专利名称：用于hiv基因分型的全基因组探针杂交检测方法
技术领域：
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种用于HIV基因分型的全基因组探针杂交 检测方法。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(HIV)具有高度的基因变异性，根据其基因序列的差异，将其分 为HIV-I型和HIV-2型。目前世界范围内流行的主要为HIV-I型。HIV-I又进一步分为3 个组M组、0组和N组。M组内又可分为A-D，F-H和J、K9个基因亚型，另外还有；34个以上 流行重组型(CRF)。到目前为止，我国的感染者中已经确定了 A、B’、B、C、D、B/C (CRF07-BC、 CRF08-BC)、CRFOl-AE和CRF02-AG 8种亚型。HIV的基因分型最初是依据膜区(env)的 基因序列分析确定的，后来gag区也作为HIV分型的依据。随着更多HIV基因序列的获 得，人们发现依据某个片段进行的基因分型往往并不准确，例如最先人们根据HIV env区的 gpl20和gp41的基因序列确定了 E亚型，后来对其gag区和pol区的序列分析发现其属于 A亚型，因此，将其重新定义为重组亚型CRF01-AE。随着近些年HIV各种重组类型的不断增 多，这种依据部分片段的基因序列进行亚型鉴定的方法越来越受到局限性。依据最新的HIV 分类和命名原则，要确定新的亚型必须进行全基因序列分析。HIV基因亚型的检测的最经典方法是基因测序分析，该方法存在以下明显局限性 (1)技术难度大，要求高该方法中无论是基因扩增、基因测序还是生物信息学分析，需要非 常专业的高端技术人员才能完成，只有在少数高端实验室才能完成。(2)设备昂贵，检测周 期长，基因测序仪一般都在200万元以上，一个完整的分析周期至少得两周左右。(3)很难 进行全基因序列分析由于测序费用的昂贵和周期问题，一般都采用测定部分基因片段对 HIV进行亚型分析，如前所述，这种来自于部分信息的分析往往会不完全准确。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于HIV基因分型的全基因组探针杂交 检测方法。该方法可用于简便、快速和更准确地确定HIV的基因亚型。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是
一种用于HIV基因分型的全基因组探针杂交检测方法，该方法包括以下步骤
(1)制备待测样品的cDNA;
(2)设计并制备出PCR扩增引物；所述引物为序列表中SEQID No: 76- No: 87所示 的核苷酸序列；
(3)使用步骤(2)中所述引物采用巢氏PCR方法对步骤(1)中所述cDNA进行PCR扩
增；
(4)纯化上述扩增产物；
(5)标记纯化的扩增产物使用巢式PCR扩增的第二轮反向引物和荧光素Cy5-dCTP进 行标记；(6)将标记产物与基因芯片杂交、洗涤；
其中，所述基因芯片为包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡 核苷酸探针为序列表中SEQ ID No: 1- No: 75所示的核苷酸序列；
(7)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果，从而确定所检测的基因亚型。进一步地，在所述步骤(3)中，使用步骤(2)中所述引物采用巢氏PCR方法对步骤 (1)中所述cDNA分三段分别进行二轮PCR扩增。进一步地，在所述步骤(5 )中，使用巢式PCR扩增的第二轮反向引物分三段和荧光 素Cy5_dCTP进行标记。进一步地，在所述步骤(6)中，杂交温度为40°C，杂交时间为16h。进一步地，所述基因芯片的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯或载玻 片。本发明的有益效果通过对待检样品的扩增和标记，利用本发明的基因芯片可以 直接对HIV的基因亚型进行判断。无需复杂的专业分析，具有简单、快捷，成本低等优点，并 且，本发明中芯片使用的探针是针对HIV全基因组设计，这样对HIV分型的结果就更加准确 禾口可靠°
图1基因芯片杂交后的扫描结果图(07BC)； 图2基因芯片杂交后的扫描结果图(B)；
图3基因芯片杂交后的扫描结果图(01AE)。具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于 限制本发明的保护范围。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1寡核苷酸探针的制备 1.探针的设计
根据国际HIV数据库http //www. hiv. lanl. gov得到各种基因亚型的HIV参考全基因 序列，使用ClustalX 1. 83基因序列进行比对，找出靶基因中的种内保守区和种间特异区， 然后再使用I^rimer premier 5. 0软件在此区设计探针。探针序列如表1。探针的设计应 遵循以下原则(1)探针之间的Tm值相差不要超过5°C，探针长度为不超过25个碱基；(2) 探针的G+C含量在40-60%之间；(3)避免有5个以上重复碱基。表1探针序列
权利要求
1.一种用于Hiv基因分型的全基因组探针杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以 下步骤(1)制备待测样品的cDNA;(2)设计并制备出PCR扩增引物；所述引物为序列表中SEQID No: 76- No: 87所示 的核苷酸序列；(3)使用步骤(2)中所述引物采用巢氏PCR方法对步骤(1)中所述cDNA进行PCR扩增；(4)纯化上述扩增产物；(5)标记纯化的扩增产物使用巢式PCR扩增的第二轮反向引物和荧光素Cy5-dCTP进 行标记；(6)将标记产物与基因芯片杂交、洗涤；其中，所述基因芯片为包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡 核苷酸探针为序列表中SEQ ID No: 1- No: 75所示的核苷酸序列；(7)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果，从而确定所检测的基因亚型。
2.根据权利要求1所述的用于HIV基因分型的全基因组探针杂交检测方法，其特征在 于，在所述步骤(3 )中，使用步骤(2 )中所述引物采用巢氏PCR方法对步骤(1)中所述cDNA 分三段分别进行二轮PCR扩增。
3.根据权利要求1所述的用于HIV基因分型的全基因组探针杂交检测方法，其特征在 于，在所述步骤(5)中，使用巢式PCR扩增的第二轮反向引物分三段和荧光素Cy5-dCTP进 行标记。
4.根据权利要求1所述的用于HIV基因分型的全基因组探针杂交检测方法，其特征在 于，在所述步骤(6)中，杂交温度为40°C，杂交时间为16h。
5.根据权利要求1所述的用于HIV基因分型的全基因组探针杂交检测方法，其特征在 于，所述基因芯片的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯或载玻片。
全文摘要
本发明公开了一种用于HIV基因分型的全基因组探针杂交检测方法，该方法包括制备待测样品的cDNA，设计并制备出PCR扩增引物，使用所述引物采用巢氏PCR方法对所述cDNA进行PCR扩增；纯化上述扩增产物；标记纯化的扩增产物；将标记产物与基因芯片杂交、洗涤；用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果，从而确定所检测的基因亚型。本发明所述检测方法可以简便、快速和更准确地确定HIV的基因亚型。
文档编号C12Q1/70GK102140552SQ20111007772
公开日2011年8月3日 申请日期2011年3月30日 优先权日2011年3月30日
发明者刘建礼, 张绍福, 朱红 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局