专利名称：一种用于多重lamp检测的微流控芯片及其制备方法
技术领域：
本发明属于核酸等温扩增技术领域，具体涉及一种用于多重LAMP检测的微流控芯片及其制备方法和用途。
背景技术：
等温核酸扩增是相对聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)变温核酸扩增而言的。该技术可以不依赖温度循环仪等昂贵仪器，在恒定温度下就可以大量扩增核酸，近年来受到学术界和产业界的高度重视，相继开发出多种类型的等温核酸扩增。环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)最早由日本科学家发明，该技术具有灵敏度高，特异性好，反应速度快，反应结果可以直接肉眼判定等优点， 经过近10年的学术研究和临床验证，取得了近400项项关专利，并以各种检测试剂盒的形式进入市场。但是LAMP反应的“等温模式”和其复杂的核酸探针使其不能实现一个样品中多种目标物的同时检测，即多重检测(即同时检测一个样品中多种目标物)。微流控芯片技术的发展为我们提供了一个十分有效的解决方案。本发明在有关项目的支持下，利用微流控芯片相关技术顺利地攻克了 LAMP检测的多重性难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以用于多重LAMP检测的微流控芯片及其制备方法和用途。本发明提供的用于多重LAMP检测的微流控芯片，在结构上主要包括三个部分扩增池，连接管道和毛细管通道。见附图1所示。扩增池中包被上针对目标物的特异性探针。 扩增池可以按各种形式空间有序排列，如阵列状或发散状等。其数量可以根据目标物检测的需求设计，如三重，五重或十重等等，不受限制。空间有序排列的系列扩增池通过信号的空间区分来实现多重LAMP信号的有效区分。毛细管通道主要是利用其物理限域(低质量传递系数)的特性限制每个扩增池中的特异核酸探针和反应产物在不同池中的交叉污染，即毛细管的小尺度结构使其中的流体具有很小的扩散系数，可以有效阻止LAMP引物，扩增产物和副产物0Π焦磷酸镁等)在不同扩增池之间的相互交叉混合。同时也利用毛细管的拉力便于样品和反应液的进样。扩增池和毛细管之间用连接管道连通，使流体平稳均勻的从毛细管通道流入扩增池，并避免反应过程中形成汽泡。本发明还提供上述微流控芯片的制备方法，具体步骤如下 1)芯片模板的制作利用传统MEMS的方法制作芯片模板。2)芯片浇注，脱气，固化将二甲基硅氧烷和固化剂混合均勻后，倾倒于芯片模板上，真空脱气，高温固化。3)芯片打孔，封合用注射器针头在芯片进样处打孔，通过等离子处理后，与玻片永久键合。4)功能化芯片将被检核酸目标物对应的探针通过注入-蒸发法包被于芯片对应的扩增池中，完成功能化芯片。本发明方法可以制成各种类型(包括芯片尺寸大小，扩增池排列和数目等)的聚合物多重LAMP检测芯片。而且通过注入-蒸发法可以很方便的完成各种功能芯片，且不产生交叉污染。
本发明的微流控芯片的验证
本发明利用LAMP扩增体系对芯片的有效性进行验证。在十通道微流控芯片中，在第1， 2，3，4扩增池中包被上针对四种核酸目标物的特异性探针(Probe 1，Probe 2，Probe 3，Probe 4)，在第5扩增池中不包被核酸探针。通入样品(含四种目标核酸)，再通入LAMP 反应液，在恒温下LAMP反应30 min-60 min。实验结果如附图2，在包被有目标物探针的扩增池中出现了 LAMP信号(c)白色沉淀，(d)绿色荧光；琼脂糖凝胶电泳中也出现了特征性的LAMP梯状扩增带(e)。而在没有包被核酸探针的扩增池中不出现LAMP信号，电泳分析没有出现扩增条带。使用本发明微流控芯片的基本操作步骤如下
1)样品注入用移液枪将被检样品加到芯片加样池，然后加入一定量的LAMP扩增液。 在毛细管的拉力下，样品和扩增液迅速均勻地分布进入扩增检测池。2)恒温扩增用未固化的聚二甲基硅氧烷将芯片封合，在水浴锅中进行恒温反应约 30 min-60 min。3)结果判断可以直接根据扩增池中白色沉淀产生与否判定检测结果，也可以在紫外灯下根据是否产生荧光来判定结果。与现有技术相比，本发明具有如下优点
1)本发明通过芯片上扩增池空间位置不同实现多重LAMP信号的有效区分，结果直观， 效果明显，不需要借助其他昂贵仪器，非常有利于LAMP方法在基层的推广和应用。2)通过MEMS芯片制作法，可以根据需要实现扩增池在芯片上任意的空间排列。3)该芯片结构模式理论上具有无限的可扩展性，可以根据实际需求完成任意多重的LAMP有效扩增，从而满足临床任意多种病原体的有效快速诊断。4)从加样到结果判定不超过1 h，且操作非常简单方便，非专业人员通过简单示范就可成功操作。
图1多重LAMP的微流控芯片结构。图2用于多重LAMP的微流控芯片的效果验证。图3三种流感病毒的多重LAMP芯片快速分型检测。图4八种重要猪病病原体的多重LAMP芯片分型检测。
具体实施例方式下面结合具体实例对本发明做进一步描述，但具体实例并不对本发明做任何限定。实施例1甲型流感病毒(Flu A virus)，季节性甲型流感病毒(kasonalflu A virus)和2009年猪源性甲型流感病毒(Pandemic flu A virus)快速分型检测。
芯片具体设计尺寸扩增池的尺寸为(长10 mm,宽0. 6 mm,深0. 8 mm)；毛细管通道的尺寸为(长2 mm,宽0. 1 mm,深0. 1 mm)。将三种流感病毒的特异性LAMP探针分别包被于第1一第4扩增池1(1’)，2(2'), 3(3’)；扩增池W)包被上阳性对照LAMP探针；第5扩增池5 (5’)不包被探针，作为空白对照。我们用该功能性芯片检测分型三种重要流感病毒。分别取4 μ L三种病毒标准品液和临床参考品，加到芯片加样孔，然后加入46 μ L LAMP扩增液，封闭芯片，置65°C水浴锅lh。结果如附图3和附表1:
对于三种标准品，相应的扩增池中出现LAMP信号(白色沉淀，a-f,或绿色荧光 a’_f’)，其他扩增池不出现信号。对于三种临床参考品，所得结果也同预计相符，甲流病毒对照2(2’)，W )扩增池信号，季节性甲流病毒对照1(1’)，2(2')和W)扩增池信号，猪源性甲流病毒对照 2(2’)，3(3’ )和4(4’ )扩增池信号。结果符合预计，4(4’ )扩增池出现扩增信号说明样品中含有人基因组的核酸序列。同时我们将此芯片应用于8株临床样本的检测，检测结果如附表1。样品1，2，3，4 检测结果显示出样品为猪源性流感病毒，样品5，6可能同时含有三种流感病毒，样品7，8不含该三种流感病毒，检测结果基本同医院检测相符。所有检测样品，芯片阴性扩增池中都不出现信号，说明不同扩增池不存在信号杂交现象，检测结果可靠。实施例2，八种重要猪病病毒的分型检测
芯片具体尺寸与上述相同，LAMP多重芯片扩增池1一8分别包被上针对猪口蹄疫病毒 (FMDV)，猪瘟病毒(CSFV)，猪蓝耳病病毒(PRRSV)，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，猪伪狂犬病毒(PRV)，猪细小病毒(PPV)，猪圆环病毒(PCV)，猪流感病毒(SIV)八种重要猪病病毒的LAMP特异核酸探针，形成一个八种猪病病毒的功能分型芯片；9号扩增池包被上其他探针，作为阴性对照；10号扩增池不包被探针，作为空白对照。在芯片加样池中分别加入样品1 (FMDV)，样品2(CSFV)，样品3 (PRRSV)，样品4 (TGEV),样品 5(PRV)，样品 6(PPV)，样品 7(PCV)，样品 8 (SIV),样品 9 (FMDV, CSFV), 样品 10 (FMDV，CSFV, PRRSV)，样品 11 (FMDV, CSFV, PRRSV, TGEV)，样品 12 (FMDV, CSFV, PRRSV, TGEV, PRV)，样品 13 (FMDV, CSFV, PRRSV, TGEV, PRV，PPV)，样品 14 (FMDV, CSFV, PRRSV, TGEV, PRV, PPV, PCV)，样品 15 (FMDV, CSFV, PRRSV, TGEV, PRV, PPV, PCV, SIV)，然后加入LAMP扩增液，封闭芯片，置65°C水浴锅lh。实验结果如附图4 (a-o),根据结果，说明该LAMP多重芯片可以很好地区分八种猪病病毒，也可以判定出样品中目标病原体的类型。表1多重LAMP芯片对三种流感病毒快速分型检测结果
权利要求
1.一种用于多重LAMP检测的微流控芯片，其特征在于由三个基本部分构成扩增池、 毛细管通道和连接管道；其中，所述扩增池为空间有序排列，扩增池中包被上针对目标物的特异性探针，扩增池通过信号的空间区分来实现多重LAMP信号的有效区分；所述毛细管通道用于限制每个扩增池中的特异核酸探针和反应产物在不同池中的交叉污染，同时也用于样品和反应液的进样；所述连接管道用于连通扩增池和毛细管通道，使流体平稳均勻的从毛细管通道流入扩增池，并避免反应过程中形成汽泡。
2.如权利要求1所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于具体步骤为1)芯片模板的制作利用MEMS方法制作芯片模板；2)芯片浇注，脱气，固化将二甲基硅氧烷和固化剂混合均勻后，倾倒于芯片模板上， 真空脱气，高温固化；3)芯片打孔，封合用注射器针头在芯片进样处打孔，通过等离子处理后，与玻片永久键合；4)功能化芯片将被检核酸目标物对应的探针通过注入-蒸发法包被于芯片对应的扩增池中，完成功能化芯片。
3.如权利要求1所述的微流控芯片的使用方法，其特征在于具体步骤为1)样品注入用移液枪将被检样品加到芯片加样池，然后加入LAMP扩增液，在毛细管的拉力下，被检样品和扩增液迅速均勻地分布进入扩增池；2)恒温扩增用未固化的聚二甲基硅氧烷将芯片封合，在水浴锅中恒温反应30min-60min ；3)结果判断直接根据扩增池中白色沉淀产生与否判定检测结果，或者在紫外灯下根据是否产生荧光来判定结果。
全文摘要
本发明属于核酸等温扩增技术领域，具体涉及一种用于多重LAMP检测的微流控芯片及其制备方法。该芯片以高聚物为芯片材料，利用MEMS方法制备而成。该芯片基本结构包括空间有序排列的扩增池，其通过信号的空间区分实现多重LAMP信号的有效区分；毛细管通道，用于阻止LAMP引物、扩增产物和副产物等在不同扩增池之间的相互交叉混合。扩增池和毛细管通道之间由连接管道连通，使流体平稳均匀的从毛细管通道流入扩增池。本发明芯片制作简单，操作方便，为LAMP方法实现临床多种病原体同时检测提供了有效方案。
文档编号C12M1/34GK102199531SQ201110078450
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月30日 优先权日2011年3月30日
发明者孔继烈, 方雪恩, 陈惠 申请人:复旦大学