径活化齐IJ;步骤(b)中用于诱导神经视网膜祖细胞分化成为感光细胞前体细胞的组合物可以不含BMP信号转导途径抑制剂和FGF信号转导途径活化剂，并且还可以含有Shh (音猬因子)信号转导途径活化剂；以及步骤(c)中用于诱导感光细胞前体细胞分化成为包括感光细胞在内的视网膜细胞的组合物除了还向其中加入RA之外，与步骤(b)的组合物相同，。可以利用本领域内公知的或允许产生视网膜祖细胞的任何技术来产生视网膜祖细胞。优选地，视网膜祖细胞可以通过以下来获得(a’)在含有以下成分的培养基中培养干细胞以使它们分化成为悬浮聚集形式的眼区前体细胞=IGFlR活化剂、Wnt信号转导途径抑制剂和BMP信号转导途径抑制剂；以及(b’)在相同的培养基中培养所述悬浮聚集形式的眼区前体细胞以使它们分化成为视网膜祖细胞，但该培养基还包含FGF信号转导途径活化剂。在优选实施方案中，培养时眼区前体细胞的悬浮聚集物可以在平板上贴壁生长。可以利用本领域内公知的任何粘附细胞的平板。优选地，平板用如下细胞外基质包被例如聚D-赖氨酸、层粘连蛋白、聚L-赖氨酸、基质胶、琼脂、聚鸟氨酸、明胶、胶原蛋白、纤维连接蛋白或玻璃粘连蛋白。最优选用聚D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的平板。每个贴壁的悬浮聚集物的细胞群是最高效的细胞群。优选地，悬浮聚集物由200-400个细胞组成。本发明优选实施方案中所用的干细胞的实例包括但不限于，骨髓干细胞(BMSC)、脐带血干细胞、羊水干细胞、脂肪干细胞、视网膜干细胞(RSC)、视网膜内米勒胶质细胞、胚胎干细胞(ESC)、诱导型多能干细胞(iPSC)和体细胞核移植细胞(SCNTC)，最优选的是人ESC或iPSC。在一实施方案中，iPSC以及人ESC通过本发明的分化方法被成功诱导分化成为包括感光细胞在内的视网膜细胞。
本文所用的术语“眼区前体细胞”指表达前脑神经板的眼区祖细胞中存在的标志物(眼区转录因子；Zuber, et al. , Development, 2003 ；130:5155-67)的细胞团。通过选自Six3、Rax、Pax6、0tx2、Lhx2和Six6中的至少一种、两种或三种标志物来表征眼区前体细胞。本文所用的术语“悬浮聚集物”是指干细胞絮凝物在没有饲养小鼠胚胎成纤维细胞和血清的非贴壁平板中培养至少I天时所产生的培养基中悬浮的细胞团。取决于所用培养基的组成，眼区前体细胞可以表达眼区转录因子。本文所用的术语“Wnt信号转导途径抑制剂”意指阻断细胞外Wnt蛋白与膜蛋白Frizzled受体或LRP之间的相互作用或者抑制细胞内Wnt介导的信号转导的因子(Kawano&Kypta, J Cell Sci. 2003 ;116:2627_34)。只要其能抑制 Wnt 介导的信号转导，任何fct信号转导途径抑制剂都可以用于本发明中。在本发明中使用的fct信号转导途径抑制剂的实例包括Dkk (Dickkopf)家族(Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3和Dkk_4)，其是能够与共受体LRP相互作用的Wnt拮抗剂；Wise ；sFRP (分泌型Frizzled相关蛋白)家族，其作为与Wnt受体结合的Wnt拮抗剂发挥功能；FriZZled-CRD结构域；WIF_1 (Wnt抑制因子-I) ;IWP_2 ；IWP-3 ； IWP-4 ；cerberus ;Wnt抗体；显性负作用的Wnt蛋白；Axin的过表达；GSK (糖原合成酶激酶)过表达；显性负作用的TCF;显性负作用的蓬乱蛋白和酪蛋白激酶抑制剂(CKI-7、D4476 等)，优选 Dkk-1。除了 Wnt信号转导途径抑制剂之外，还可以通过抑制参与Wnt途径的每一种成分来抑制Wnt信号转导，例如用RNAi。在优选实施方案中，IGF-I或IGF-2可以用作IFGlR活化剂，优先考虑IGF-2。用于诱导神经视网膜祖细胞分化成为感光细胞前体细胞的培养基含有IGFlR活化剂，其量为0. 01至100ng/ml,优选量为0. I至50ng/ml,更优选量为I至20ng/ml,最优选量为IOng/ml o在优选实施方案中，BMP信号途径抑制剂的实例包括头蛋白、腱蛋白、扭曲原肠胚形成(Tsg)、cerberus、coco、gremlin、PRDC、DAN、dante、卵泡抑素、USAG-K dorsomorphin和硬化蛋白，优选头蛋白。所述培养基含有BMP信号转导途径抑制剂，其量为0.01至lOOng/ml，优选量为0. I至50ng/ml，更优选量为0. 5至20ng/ml，且最优选量为10ng/ml。作为FGF信号转导途径活化剂，可以使用能活化FGRRlc或FGFR3c的因子、FGF1、FGF2、FGF4、FGF8、FGF9、FGF17或FGF19。优选FGF2。用于诱导视网膜祖细胞分化成为神经视网膜祖细胞的培养基含有FGF信号转导途径活化剂，其量为0. 01至100ng/ml，优选量为0. I至50ng/ml,更优选量为I至20ng/ml,且最优选量为5ng/ml。在优选实施方案中，可用于本发明中的Wnt信号转导途径活化剂的实例包括ffntl> Wnt2> Wnt2b> Wnt3> Wnt3a> Wnt4> Wnt5a> Wnt5b> Wnt6> Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b>Wnt9a、Wnt9b、Wnt 10a、Wnt 10b、WntlI、Wnt 16b ;增加 P -连环蛋白水平的物质；GSK3 抑制剂如锂、LiCl、二价锌、BIO、SB216763、SB415286、CHIR99021、QSll 水合物、TWS119、Kenpaullone、alsterpaullone、親红 _3，-月亏、TDZD-8 和 Ro 31-8220 甲横酸盐；Axin 抑制剂、APC 抑制剂、norrin 和 R-spondin 2,且优选 Wnt3a> Wntl、Wnt5a、WntlI、norrin、LiCl、BIO和SB415286。用于诱导神经视网膜祖细胞分化成为感光细胞前体细胞的培养基含有除 LiCl、BIO和SB415286之外的Wnt信号转导途径活化剂，其量为0. 01至500ng/ml，优选量为0. I至200ng/ml，更优选量为I至100ng/ml。在Wnt信号转导途径活化剂中，培养基中用到的LiCl的量为0. I至50mM，优选量为0. 5至10mM，且更优选量为I至IOmM ;使用BIO的量为0. I至50 ii M，优选量为0. I至10 ii M，且更优选量为0. 5至5 ii M ;使用SB415286的量为0. I至500iiM，优选量为I至IOOii M，且更优选量为5至50 PM。在改良的实施方案中，培养基可以含有 50ng/ml 的 Wnt3a 或 Wntl ;50 或 100ng/ml 的 Wnt5a 和 Wntll ；50ng/ml的 norrin ；2. 5 或 5mM 的 LiCl ;2 y M 的 BIO 或 30 y M 的 SB415286。在优选实施方案中，用于本发明中的Shh信号转导途径活化剂可以是Shh、Ptc与Smo相互作用的抑制剂、Smo受体活化剂、增加Ci/Gli家族水平的物质、Ci/Gli因子细胞内降解的抑制剂或Shh受体活化剂(例如Hg-Ag、purmorphamine等)。优选Shh或purmorphamine0在优选实施方案中，培养基含有Shh信号转导途径活化剂，其量为0. I至5，000ng/ml,优选量为I至2，500ng/ml,更优选量为10至1，000ng/ml,最优选量为250ng/ml。在本发明的一实施方案种，培养基含有量为250ng/ml的Shh或量为I y M的purmorphamine。就分化开始后培养的时间而言，优选步骤(a’)给予1-30天，步骤(b’)为5-15天，步骤(a)为1-30天，步骤(b)为1-30天，以及步骤(C)为1-60天，最优选地，步骤(a’)为4天，步骤(b’)为9天，步骤(a)为5天，步骤(b)为3天，以及步骤(c)为8_15天。在优选实施方案中，仅需花费约29天来完成干细胞至视网膜细胞的分化，从而允许所述方法有效应用于临床治疗。可以通过利用Wnt和BMP信号转导途径的共抑制诱导和促进胚胎发生期间前脑的发育来实现步骤(a’)中向眼区前体细胞的分化(Piccolo, et al. , Nature, 1999 ；397:707-10)。因此，培养基含有作为Wnt信号转导途径抑制剂的Dkk-I，作为BMP抑制剂的头蛋白以及作为IGFlR活化剂的IGF-I (起促进前脑中眼区形成的作用)。Wnt信号转导途径抑制剂、BMP抑制剂和IGFlR活化剂的种类和培养基水平如上文所述。用于步骤(a’)中的培养基含有浓度为0. 01-100ng/ml的IGF-1，浓度为0. 01-10, 000ng/ml的Dkk-I和浓度为0. 01-100ng/ml的头蛋白，最优选含有浓度为5ng/ml的IGF-I，浓度为lng/ml的Dkk-I和浓度为lng/ml的头蛋白。
培养干细胞的任何常规培养基可用于步骤(a’)中诱导向眼区前体细胞的分化。优选含有以下的DMEM/F12 10%knockout血清替代物、ImML-谷氨酰胺、0. ImM非必需氨基酸、0. ImM巯基乙醇和1%B27补充物。步骤(b’)中向视网膜祖细胞的分化可以在含有FGF信号转导途径活化剂，优选FGF2以及步骤(a’)中的因子(即IGFlR活化剂、Wnt信号转导途径抑制剂和BMP抑制剂)
的培养基中。用于步骤(b’)中的培养基含有浓度为0. 01-100ng/ml的IGF-1，浓度为0. 01-10，000ng/ml 的 Dkk_l，浓度为 0. 01-100ng/ml 的头蛋白和浓度为 0. 01-100ng/ml 的FGF2，且最优选含有浓度为10ng/ml的IGF-1，浓度为10ng/ml的Dkk_l，浓度为10ng/ml的头蛋白和浓度为5ng/ml的FGF2。
步骤(b’)中视网膜祖细胞向步骤(a)的神经视网膜祖细胞的分化必须在没有Dkk-I ( 一种Wnt信号转导途径抑制剂)的条件下进行，这是为了有高水平的Pax6表达(Pax6是产生神经视网膜祖细胞所必需的)，并且在含有以下成分的培养基中进行用于促进Wnt途径的Wnt3a、在胚胎发生期间视泡和视杯发育阶段用于将下面的视网膜色素上皮转化为神经视网膜的头蛋白，用于抑制视网膜色素上皮所必需的基因表达和促进神经视网膜祖细胞产生的FGF2，以及负责感光细胞抗凋亡的IGF-I。用于步骤(a)中的培养基含有浓度为0. 01-100ng/ml的IGF-1，浓度为0. 01-100ng/ml 的头蛋白，浓度为 0. 01-100ng/ml 的 FGF2 和浓度为 0. 01-500ng/ml 的Wnt3a,并且最优选含有浓度为10ng/ml的IGF-1,浓度为10ng/ml的头蛋白，浓度为5ng/ml的FGF2和浓度为50ng/ml的Wnt3a。步骤(b)中向感光细胞前体细胞的分化在不含头蛋白和FGF2的培养基中进行，所述头蛋白和FGF2分别抑制Shh信号转导途径和Shh诱导的视紫红质表达，并且该培养基中含有使视杆细胞前体细胞增殖的IGF-1、促进Wnt途径的Wnt3a，以及Shh。步骤(b)中所用的培养基含有浓度为0. 01-100ng/ml的IGF-1，浓度为0. 01-500ng/ml的Wnt3a和浓度为0. 1-5，000ng/ml的Shh,并且最优选地，含有浓度为10ng/ml 的 IGF-1,浓度为 50ng/ml 的 Wnt3a 和浓度为 250ng/ml 的 Shh。步骤(C)中向感光细胞的分化在含有用于进一步促进分化的RA(视黄酸)以及IGF-1、Wnt3a和Shh的组合的培养基中进行。步骤(c)中所用的培养基含有浓度为0. 01-100ng/ml的IGF-1，浓度为0. 01-500ng/ml 的 Wnt3a,浓度为 0. 01-5, 000ng/ml 的 Shh 和浓度为 0. 5-10, OOOnM 的 RA,并且最优选地，含有浓度为10ng/ml的IGF-1,浓度为50ng/ml的Wnt3a,浓度为250ng/ml的Shh和浓度为500nM的RA。在步骤(a)至(c)中，可以使用Wntl、Wnt5a、Wntll、norrin、LiCl、BI0 或 SB415286替代Wnt3a,同时shh可以用purmorphamine替代。用于培养胚胎干细胞的任何常规培养基都可以用作步骤(b’)、(a)、(b)和(C)中的基础培养基。优选含有ImM L-谷氨酰胺、0. ImM非必需氨基酸、0. ImM巯基乙醇、1%B27补充物和1%N2补充物的DMEM/F12。在本发明的一实施方案中，观察到Wnt信号转导途径活化剂在视网膜祖细胞分化成为感光细胞中起重要作用。关于这点，在存在多种浓度的fct信号转导途径抑制剂Dkk-1 (10ng/ml、lOOng/ml和I ii g/ml)下进行分化。具体而言,在以下培养基中诱导hESC来源的视网膜祖细胞分化成为感光细胞含有50ng/ml的Wnt3a，但不含Shh和视黄酸(组I)；不含 Wnt3a 和 Dkk-I (组 II);含有 10ng/ml 的 Dkk-I (组 III);含有 100ng/ml 的 Dkk-I (组IV)；以及含有 I U g/ml 的 Dkk-I (组 V)。因此，随着Dkk-I浓度的升高，感光细胞标志物Crx (p=0. 0247)、恢复蛋白(P=O. 0113)、视紫红质(p=0. 0166)和外周蛋白2 (p=0. 0166)的表达水平显著降低。发现除了组I与组II之间和组IV与组V之间的Crx以及组I与组II之间的恢复蛋白之外，所有组之间都存在统计学显著性(组之间的显著性* P<0. 0001 ;** p=0. 0381)(表10和图24)。这些数据表明，向感光细胞的分化由fct信号转导途径活化剂诱导以及Wnt信号转导途径的抑制导致几乎没有产生感光细胞，这表明fct信号转导途径抑制剂在向感光细胞的分化中起重要作用。另一方面，可以使用Wnt3a和Shh各自的替代物。在这种背景下，在相同条件下进 行相同时间的培养过程，除了用50ng/ml的Wntl ;50和100ng/ml的Wnt5a和Wntll ；50ng/ml 的 norrin ；2. 5 或 5mM 的 LiCl ;2 y M 的 BIO ;或 30 y M 的 SB415286 替代 Wnt3a 作为 Wnt信号转导途径活化剂，并且用purmorphamine作为Shh的替代物。结果是这些替代物以与用Wnt3a和Shh所获得的相似模式产生分化且成熟的感光细胞(实施例12)。发明的实施方式通过以下的实施例可以更好地理解本发明，这些实施例是说明性，不应解释为对本发明的限制。实施例I :干细胞的培养<1-1>人胚胎干细胞的培养人胚胎干细胞(hESC)系H9 (WA09,正常核型XX)和H7 (WA07,正常核型XX)购自WiCell Research Institute(Madison, WI, USA) 通过在以下培养基的饲养细胞上培养使hESC发生未分化的增殖(H9细胞 第25-33 代；H7 细胞 第 23-28 代)DMEM/F12 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) ,20%(v/v) KnockOut 血清替代物(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ImM L-谷氨酸胺(Invitrogen),0. ImM非必需氨基酸(Invitrogen), 0. ImM疏基乙醇(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和4ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF2, Invitrogen),所述饲养细胞例如福射过的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF，ATCC, Manassas, VA, USA)或丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞(EmbryoMax Primary Mouse EmbryoFibroblasts, Millipore, Billerica, MA, USA)。尽管每天更换新鲜的培养基,但每隔6或7天手动或用胶原酶IV(Invitrogen)以1:9-1:15的比例对未分化的干细胞进行传代，然后转移到新鲜的MEF饲养细胞上。在hESC传代期间，用未分化的hESC特有的抗原0CT-4和SSEA-4 (Chemicon, Temecula, CA, USA)在固定的时间间隔进行免疫化学染色，以监测分化的程度。去除所发现的已进行分化的细胞。定期用试剂盒(MycoAlert支原体检测试剂盒，Lonza, Rockland, ME, USA)监测hESC培养物中支原体污染物的存在，该污染物能对hESC的分化造成不利影响。〈1-2>诱导型多能干细胞(iPSC)的培养人iPSC 系 iPS (Foreskin)-l(克隆 I)(正常核型 XY)购自 WiCell ResearchInstitute(Madison, WI, USA)。
通过在以下培养基的饲养细胞上培养人iPSC，使它们发生未分化的增殖(第37-47 代):DMEM/F12(Invitrogen, Grand Island, NY, USA),20%(v/v)KnockOut 血清替代物(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),ImM L-谷氨酸胺(Invitrogen),0. ImM 非必需氨基酸(Invitrogen),0. ImM 疏基乙醇(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和10ng/ml重组人FGF2 (Invitrogen),所述饲养细胞例如福射过的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF，ATCC, Manassas, VA，USA)或丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞(EmbryoMaxPrimaryMouse Embryo Fibroblasts, Millipore, Billerica, MA, USA)。尽管每天更换新鲜的培养基,但每隔6或7天手动或用胶原酶IV(Invitrogen)以1:4-1:6的比例对未分化的干细胞进行传代，然后转移到新鲜的MEF饲养细胞上。在hESC传代期间，用未分化的人iPSC特有的抗原SSEA-4 (Chemicon, Temecula, CA, USA)和Nanog(abeam, Cambridge, MA, USA)在固定的时间间隔进行免疫化学染色，以监测分化的程度。去除经鉴定已进行分化的细胞。定期用试剂盒(MycoAlert支原体检测试剂盒，Lonza, Rockland, ME, USA)监测 hESC培养物中支原体污染物的存在，该污染物能对hESC的分化造成不利影响。实施例2 :从hESC或人iPSC向眼区前体细胞的分化将实施例I中培养的hESC或人iPSC与MEF细胞分离(图I和图14)，并接种至6孔超低吸附平板(Corning Incorporated, Corning, NY, USA) 向6孔超低吸附平板中的hESC或人iPSC添加能诱导向眼区前体细胞分化的培养基[DMEM/F12，10%Knock0ut血清替代物，ImM L-谷氨酰胺，0. ImM非必需氨基酸，0. ImM巯基乙醇，1%B27 补充物(Invitrogen), lng/ml 重组头蛋白(R&D Systems), lng/ml 重组 Dkk-1 (Dickkopf-1, R&D Sytstems)和 5ng/ml 重组 IGF-I (胰岛素样生长因子 _1，R&DSystems)]。将细胞培养4_5天，以产生悬浮聚集形式的眼区前体细胞，每隔三天更换一次新鲜的培养基(图I)。实施例3 :从眼区前体细胞向视网膜祖细胞的分化将实施例2中产生的眼区前体细胞(悬浮聚集物)以每孔53±8个细胞的密度(292±53个细胞/悬浮聚集物)接种至6孔聚D赖氨酸/层粘连蛋白包被的平板(BDBiosciences),并以每孔12±4个细胞的密度接种至8孔聚D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的平板，然后提供能诱导向视网膜祖细胞分化的培养基[DMEM/F12 (Invitrogen)，ImM L-谷氨酸胺(Invitrogen) ,0. ImM非必需氨基酸(Invitrogen) ,0. ImM疏基乙醇(Sigma-Aldrich)，1%B27 补充物，1%N2 补充物(Invitrogen), 10ng/ml Dkk_l, 10ng/ml 头蛋白，10ng/ml IGF-1和5ng/ml FGF2]，培养9天，以产生视网膜祖细胞。实施例4 :从视网膜祖细胞向神经视网膜祖细胞的分化为了使实施例3中所产生的视网膜祖细胞分化成为神经视网膜祖细胞，在诱导后第3天去除Dkk-I供应，并提供含有头蛋白、IGF-1、FGF2和Wnt3a组合的培养基，持续5天(图I)。所述培养基由以下组成[DMEM/F 12 (Invitrogen), ImM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0. ImM 非必需氨基酸(Invitrogen)，0. ImM 疏基乙醇(Sigma-Aldrich)，1%B27 补充物(Invitrogen)，1%N2 补充物(Invitrogen)，10ng/ml 头蛋白，10ng/ml IGF-1,5ng/ml FGF2 及 50ng/ml 重组 Wnt3a(R&D Systems)]。实施例5 :从神经视网膜祖细胞向感光细胞前体细胞的分化
将实施例4中产生的神经视网膜祖细胞在所提供的培养基[DMEM/F12 (Invitrogen), ImM L-谷氨酸胺(Invitrogen), 0. ImM 非必需氨基酸(Invitrogen),0. ImM疏基乙醇(Sigma-Aldrich), 1%B27补充物(Invitrogen), 1%N2补充物(Invitrogen),10ng/ml IGF-1, 50ng/ml Wnt3a 和 250ng/ml 重组 Shh (音猬因子氨基末端妝，Shh, R&DSystems)]中培养3天,从而诱导分化成为感光细胞前体细胞。从所述培养基中去除前面步骤中用到的头蛋白和FGF2(图I)。
实施例6 :从感光细胞前体细胞向感光细胞的分化通过提供特化培养基[DMEM/F12(Invitrogen), ImM L-谷氨酰胺(Invitrogen),0. ImM 非必需氨基酸(Invitrogen), 0. ImM 疏基乙醇(Sigma-Aldrich), 1%B27 补充物(Invitrogen), 1%N2 补充物(Invitrogen), 10ng/ml IGF-1, 50ng/ml Wnt3a, 250ng/ml Shh,500nM (全反式视黄酸(RA, Sigma-Aldrich) ] 8天或更长时间来诱导感光细胞前体细胞分化成为感光细胞。在实施例2-6中，每隔2或3天将所有培养基更换成新鲜的培养基，并将细胞在37° C下5%0)2的环境中培养。所有诱导和分化实验重复至少三次，并都获得了相同的结果。实施例7 :细胞分化相关标志物的测定<7-1>细胞分化相关标志物表达的免疫化学染色和鉴定利用如下的免疫化学染色法检测实施例3至6中所获得的细胞的分化。在与用于向视网膜祖细胞、神经视网膜祖细胞、感光细胞前体细胞和感光细胞分化相同的条件下，在8孔聚D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的载玻片中(BD Biosciences, Bedford, MA)培养眼区前体细胞(悬浮聚集物)。用4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich)固定每步中充分培养的细胞，之后用含有3%BSA(Jackson Immunoresearch Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)和 0.25%TritonX-100 (Sigma-Aldrich)的PBS封闭非特异性反应。封闭90分钟之后，在4 ° C下利用以下对每个分化步骤的细胞特异的抗体过夜孵育每个分化步骤的载玻片兔-蓝视蛋白(I: 500，Chemicon)、绵羊-ChxlO(1:100，Chemicon)、兔-Crx(1:200，Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA, USA)、兔-GFAP (1:200, Invitrogen)、小鼠-人特异的线粒体(I: 50, Chemicon)、兔-人特异的线粒体(I 200, Chemicon)、小鼠-Isletl (1:10, Developmental StudiesHydroma Bank, DSHB ； Iowa City,IA, USA)> 小鼠 _Ki67(1:100，Vector Laboratories,Peterborough, England)> 小鼠-Mitf(1:1，000，abeam, Cambridge, MA, USA)、小鼠-巢蛋白(I 250，BD Sciences)、兔-神经丝蛋白-200 (I: I, 000，Sigma-Aldrich)、兔-0tx2 (1:100, abeam)、兔 _Pax2 (1:250, abeam)、小鼠 _Pax6 (1:2, DSHB)、小鼠-夕卜周蛋白 2(1:500, GenScript, Piscataway, NJ, USA)> 兔-Rax(1:250，abeam)、兔-恢复蛋白(1:1，000, Chemicon)、视网膜色素上皮 65 (RPE65, 1:100, Chemicon)、兔-视紫红质(1:500, Sigma-Aldrich)、小鼠-视紫红质(1:500, Ret-Pl, Lab Vision, Fremont, CA, USA)、小鼠-视紫红质(1:2, 000, Ret-Pl, Sigma-Aldrich) > 小鼠-roml (1:50，ABR-AffinityBioreagents, Golden, CO,USA)> 兔-PDE60 (1:100，abeam)、兔-光导蛋白(I:500，Santa Cruz Biotechnology) > 小鼠-PKC-a (1:500,Sigma-Aldrich) > 小鼠-Proxl(1:2，000，Chemicon)、小鼠 _Sox2(1:250，R&D Systems)> 兔-突触蛋白(1:2, 000, Santa CruzBiotechnology)和兔-ZO-l (1:100, Zymed-Invitrogen)。使用之前，将这些抗体稀释于含1%BSA和0. 25%Triton X-100的PBS溶液中。用PBS将每步载玻片上培养的细胞洗涤三次，每次5分钟，并用与Cy3偶联的种特异性二抗(1:800, Jackson Immunoresearch Laboratory)或与 Alexa488 偶联的种特异性二抗(1:500，Invitrogen)在室温下孵育2小时。适于作为一抗和二抗的标准材料用来检测非特异性染色或抗体间的相互作用。然后，用PBS将细胞洗涤三次，每次5分钟，用 DAPI (4，，6_ 二脉基 _2_ 苯基卩引噪)复染并在 Vectashield (Vector Laboratories)中封片，随后在落射荧光显微镜(Nikon Eclipse, E800, Tokyo, Japan)和共聚焦显微镜(Leica, Leica Microsystems Inc,Bannockburn,IL, USA or ZeissLSM510, CarlZeiss, Inc, Thornwood, NY, USA)下显像。从在200倍放大倍数下随机选择的20个显微镜视野计数500个细胞，并评价对每 种抗体的阳性应答。在评价至少三次之后，确定对抗体的阳性应答。利用MedCalc 8. I. 1.0版的 Kruskal-Wallis 检验和 Bland-Altman 图(Bland and Altman, 1986)以及 SAS 9. I 版的GEE (Generalized Estimating Equations)模型对数据进行统计学分析。将所有数据表示为平均值土平均值的标准误差(S. E. M)，p〈0. 05为统计学显著。对于前脑眼区前体细胞和视网膜祖细胞的特征标志物，发现在实施例3中所产生的视网膜祖细胞中表达的Rax的阳性率为86. 6±3. 0%，Pax6的阳性率为63. 9±0. 9%，0tx2的阳性率为76. 4±2. 0%，Sox2的阳性率为83. 0± I. 9%以及ChxlO的阳性率为46.3±1.0%。还发现细胞表达视网膜色素上皮祖细胞的特征标志物Mitf的阳性率为
17.2±0. 4%，神经祖细胞特有的标志物巢蛋白的阳性率为65. 7±2. 7%(表I和表2)。表I标志物水平随培养时间的变化
^■士此平均值士S.E.M.(%,样品大小=3)_
13天18天 I 21天30天
Rax 86^6 (±3.0) 98.2 (±0.9) 97.6 (±0.6) 97.8 (士0.7)
Pax6 63.9 ( 士 0.9) 89.1 (±2.5) 61.6(+0.5) 89.7(+1.9)
Otx2 76.4 (士2.0) 61.5 (士0.6) 63.3 (±2.9) 512 (±2.4)
Sox2 丨83.0 (士1.9) 168.1 (士I. I) [49.1 (士1.6) |69.1 (士4.0)
ChxlO~丨46.3 (±1.0) 丨64.5 (±1.6) 48.5 (±3.9) 41.6 (±2.0)
Nestin 165.7 (±2.7) Il8.0 (±1.4) |14.3(士2.3) |8.5 (二0.9)
Mitf |.17.2(士0.4) 2.7(=1.0) |.18.6(士.1.3) ,24.7 (±0.3)在实施例4中所产生的神经视网膜祖细胞中，同时地，Pax 6的阳性率从63. 9%增至 89. 1%，Rax 从 86. 6% 增至 98. 2%。ChxlO 从 46. 3% 增至 64. 5%(p<0. 0001)，这表明神经视网膜祖细胞(Rax+和Pax6+阳性)的增殖导致Pax 6的阳性率的增加(表I和表2)。表2培养时间之间的视网膜细胞标志物的统计学显著性^标士热统计学显著性(P值)
__13天对18天__18天对21天21天对30天
Rax<0.00010.53080.7897
Pax6<0.0001<0.0001<0.0001
Otx2< 0.()0010.45960.0505
Sox2< 0.0001 一<0.0001<0.0001 —
ChxlO<0.000 ] —<0.00010.0531 — Nestin<0.00010.10770.0010
Mitf< 0.000 j<0.00010.0134统计学显著性p〈0. 05如表I和表2所示，神经祖细胞标志物巢蛋白的阳性率从65. 7%显著下降至
18.0%(p〈0. 0001)，从这可以理解，在分化第18天时，神经祖细胞的增殖被抑制，而神经视网膜细胞的增殖和分化被促进。另一方面，增殖性细胞标志物Ki67从87. 5%快速下降至31. 5%(p〈0. 0001)，这表明分化比增殖的活性高(图2以及表3和表4)。表3视网膜细胞标志物的表达水平随培养时间的变化
士一士仏~ 平均值士S.E.M. (%,样品大小=3)
13AT一~21 天30 天
Crx12.8(士 1.6) 一 80.1 (±0.2) ~ 54.8 (土4.2) 39.5 (±7A)~
恢复蛋白35.8 (士0.4) 一 68.5 (士2.6) 61.3 (±1.8) 82.4 (±46)~
视紫红质35.3 (士 1.7)— 52.9 (士3.4) 60.4 (土3.2) 81.2 (士2.5)
外周蛋白 25.6 (±0.3) 13.9 (±2.4) 26.0 (±0.4) 41.2 (±2.0)
KI6787.5 (±1.3)| 31.5 (士0.5)| 58.4 (±4.1)[ 30.2 (±6.1)表4培养时间之间的视网膜细胞标志物的统计学显著性
标士物^ 统计学差异(P值)—
^13天对18天18天对21天21天对30天
Crx<0.0001 ~<0.00010.0326 —
恢复蛋白<0.0001 —0.0079<0.0001 一
视紫红质<0.0001 —0.0489< 0.0001 一
外周蛋白 2<0.0001<0.0001< 0.0001
Ki67<0.0001<0.0001< 0.0001*统计学显著性p〈0. 05感光细胞前体细胞标志物Crx的阳性率显示从添加Wnt3a之前的12. 8%显著增加至添加fct3a之后的80. l%(p<0. 0001)(图2以及表3和表4)。还在以下标志物中发现表达水平的增加通用感光细胞标志物恢复蛋白从35. 8%增加至68. 5%(p〈0. 0001)，视杆细胞标志物视紫红质从35. 3%增加至52. 9%(p〈0. 0001)，以及感光细胞外段标志物外周蛋白2从5. 6%增加至13. 9%(p〈0. 0001)(图2，表3和表4)。早期色素上皮祖细胞的抗原标志物 Mitf (Baumer, et al.，Development, 2003 ; 130:2903-15)显示出阳性率从 17. 2% 下降至2. 7%(p〈0. 0001)(表I和表2)。此外，发现视网膜祖细胞标志物0tx2(p〈0. 0001)和Sox2(p<0. 0001)的阳性率下降，意味着向神经视网膜祖细胞分化。实施例5中所产生的感光细胞前体细胞中，检测到视网膜祖细胞和神经视网膜祖细胞的标志物的表达水平下降，包括Pax6 (从89. 1%下降至61. 6%, p〈0. 0001)、ChxlO (从64. 5% 下降至 48. 5%, p〈0. 0001)和 Sox2 (从 68. 1% 下降至 49. 1%, p〈0. 0001)(表 I 和表 2)。还检测到感光细胞前体细胞标志物Crx从80. 1%下降至54. 8%(p〈0. 0001)(图2，表3和表4)。另一方面，检测到感光细胞标志物视紫红质(从52. 9%至60. 5%, p=0. 0489)和感光细胞外段标志物外周蛋白2(从13. 9%至26. 0%, p<0. 0001)的表达水平下降，这表明感光细胞的分化和成熟(图2，表3和表4)。此外，Ki67阳性率的下降被逆转，从31. 5%增加至58. 4%(p〈0. 0001)(图2，表3和4)，从这可以理解，Shh开始促进细胞增殖。如通过定量抗原测定所测量的，通过实施例6用于向感光细胞分化的方法所产生的细胞群中，发现高达82. 4 ± 4. 6%的细胞对恢复蛋白的反应为阳性，恢复蛋白为感光细胞(视杆细胞和视锥细胞)的通用标志物(图3)。此外，定量抗原测定表明，细胞群的81. 2±2. 5%对视紫红质为阳性，视紫红质是视杆细胞的特征抗原(图3)。几乎所有视紫红质阳性细胞显示出对恢复蛋白的阳性反应这一事实确保了阳性应答的可靠性。利用人特异性重组视紫红质(由人视紫红质的第二细胞外环的氨基酸组成)和Ret-Pl (由视紫红质的第4至10位的N-末端氨基酸组成)来更精确地确定通过本发明方法形成的视紫红质分子的存在和完整性，所述人特异性重组视紫红质和Ret-Pl是识别不同表位的视紫红质抗体。如通过Bland-Altman图测量,发现人特异性重组视紫红质和Ret-Pl具有相同的阳性率，二者之间的统计学差异显著(两个抗体之间的阳性率差异的平均值-1. 00，95%置信区间-13. 6-11. 6)。与人特异性重组视紫红质和Ret-Pl抗体反应的细胞在阳性率上几乎都没有差别。这意味着按照本发明方法形成的视紫红质分子在其中保留了两个不同的表位。在所培养的细胞群中，阳性检测到的视杆细胞外段标志物外周蛋白2(Prph2)和roml (视网膜外段膜蛋白I)分别为41.2±2.0%和76.0±4.6%(图4)。仅在视紫红质阳性细胞中观察到这两种标志物(图4)。测量出感光细胞中光导蛋白(其响应于光，即参与调控可见光的光转换)的阳性率为49. 8±2. 2%(图5)，以及突触蛋白(其负责与其它视网膜 内神经元发生突触相互作用)的阳性率为43. 0±2. 0%(图6)。这些事实证明，这些细胞参与视网膜的神经元回路，并发挥将光刺激转换为神经电刺激的功能。总之，上文获得的数据表明本发明的方法能高效地使人胚胎干细胞分化成为感光细胞。在所有细胞的80. 2±0. 6%中观察到蓝视蛋白-视锥细胞(图7)。发现这些细胞来自视紫红质阳性细胞絮凝物或其附近，这些细胞中的一些对视紫红质和蓝视蛋白均为阳性。因此，证明本发明的方法能够诱导人胚胎干细胞分化成为视杆细胞和视锥细胞。在所有细胞群中，39. 5±7. 4%对感光细胞前体细胞的特征标志物Crx为阳性，30. 2±6. 1%对增殖细胞(细胞循环中的Gl晚期至M期)的细胞核标志物Ki67为阳性。据报道，感光细胞前体细胞在离开细胞增殖周期之后立即表达Crx。此外，在本发明中，观察到大多数人ESC来源的Crx阳性细胞对与细胞增殖相关的标志物Ki67是阴性的。然而，发现Crx阳性细胞以5. 5±1. 7%的阳性率表达Ki67(图9)。从上文所获得的数据中显而易见的是，本发明的方法能以与从胚胎视网膜祖细胞分化相同的多步诱导模式从人ESC来源的视网膜祖细胞有效分化成感光细胞，在从胚胎视网膜祖细胞的分化中，分化沿早期和晚期胚胎阶段逐步进行。视网膜祖细胞标志物Pax6的阳性率为89. 7±1.9%，并且在无长突细胞中检测到，所述无长突细胞是一类分化的视网膜神经元。同时，视网膜祖细胞表达Mitf (视网膜色素上皮(RPE)祖细胞的一种标志物)的阳性率为24. 7±0. 3%，表达ZO-I (分化的RPE标志物)的阳性率为12. 5 + 1. 4%，并且对RPE65 (分化的RPE的标志物)也为阳性(图10)。<7-2>细胞分化相关标志物的RT-PCR和RNA mRNA表达为了检测实施例6中所产生的感光细胞的分化，在分化诱导的第29天时，进行逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)。用RNeasy 小提试剂盒(Qiagen, Valencia, CA, USA)分离总 RNA,并利用DNaseI (Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX, USA)从 RNA 分离物中去除 DNA。在逆转录酶(Omniscript逆转录酶，Qiagen)的存在下,用随机六聚体(Invitrogen)作为引物,将500g RNA 逆转录成 cDNA。对于 PCR，使用 Ix PCR 缓冲液、1.5mM MgCl2、0. 2mM dNTP、50ngDNA、0. 5U AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)和 IOpmoles 的以下表5中给出的每种引物。表5RT-PCR的正向和反向引物序列
权利要求
1.用于诱导视网膜细胞增殖的组合物，其包含fct信号转导途径活化剂。
2.如权利要求I所述的组合物，其中所述视网膜细胞是感光细胞。
3.如权利要求I所述的组合物，其中所述视网膜细胞是人来源的细胞。
4.如权利要求I至3中任一项所述的组合物，其中所述Wnt信号转导途径活化剂选自WntK Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wntl0a、Wntl0b、Wntll、Wntl6b ;增加 β -连环蛋白表达水平的物质；Axin 抑制剂；APC(腺瘤性息肉病)抑制剂；norrin ；R-spondin 2及以上的组合。
5.如权利要求4所述的组合物，所述Wnt信号转导途径活化剂选自Wntl、Wnt3a、Wnt5a> WntlI、norrin 及以上的组合。
6.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述Wnt信号转导途径活化剂是GSK3 (糖原合酶激酶3)抑制剂。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述GSK3抑制剂选自锂(Li)、LiCl、ニ价锌(ニ价 Zn)、BI0(6-溴靛玉红-3’ -肟)、SB216763、SB415286、CHIR99021、QS 11 水合物、TffS119、kenpaullone、alsterpaullone、青定红-3’ -月亏、TDZD-8、Ro 31-8220 甲横酸盐及以上的组合。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述GSK3抑制剂选自LiCl、BIO(6-溴靛玉红-3’ -肟)、SB415286及以上的组合。
9.如权利要求4所述的组合物，其中在培养基中使用的所述Wnt信号转导途径活化剂的浓度为O. 01至500ng/ml。
10.如权利要求9所述的组合物，其中在培养基中使用的所述Wnt信号转导途径活化剂的浓度为I至100ng/ml。
11.如权利要求7所述的组合物，其中培养基中使用的除LiCl、BIO和SB415286之外的GSK抑制剂的浓度为O. 01至500ng/ml。
12.如权利要求11所述的组合物，其中培养基中使用的除LiCl、BI0和SB415286之外的GSK抑制剂的浓度为I至100ng/ml。
13.如权利要求7所述的组合物，其中培养基中使用的LiCl的浓度为O.I至50mM ；BI0的浓度为O. I至50 μ M ;以及SB415286的浓度为O. I至500 μ Μ。
14.如权利要求13所述的组合物，其中培养基中使用的LiCl的浓度为I至IOmM；ΒΙ0的浓度为O. 5至5 μ M ;以及SB415286的浓度为5至50 μ Μ。
15.用于诱导视网膜祖细胞分化成为视网膜细胞的组合物，其包含fct信号转导途径活化剂。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述视网膜细胞是感光细胞。
17.如权利要求15所述的组合物，其中通过以下步骤来诱导分化 (a)在含有Wnt信号转导途径活化剂的培养基中培养视网膜祖细胞，从而使它们分化成为神经视网膜祖细胞； (b)在含有fct信号转导途径活化剂的培养基中培养步骤(a)的神经视网膜祖细胞，从而使它们分化成为感光细胞前体细胞；以及 (c)在含有Wnt信号转导途径活化剂的培养基中培养步骤(b)的感光细胞前体细胞，从而使它们分化成为感光细胞或包括感光细胞在内的视网膜细胞。
18.如权利要求15至17中任一项所述的组合物，其中所述Wnt信号转导途径活化剂选自 Wntl、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wntl0a、Wntl0b、Wntll、Wntl6b ;增加 β -连环蛋白表达水平的物质；Axin 抑制剂；APC(腺瘤性息肉病)抑制剂；norrin ；R-spondin 2及以上的组合。
19.如权利要求18所述的组合物，所述Wnt信号转导途径活化剂选自Wntl、Wnt3a、Wnt5a> Wntl I、norrin 及以上的组合。
20.如权利要求15至17中任一项所述的组合物，其中所述Wnt信号转导途径活化剂是GSK3 (糖原合酶激酶3)抑制剂。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述GSK3抑制剂选自锂(Li)、LiCl、ニ价锌(ニ价 Zn)、BI0(6-溴靛玉红-3’ -肟)、SB216763、SB415286、CHIR99021、QS 11 水合物、TffS119、kenpaullone、alsterpaullone、青定红-3’ -月亏、TDZD-8、Ro 31-8220 甲横酸盐及以上的组合。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述GSK3抑制剂选自LiCl、BI0(6-溴靛玉红-3’ -肟)、SB415286及以上的组合。
23.如权利要求15所述的组合物，其中在培养基中使用的所述Wnt信号转导途径活化剂的浓度为O. 01至500ng/ml。
24.如权利要求23所述的组合物，其中在培养基中使用的所述Wnt信号转导途径活化剂的浓度为I至100ng/ml。
25.如权利要求21所述的组合物，其中在培养基中使用的除LiCl、BI0和SB415286之外的GSK抑制剂的浓度为O. 01至500ng/ml。
26.如权利要求25所述的组合物，其中在培养基中使用的除LiCl、BI0和SB415286之外的GSK抑制剂的浓度为I至100ng/ml。
27.如权利要求21所述的组合物，其中在培养基中使用的LiCl的浓度为O.I至50mM ；BIO的浓度为O. I至50 μ M ;以及SB415286的浓度为O. I至500 μ Μ。
28.如权利要求27所述的组合物，其中在培养基中使用的LiCl的浓度为I至IOmM;BIO的浓度为O. 5至5 μ M ;以及SB415286的浓度为5至50 μ Μ。
全文摘要
公开了用于诱导视网膜细胞增殖或视网膜祖细胞分化成为视网膜细胞的组合物。与胚胎发生期间体内的发育条件相似，所述组合物在无需其它基因转移的情况下就能诱导干细胞在短期内以高产量分化成为多个感光细胞。此外，分化的感光细胞可用于细胞疗法，因为被植入入退化或受损的视网膜中时，它们能植入并融合入视网膜中，从而预防或治愈视网膜退化。
文档编号C12N5/071GK102712901SQ201080058119
公开日2012年10月3日 申请日期2010年10月6日 优先权日2009年10月6日
发明者朴圣燮, 金志妍 申请人:金志妍, 首尔大学校 产学协力团