专利名称：一种在体无创监测microRNA表达的双模态成像报告基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种报告基因系统，尤其是涉及一种在体无创监测microRNA表达的双模态成像报告基因的方法，其为一种通过构建双模态成像报告基因系统，来非入侵式监测内源microRNA表达水平的方法。背景技术：
microRNA是一类长度在22个核苷酸(nt)左右的内源性非编码小分子单链RNA，能通过与靶基因mRNA的3’非翻译区完全或不完全互补配对，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译。大量科学研究表明，microRNA在一系列的生物学过程如发育、增殖、代谢及凋亡等中都发挥着重要的调节功能。现今监测microRNA表达水平的传统方法主要有Norhtern杂交、原位杂交、实时定量PCR或基因芯片等。然而这些监测方法不仅耗费时间和人力，更为重要的是，它们在操作过程中要求固定或裂解细胞，导致细胞死亡，因而不能在活体状态下研究microRNA的表达水平以及监测其在生命活动中的调控作用。虽然目前也有报道活体研究microRNA表达的成像技术，但都是基于单一模态的成像技术，不能获得完整清晰的活体的全部信息。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在体无创监测microRNA表达的双模态成像报告基因的方法，其提供了 microRNA表达调控相关研究的分子成像报告基因系统，为深入研究microRNA 在组织细胞内的表达水平及其对生命活动的调控功能奠定了基础。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种在体无创监测microRNA表达的双模态成像报告基因的方法，其特征在于(1) 利用人钠/碘共同转运体基因能够吸收放射性碘而作为报告基因用于核素成像的特性， 将hNIS基因克隆到质粒pcDNA3. 1多克隆位点上，从而得到质粒pcDNA3. 1-hNIS ；(2) 利用萤光虫萤光素酶可以作为报告基因用于生物发光成像的特性，将Fluc基因克隆到 pcDNA3. Ι-hNIS上，使hNIS和Fluc基因能够融合表达，从而获得pcDNA3. 1-Fluc-hNIS ； (3) 利用microRNA与靶标mRNA通过碱基互补配对的形式相互作用的特性，将与microRNA_16 完全互补配对的三段串联重复序列克隆到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS上，从而获得双模态成像报告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0在步骤(1)中，通过PCR扩增全长hNIS基因，然后克隆到pcDNA3. 1的HindIII和 EcoRI酶切位点之间，从而得到质粒pcDNA3. 1-hNIS。在步骤(2)中，通过PCR扩增全长Fluc基因，然后克隆到pcDNA3. 1-hNIS 的NheI和HindIII酶切位点之间，使hNIS和Fluc基因能够融合表达，从而获得 pcDNA3. 1-Fluc-hNIS。在步骤(3)中，通过化学合成与microRNA-16互补配对的三段串联重复序列，然后克隆到Fluc - hNIS融合基因的下游EcoRV和BioI之间，从而获得双模态成像报告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0
在步骤(1)中，PCR扩增全长hNIS基因，凝胶电泳及胶回收PCR产物，将胶回收产物使用HindIII和EcoRI进行双酶切，得到hNIS基因双酶切产物；提取质粒pcDNA3. 1，使用HindIII和EcoRI进行双酶切，然后进行胶回收，得到pcDNA3. 1胶回收产物；将hNIS基因双酶切产物和pcDNA3. 1胶回收产物与T4 DNA连接酶和缓冲液混合，放在16度水浴锅过夜连接，第二天转化大肠杆菌感受态细胞，然后挑单克隆，提质粒，测序，从而得到正确的质粒 pcDNA3. 1-hNISο在步骤(2)中，PCR扩增全长Fluc基因，凝胶电泳及胶回收PCR产物，将胶回收产物使用NheI和HindIII进行双酶切，得到Fluc基因双酶切产物；提取质粒pcDNA3. 1-hNIS， 使用NheI和HindIII进行双酶切，然后进行胶回收，得到pcDNA3. l_hNIS胶回收产物；将 Fluc基因双酶切产物和pcDNA3. Ι-hNIS胶回收产物与"Γ4 DNA连接酶和缓冲液混合，放在 16度水浴锅过夜连接，第二天转化大肠杆菌感受态细胞，然后挑单克隆，提质粒，测序，从而得到正确的质粒pcDNA3. 1-Fluc-hNIS。在步骤(3)中，化学合成与microRNA-16互补配对的三段串联重复序列，并且合成的重复序列两端带有EcoRV和BioI酶切位点，然后进行双链的退火反应，得到退火的双链序列；提取质粒pcDNA3. 1-Fluc-hNIS,使用EcoRV和BioI进行双酶切，然后进行胶回收，得到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS胶回收产物；将退火的双链序列和pcDNA3. l-Fluc-hNIS 胶回收产物与T4 DNA连接酶和缓冲液混合，放在16度水浴锅过夜连接，第二天转化大肠杆菌感受态细胞，然后挑单克隆，提质粒，测序，从而得到正确的双模态成像报告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下
本发明的双模态成像报告基因，能够对microRNA的表达水平同时进行生物发光成像和核素PET成像两种成像模态，打破了目前对microRNA成像只有单一模态的局限，这对于采用分子影像技术在体无创监测microRNA的表达水平及阐述microRNA在生命活动中的调控机制和生物学功能具有非常重要的意义。四
图1为双模态成像报告基因结构模式图
图2为报告基因Fluc体外萤光素酶测定和报告基因hNIS体外放射性碘摄取测定结果
图
图3为报告基因FH-3xmirl6TS在动物体内的生物发光和核素PET双模态成像结果图五具体实施例方式
本发明为一种利用hNIS基因可用于核素成像和Fluc基因可用于生物发光成像的特性，将hNIS基因和Fluc基因克隆到pcDNA3. 1载体中进行融合表达，进而建立在体无创监测microRNA表达的双模态成像报告基因的方法。本发明采用以下技术方案
(1)利用人钠/碘共同转运体基因(humansodium/iodide symporter, hNIS)能够吸收放射性碘而作为报告基因用于核素成像的特性，将hNIS基因克隆到质粒pcDNA3. 1多克隆位点上，从而得到质粒pcDNA3. 1-hNIS; (2)利用萤光虫萤光素酶(firefly luciferase, Flue)可以作为报告基因用于生物发光成像的特性，将Fluc基因克隆到pcDNA3. 1-hNIS上， 使hNIS和Fluc基因能够融合表达，从而获得pcDNA3. 1-Fluc-hNIS ； (3)利用microRNA与靶标mRNA通过碱基互补配对的形式相互作用的特性，将与microRNA-16完全互补配对的三段串联重复序列(总长约70bp)克隆到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS上，从而获得双模态成像报告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0实施例
1.质粒PCDNA3. Ι-hNIS的克隆
PCR扩增全长hNIS基因，凝胶电泳及胶回收PCR产物，将胶回收产物使用HindIII 和EcoRI进行双酶切，得到hNIS基因双酶切产物；提取质粒pcDNA3. 1，使用HindIII和 EcoRI进行双酶切，然后进行胶回收，得到pcDNA3. 1胶回收产物；将hNIS基因双酶切产物和pcDNA3. 1胶回收产物与T4 DNA连接酶和缓冲液混合，放在16度水浴锅过夜连接，第二天转化大肠杆菌感受态细胞，然后挑单克隆，提质粒，测序，从而得到正确的质粒 pcDNA3. 1-hNISο2.质粒 pcDNA3. Ι-Fluc-hNIS 的克隆
PCR扩增全长Fluc基因(不含终止密码子)，凝胶电泳及胶回收PCR产物，将胶回收产物使用NheI和HindIII进行双酶切，得到Fluc基因双酶切产物；提取质粒pcDNA3. 1-hNIS， 使用NheI和HindIII进行双酶切，然后进行胶回收，得到pcDNA3. 1-hNIS胶回收产物；将 Fluc基因双酶切产物和pcDNA3. Ι-hNIS胶回收产物与"Γ4 DNA连接酶和缓冲液混合，放在 16度水浴锅过夜连接，第二天转化大肠杆菌感受态细胞，然后挑单克隆，提质粒，测序，从而得到正确的质粒pcDNA3. 1-Fluc-hNIS。3.报告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS_3xmirl6TS 的克隆
化学合成与microRNA-16互补配对的三段串联重复序列(总长约70bp)，并且合成的重复序列两端带有EcoRV和BioI酶切位点，然后进行双链的退火反应，得到退火的双链序列；提取质粒pcDNA3. Ι-Fluc-hNIS,使用EcoRV和BioI进行双酶切，然后进行胶回收，得到pcDNA3. Ι-Fluc-hNIS胶回收产物；将退火的双链序列和pcDNA3. 1-Fluc-hNIS 胶回收产物与T4 DNA连接酶和缓冲液混合，放在16度水浴锅过夜连接，第二天转化大肠杆菌感受态细胞，然后挑单克隆，提质粒，测序，从而得到正确的双模态成像报告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS (FH_3xmirl6TS)，参见图 1。4.鉴定
4. 1报告基因Fluc体外萤光素酶测定(参见图2A)
为了验证报告基因Fluc的活性，在6孔板中培养人胃癌细胞系SGC 7901，之后将双模态报告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS (FH-3xmirl6TS)分别与 microRNA-16 (mir-16) RNA mimics及对照ctrl mimics共转染到SGC 7901细胞中，或者只转染 FH-3xmirl6TS质粒和对照空载质粒pcDNA3. l-Fluc-hNIS (FH)到SGC 7901细胞中，培养 48小时后，收集细胞，采用生物发光检测仪测定细胞中的萤光素酶含量。结果参见图2A，与对照组相比，不论是将FH-3xmirl6TS与mir_16共转染，还是只转染质粒FH-3xmirl6TS，细胞中的萤光素酶活性都大大降低，分别约为对照组的16%和31%。4. 2报告基因hNIS体外放射性碘摄取测定(参见图2B)
为了测定报告基因hNIS的活性，在6孔板中培养SGC 7901细胞，之后将FH-3xmirl6TS 分别与mir-16 RNA mimics及对照ctrl mimics共转染到SGC 7901细胞中，或者只转染 FH-3xmirl6TS质粒和对照空载质粒pcDNA3. l-Fluc-hNIS (FH)到SGC 7901细胞中，继续培养M小时后，吸弃培养液，用冰冷的PBS洗3次，然后每孔加入含NaiwI 74 Mq的Hanks 培养液1 ml，之后细胞继续培养1小时后，收集细胞，使用g计数器计数测定各孔中的放射性碘含量。结果参见图2B，与对照组相比，不论是将FH-3xmirl6TS与mir-16共转染，还是只转染质粒FH-3xmirl6TS，细胞中的放射性碘摄取量都明显降低，分别约为对照组的和 72%。
4. 3报告基因FH-3xmirl6TS在动物体内的生物发光和核素PET双模态成像(参见图3)生物发光成像培养SGC 7901细胞，将报告基因FH-3xmirl6TS和对照质粒ΠΙ分别转染SGC 7901细胞，24小时后，采用G418抗生素进行筛选，筛选3周后，得到稳定表达ΠΙ和FH-3xmirl6TS的SGC 7901细胞系，G418浓度为600 ug/ml。之后分别将FH禾口 FH-3xmirl6TS细胞收集、计数，调整浓度为IxlO7个细胞/ml，然后分别将这些细胞注入6 周大小的雌性BALB/c裸鼠(重量约20-25g)的左右两腿皮下，左侧为 转染的细胞，右侧为FH-3xmirl6TS转染的细胞。M小时后，以洲异氟烷吸入麻醉小鼠，注射底物150 mg/kg 的 D-Iuciferin，采用生物发光成像系统(Xenogen IVIS Kinetic, Caliper, CA, USA)进行生物发光信号的获取。结果参见图3A，小鼠右侧的生物发光信号比左侧的信号要弱的多，表明报告基因FH-3xmirl6TS在体内受到了内源microRNA-16表达的抑制。
核素PET成像将稳定转染了 ra和FH-3xmirl6TS的SGC 7901细胞系分别注入小鼠左右肩皮下，左侧为FH-3Xmirl6TS转染的细胞右侧为Hl转染的细胞，培养三周，使小鼠成瘤。之后通过小鼠尾静脉注射18. 5 MBq 124I,采用2%异氟烷麻醉小鼠后，将小鼠放在microPET成像系统上进行不同位置的信号采集。结果参见图3B，分别做了小鼠的水平面(horizontal )、冠状面(coronal)和矢状面(sagittal)成像，可以看到小鼠左侧信号 (FH-3xmirl6TS转染组)比右侧信号(!7H转染组)要弱的多，表明报告基因FH-3xmirl6TS在体内受到了内源microRNA-16表达的抑制。
权利要求
1.一种在体无创监测microRNA表达的双模态成像报告基因的方法，其特征在于 (1)利用人钠/碘共同转运体基因能够吸收放射性碘而作为报告基因用于核素成像的特性，将hNIS基因克隆到质粒pcDNA3. 1多克隆位点上，从而得到质粒pcDNA3. 1-hNIS ； (2) 利用萤光虫萤光素酶可以作为报告基因用于生物发光成像的特性，将Fluc基因克隆到 pcDNA3. Ι-hNIS上，使hNIS和Fluc基因能够融合表达，从而获得pcDNA3. 1-Fluc-hNIS ； (3) 利用microRNA与靶标mRNA通过碱基互补配对的形式相互作用的特性，将与microRNA_16 完全互补配对的三段串联重复序列克隆到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS上，从而获得双模态成像报告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0
2.根据权利要求书所述的一种在体无创监测microRNA表达的双模态成像报告基因的方法，其特征在于在步骤(1)中，通过PCR扩增全长hNIS基因，然后克隆到pcDNA3. 1的 HindIII和EcoRI酶切位点之间，从而得到质粒pcDNA3. 1-hNIS。
3.根据权利要求书所述的一种在体无创监测microRNA表达的双模态成像报告基因的方法，其特征在于在步骤(2)中，通过PCR扩增全长Fluc基因，然后克隆到pcDNA3. 1-hNIS 的NheI和HindIII酶切位点之间，使hNIS和Fluc基因能够融合表达，从而获得 pcDNA3. 1-Fluc-hNIS。
4.根据权利要求书所述的一种在体无创监测microRNA表达的双模态成像报告基因的方法，其特征在于在步骤(3)中，通过化学合成与microRNA-16互补配对的三段串联重复序列，然后克隆到Fluc - hNIS融合基因的下游EcoRV和B10I之间，从而获得双模态成像报告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0
5.根据权利要求1或2所述的一种在体无创监测microRNA表达的双模态成像报告基因的方法，其特征在于步骤(1)中，PCR扩增全长hNIS基因，凝胶电泳及胶回收PCR产物，将胶回收产物使用HindIII和EcoRI进行双酶切，得到hNIS基因双酶切产物；提取质粒pcDNA3. 1，使用 HindIII和EcoRI进行双酶切，然后进行胶回收，得到pcDNA3. 1胶回收产物；将hNIS基因双酶切产物和pcDNA3. 1胶回收产物与T4 DNA连接酶和缓冲液混合，放在16度水浴锅过夜连接，第二天转化大肠杆菌感受态细胞，然后挑单克隆，提质粒，测序，从而得到正确的质粒 pcDNA3. 1-hNIS。
6.根据权利要求1或3所述的一种在体无创监测microRNA表达的双模态成像报告基因的方法，其特征在于步骤(2)中，PCR扩增全长Fluc基因，凝胶电泳及胶回收PCR产物，将胶回收产物使用 NheI和HindIII进行双酶切，得到Fluc基因双酶切产物；提取质粒pcDNA3. 1-hNIS,使用 NheI和HindIII进行双酶切，然后进行胶回收，得到pcDNA3. 1-hNIS胶回收产物；将Fluc基因双酶切产物和pcDNA3. Ι-hNIS胶回收产物与T4 DNA连接酶和缓冲液混合，放在16度水浴锅过夜连接，第二天转化大肠杆菌感受态细胞，然后挑单克隆，提质粒，测序，从而得到正确的质粒 pcDNA3. 1-Fluc-hNIS ；步骤(3)中，化学合成与microRNA-16互补配对的三段串联重复序列，并且合成的重复序列两端带有EcoRV和B10I酶切位点，然后进行双链的退火反应，得到退火的双链序列；提取质粒pcDNA3. 1-Fluc-hNIS,使用EcoRV和BioI进行双酶切，然后进行胶回收，得到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS胶回收产物；将退火的双链序列和pcDNA3. 1-Fluc-hNIS胶回收产物与jM DNA连接酶和缓冲液混合，放在16度水浴锅过夜连接，第二天转化大肠杆菌感受态细胞，然后挑单克隆，提质粒，测序，从而得到正确的双模态成像报告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TSo
全文摘要
本发明涉及一种在体无创监测microRNA表达的双模态成像报告基因的方法，其提供了microRNA表达调控相关研究的分子成像报告基因系统，为深入研究microRNA在组织细胞内的表达水平及其对生命活动的调控功能奠定了基础。本发明采用的技术方案为(1)利用人钠／碘共同转运体基因能够吸收放射性碘而作为报告基因用于核素成像的特性，将hNIS基因克隆到质粒pcDNA3.1多克隆位点上，从而得到质粒pcDNA3.1-hNIS;(2)利用萤光虫萤光素酶可以作为报告基因用于生物发光成像的特性，将Fluc基因克隆到pcDNA3.1-hNIS上，使hNIS和Fluc基因能够融合表达，从而获得pcDNA3.1-Fluc-hNIS；(3)利用microRNA与靶标mRNA通过碱基互补配对的形式相互作用的特性，将与microRNA-16完全互补配对的三段串联重复序列克隆到pcDNA3.1-Fluc-hNIS上，从而获得双模态成像报告基因pcDNA3.1-Fluc-hNIS-3xmir16TS。
文档编号C12N15/66GK102533834SQ201110334119
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者曹丰, 梁继民, 王慎旭, 王福, 田捷 申请人:中国人民解放军第四军医大学, 西安电子科技大学