专利名称：一种抗hbv诱饵适体及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及分子病毒学技术领域，具体涉及一种基于体外SELEX筛选技术的抗 HBV诱饵适体的获得。
背景技术：
SELEX 技术即“指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment, SELEX) ”。该技术是建立在随机寡聚核苷酸文库的基础上通过重复地进行多轮分离和扩增，从而得到能与各种靶分子特异性高亲和结合的寡聚核苷酸片段的组合化学技术，筛选所得的高亲和寡聚核苷酸片段被称作适体(aptamer)。
作为高通量的文库筛选策略，SELEX技术能够在较短的时间内得到一大批与靶蛋白高亲和的适体。和传统的抗体比较，适体除了具备高亲和性和特异性以外，还有诸如高稳定性、易于修饰和标记、制备方法简单且质量优等一些独特的优点，并且其筛选过程在体外完成，选择条件可变且易于控制，这些优点不仅使SELEX技术广泛应用于各类靶标的适体筛选，也使得适体在新型药物开发、临床诊断和治疗等方面得以较好地应用。
以人乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus,HBV)为代表的嗜肝DNA病毒科在复制过程的早期阶段，其反转录酶(P蛋白)与PgRNA 5’末端61nt茎环结构eRNA之间的相互作用不仅具有高度的特异性，同时也启动了 HBV复制循环早期的两个关键步骤基于蛋白质引发(priming)的反转录起始和核衣壳组装。因此，P-ε间的相互作用为乙肝的抗病毒研究和临床治疗策略提供了一个极具吸引力和应用前景的药物靶点。针对人HBVP-ε相互作用，新近建立的依赖于Hsp90等分子伴侣复合物的体外重建系统成功实现了二者之间的物理结合，尽管缺乏后续的priming过程，但是为本发明提供了必要的体外筛选的技术平台。 在此基础上，本发明结合SELEX技术筛选得到和miniP蛋白高亲和结合的一批适体RNAs，通过对挑选的适体在细胞内抗HBV生物学功能的综合验证，获得用于抗HBV研究的诱饵适体小分子RNA-S9。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗HBV诱饵适体及其筛选方法，该诱饵适体能够在体外以及细胞内通过竞争性结合作用有效抑制野生型P-ε复合物的形成，达到抑制HBV复制的效果。该诱饵适体利用SELEX技术筛选方法获得。
本发明解决其技术问题采用以下的技术方案
本发明提供的抗HBV诱饵适体，其能竞争性抑制人HBV中特异性Ρ_ ε相互作用， 是通过SELEX技术筛选获得的，具体是体外制备ε上茎23个核苷酸随机化的ε RNA文库， 利用SELEX技术经多轮筛选，从该ε RNA文库中富集、筛选与目的蛋白HBV miniP高亲和的适体RNAs ；然后手工测序获得10个适体RNAs的序列信息，并依据二级结构的相似性分组， 从与野生型ε RNA 二级结构相似的组中挑选有代表性的适体S3、S6、S9进行定性；对于具有高亲和性和高结合特异性的适体S9，通过细胞转染实验证实了其抗HBV生物学功能；所述S9的序列为
5’ -UGUUCAU⑶CCUACUGUUCAAACAAAAAAACUGUGCACAAAAAUAAAUUGGGGCAUGGACA-3，。
本发明提供的上述抗HBV诱饵适体是采用以下筛选方法获得，其步骤包括
(1)体外制备ε RNA突变文库(上茎23个核苷酸随机化)用于SELEX筛选
设计并合成用于体外制备随机化￡1^^突变文库的92-111吐寡聚核苷酸引物 D印sNuppS(-)，该模板包含61nt的ε RNA的序列信息，其中与ε上茎序列对应的23个核苷酸序列全部随机化，在ε RNA序列信息的3’下游包含与Τ7启动子序列互补的序列信息， 在ε RNA的上下游还分别包含限制性内切酶位点序列，以便进行体外转录和后续克隆；此外，还合成了包含Τ7启动子序列的22-mer引物T7prom01igo (+)；
以上二种引物经体外粘连杂交后，形成完整的T7启动子，利用T7转录试剂盒 (Ambion)体外转录合成获得初始ε RNA文库，用于SELEX筛选；
(2)体外SELEX筛选获得与miniP高亲和的适体RNAs
将IOOng纯化的miniP蛋白与以上终浓度1 μ M初始ε RNA文库在30 μ 1伴侣分子体外结合系统中30°C孵育》ir，随后加入含M2+-NTA球珠的预冷结合缓冲液，低温孵育 Ihr，利用miniP蛋白的组氨酸标签将所形成的miniP- ε RNA文库复合物吸附到Ni2+-NTA球珠上，先后以预冷结合缓冲液和TMK缓冲液洗去反应体系中未结合或弱结合的适体RNAs。 miniP- ε RNA复合物经苯酚抽提、无水乙醇沉淀后，分离结合的RNAs ；该RNAs经RT-PCR扩增富集后得到的cDNA产物，用作下一轮SELEX筛选的RNAs转录模板；
(3)手工测序获得适体RNAs的序列信息并依据二级结构的相似性分组
将经过3轮SELEX筛选分离的适体RNAs经RT-PCR扩增后克隆到pUC19载体中， 重组载体经Kpn I线性化后，凝胶回收线性化DNA用作测序模板，以32P标记的包含T7启动子的寡聚核苷酸 T7RTD印s01igo(+)为测序引物，按 Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit(USB)操作说明进行手工测序；利用在线Mfold软件对所分离的10个具有不同上茎序列的适体RNAs的理论二级结构进行预测，并依据二级结构的相似性分组，从与野生型 ε RNA 二级结构相似的组中挑选3个有代表性的适体S3、S6、S9进行定性；
(4)对代表性适体与miniP的亲和力和结合特异性进行定性
利用凝胶迁移率移动实验(EMSA)评价诱饵适体与目的蛋白miniP的亲和力；利用竞争性EMSA实验评价适体与miniP的结合特异性；
(5)检测高亲和力、高结合特异性的适体S9在细胞内的抗HBV能力
构建包含S9序列的重组载体pSUPER-S9，将其转染HBV持续复制细胞系-!fepG2. 2. 15。Southern blotting分析细胞中新生的病毒核衣壳内DNA合成能力， 所得数据用OptiQuant 5. Osoftware定量；作为内参，Western blotting检测管家基因 β-actin的表达，结果和对照组相比较，校正样品间差异。用MTT法比较各处理组之间的活细胞差异，排除非特异性的细胞毒作用。
同时，将含HBV全长基因组的pCH-9/3091与pSUPER_S9以1 1比例共转染 !fepG2细胞系。Southern blotting和Northern blotting分析细胞中病毒核衣壳内DNA 合成能力和PgRNA含量，所得数据用OptiQuant 5. Osoftware定量；利用非变性Western blotting检测细胞中病毒核衣壳装配情况是否受到影响；Western blotting检测管家基因β-actin的表达，结果和对照组相比较，校正样品间差异。用MTT法比较各处理组之间的活细胞差异，排除非特异性的细胞毒作用。
经过上述步骤，确立S9作为用于抗HBV的诱饵适体，该S9的序列为
5’ -UGUUCAU⑶CCUACUGUUCAAACAAAAAAACUGUGCACAAAAAUAAAUUGGGGCAUGGACA-3，。
上述步骤(1)中，所述92-mer寡聚核苷酸引物D印sNuppS(-)序列为
5，-GGTACCTGTCCATGCCCCA(N) 12GCACAG (N)11GAACAGTAGGACATGAACAGCCCTATAGTGAG TCGTATTAATTC-3，，
随机化序列以N标注；
所述22-mer 的 T7prom01igo (+)序列为5，-GAATTAATACGACTCACTATAG-3，。
上述步骤O)中，伴侣分子体外结合系统由IOyg Hsp70 (Biovision)Uy g Hsp90b (Abeam)、0· 6 μ g Hdjl (Biovision)>1. 2 μ g Hop (Biovision)>0. 3 μ g ρ23 (Abeam) 组成。
上述步骤O)中，所述预冷结合缓冲液由0. lMNa2HP04/NaH2P04[pH7. 4]、 150mMNaCl、20mM Lnidazol、0· 1 % (V/V) NP-40 及 100 μ g/ml 酵母 tRNA 组成。
上述步骤(2)中，所述TMK缓冲液由50mM Tris/HCl [pH7. 5]，IOmM MgCl2,40mMKCl, 100 μ g/ml 酵母 tRNA 组成。
上述步骤O)中，SELEX筛选中RT-PCR所应用的引物序列为
RTDepsOl iogo(-) 5，-CAATCTGCAGTCTAGATAAGGTACCTGTCCATGCCCCA-3’
T7RTDeps01igo(+) :5， -CCCCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGTTCATGT-3，
其中，T7RTD印sOligo (+)也是步骤(3)中所述的测序引物。
上述步骤O)中，所有PCR循环都被限制在15-18个循环，以避免RT-PCR扩增过程中出现过量的非特异性产物。
上述步骤(4)中，可以采用以下方法评价适体与目的蛋白miniP的亲和力
将适体RNA或野生型ε RNA 5，末端去磷酸化后，以3000Ci/mmol y -32P-ATP和!"4 磷酸化激酶对RNA 5’末端放射性磷酸化标记，标记RNA利用Quick Spin columns进行纯化；
在miniP-ε直接结合实验中，采用了由 ρΗ7. 5 的 20mM Tris/HCl, 2mM MgCl2,15mM NaCl,20mM KCl和4mM dithiothreitol组成的TMNK反应缓冲液；每10 μ 1 TMNK反应缓冲液中含 20ng 的 miniP,终浓度为 50nM 的 y -32P- ε RNA, 6 μ g 酵母 tRNA,由 3 μ gHsp70、360ng Hsp90、200ng Hdjl、375ng Hop 和 IOOng p23 组成的分子伴侣蛋白体系，40u/μ 1 的 RNase 酶抑制剂，以及1片/次的蛋白酶抑制剂cocktail ；
反应体系30°C孵育2hr后，经5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，真空干胶并压制磷屏底片，放射强度经Perkin Elmer C431200磷屏仪检测后，利用OptiQuant 5. O software对RNP复合物进行定量分析。
上述步骤中，可以采用以下方法评价适体与miniP的结合特异性
在miniP- ε竞争性结合实验中，利用5’末端32P标记的野生型ε RNA和20倍过量浓度的未标记适体RNA混合，测试它们竞争MiniP蛋白的能力，从而确定适体对MiniP的结合特异性。采用了由 ρΗ7. 5 的 20mM Tris/HCl, 2mM MgCl2,15mM NaCl,20mM KCl 禾Π 4mM dithiothreitol组成的TMNK反应缓冲液；每10 μ 1 TMNK反应缓冲液中含20ng的miniP, 终浓度为50nM的γ」2Ρ- ε RNA, 1 μ M未标记的适体RNAs，6 μ g酵母tRNA，由3 μ gHsp70、CN 102533772 A360ng Hsp90、200ngHdjl、375ng Hop 和 IOOng p23 组成的分子伴侣体系，40u/μ 1 的 RNase 酶抑制剂，以及1片/次的蛋白酶抑制剂cocktail ；
反应体系30°C孵育2hr后，经5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，真空干胶并压制磷屏底片，放射强度经Perkin Elmer C431200磷屏仪检测后，利用OptiQuant 5. 0 software对RNP复合物进行定量分析。
上述步骤(5)中，可以采用以下方法检测适体S9在H印G2. 2. 15细胞内对HBV复制的影响构建包含S9序列的重组载体pSUPER-S9，利用LipofectomineTM2000anvitrogen)， 按操作说明将pSUPER-S9(My g)瞬时转染H印G2. 2. 15细胞(IOcm细胞培养皿)，48hr后用 Iml NP40 裂解液(IOmM Tris-HCl [pH8. 0],50mM NaClUmM EDTA)裂解细胞并收获细胞裂解液，Southern blotting检测适体S9的引入对细胞中病毒核衣壳内DNA合成的影响，所得数据用 OptiQuant 5. Osoftware 定量；作为内参，Western blotting 检测管家基因 β -actin 的表达，并与对照组比较，以校正各处理组之间的样品误差。
上述步骤(5)中，可以采用以下方法检测适体S9在H印G2细胞内对HBV复制的影响
pSUPER-S9重组载体与含HBV基因组表达载体pCH-9/3091以1 1比例共瞬时转染H印G2细胞，48hr后收集细胞，纯化胞内HBV核衣壳。其中，1/3用来抽提核衣壳内的HBV 复制中间体DNA，1/3用来抽提核衣壳内的pgRNA，并用32P标记的HBV特异基因片段为探针分别做Southern blotting和Northern blotting，分析引入S9对病毒核衣壳内DNA合成和核衣壳内PgRNA含量的影响，所得数据用OptiQuant 5. 0 software定量；剩余1/3用非变性flfesternblotting检测对病毒核衣壳装配的影响。Western blotting检测管家基因 β-actin的表达，并与对照组比较，以校正各处理组之间的样品误差。
上述步骤(5)中，可以采用MTT法比较各处理组之间的活细胞差异瞬时转染 H印G2. 215或H印G2细胞系M小时后，将实验组(转染pSUPER_S9)和对照组(无质粒转染、 转染pSUPER-siRNA、转染pSUPER-mut ε (P蛋白结合缺陷突变ε )、转染空载体pSUPER) IOem 细胞培养皿的细胞用胰酶消化后取1/10细胞重悬于ImL DMEM中，再将细胞悬液接种到 96 孔板每空孔 100 μ 1 (约 104 个细胞)，按照Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit(Invitrogen)操作说明进行定量分析，排除S9对细胞内HBV复制的影响是由于非特异性的细胞毒作用造成。
本发明提供的上述诱饵适体，其作用机理是通过自身与目标靶蛋白之间更高的亲和力实现阻碍野生型ε结合到目标靶蛋白的特异性反应，该作用既不同于干扰素的抗病毒和免疫调节作用机制，又区别于核苷(酸)类似物通过与天然核苷酸竞争参与并终止 HBV DNA合成的作用机制。可见，诱饵适体在保证特异针对HBV P-ε相互作用靶标的同时， 又不直接参与病毒的复制过程，从而抑制其复制。
本发明鉴于目前使用的抗HBV临床治疗药物的缺陷性，所提供的诱饵适体-S9有以下的主要突出效果和优点
其一.运用体外SELEX筛选技术，以HBV P- ε为靶标，从体外制备的上茎23nt随机化的ε RNA文库中筛选与miniP蛋白高亲和、特异性结合的适体RNAs，通过验证适体的生物学功能，成功获得有效抑制HBV复制的诱饵适体。
其二 .经检测证实能在细胞内通过竞争性结合作用抑制胞内野生型P- ε复合物胞内HBV复制水平的效果，该诱饵适体为有效阻断HBV复制过程提供了一种新颖的抑制剂。
其三.目前处于临床前研究的抗HBV shRNA药物在肝细胞内抗病毒特异性不强， 存在脱靶效应，限制了该药物的进一步运用。相反，本发明筛选得到的诱饵适体S9具有抗 HBV的高特异性。
其四.相比于传统的抗HBV shRNA药物，本发明诱饵适体有望解决当前慢性乙肝临床治疗中出现的低应答率、副作用和病毒逃逸形成耐药突变株等实际难题。
图1是SELEX筛选示意图。
图2是野生型ε RNA示意图。
图3是随机化ε RNA文库示意图。
图4是适体S3、S6和S9的手工测序分析图。
图5-图7分别是适体S3、S6和S9的理论二级结构图。
图8是用EMSA测定三种适体与目的蛋白的亲和力并对其相对结合强度进行定量的示意图。
图9是用竞争性EMSA测定三种适体的竞争性结合能力并对其竞争强度定量的示意图。
图10是将50ηΜ放射标记的wt ε RNA和逐渐递减浓度的适体竞争剂(S6、S9)混合后，用竞争性EMSA测定适体竞争强度的示意图。
图11是适体S9导入H印G2. 2. 15细胞系后，用Southern Blotting测定细胞内病毒核衣壳内DNA合成的分析图。
图12是适体S9导入H印G2细胞系后，用Southern Blotting和Northern blotting测定细胞内病毒核衣壳内DNA和pgRNA，用^festern Blotting测定细胞内HBV核衣壳装配的分析图。
图13是诱饵适体抑制HBV复制的作用机理示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。
本发明提供的是一种利用体外SELEX筛选技术，以人HBV中特异性Ρ_ ε相互作用为靶标，筛选获得的抗HBV诱饵适体。诱饵适体的获得包括以下步骤
1.体外SELEX筛选与miniP高亲和的适体RNAs
(1)设计并合成用于体外制备ε RNA突变文库的寡聚核苷酸模板
为体外制备ε RNA文库，设计并合成92-mer寡聚核苷酸引物D印sNuppS (-)，该模板包含61nt ε RNA的序列信息，其中ε上茎的23个核苷酸序列全部随机化，在ε RNA序列信息的3’下游包含与Τ7启动子序列互补的序列信息，在ε RNA的上下游还分别包含限制性内切酶位点序列，以便进行体外转录和后续克隆。此外，还合成了包含Τ7启动子序列的22-mer引物T7prOm01igO (+)。以上二种引物经体外粘连杂交后，形成完整的T7启动子， 利用AmbionT7转录试剂盒体外转录合成获得初始ε RNA文库，经OD26tl值和12%变性聚丙烯酰胺凝胶检测得以验证，用于SELEX筛选；
(2)适体RNAs的获得
将miniP蛋白与初始ε RNA文库在伴侣分子体外结合系统中30°C孵育》ir，随后加入含 Ni2+-NTA 球珠的预冷结合缓冲液(0. IM Na2HP04/NaH2P04[pH7. 4], 150mM NaCl, 20mMImidazol,0. 1% (ν/ν)NP-40，100 μ g/ml yeast tRNA)低温孵育 lhr，利用 miniP 蛋白的组氨酸标签将所形成的miniP-随机化ε RNA复合物吸附到Ni2+-NTA球珠上，先后以预冷的结合缓冲液和 TMK 缓冲液(50mM Tris/HCl [pH7. 5], IOmM MgCl2,40mM KCl, 100 μ g/ml yeast tRNA)洗去反应体系中未结合或弱结合的适体RNAs，得到的混合物再经苯酚抽提、无水乙醇沉淀后分离后得到RNAs。
所得RNAs经RT-PCR扩增富集后得到的cDNA产物用作下一轮SELEX筛选所需的随机化RNA库的体外转录模板，为了避免扩增过程中出现过量的非特异性产物，所有PCR循环都被限制在15个循环。
2.分离适体RNAs并测定其序列信息
将上述步骤中第3轮筛选所得适体RNAs经RT-PCR扩增后的cDNA产物利用EcoR I 和)(ba I克隆到pUC19载体中，转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞后，随机挑选单克隆并抽提质粒以酶切分析检出阳性克隆，所得阳性克隆子经Kpn I内切酶线性化后，用于适体RNAs 的手工测序以获得所分离适体RNAs的序列信息。
3.适体RNAs的理论二级结构预测及候选诱饵适体的挑选
利用在线Mfold 软件(http://mfold.rna.albany.edu/ ？ q = mfold/ RNA-Folding-Form)对所分离适体RNAs的理论二级结构进行预测，并依据二级结构的相似性分为三组，从与野生型ε RNA结构相似的组中挑选3个有代表性的候选诱饵适体S3、S6、 S9进行定性。
4.对代表性适体与miniP的亲和力和结合特异性进行定性
利用凝胶迁移率移动实验(EMSA)评价诱饵适体与目的蛋白miniP的亲和力将适体RNA或野生ε RNA 5’末端去磷酸化后，以放射性同位素(γ-32Ρ ATP, 3000Ci/mmol)和"Γ4 磷酸化激酶对RNA进行末端磷酸化标记，标记RNA利用Quick Spin columns (Roche)进行纯化。在miniP-ε直接结合实验中，每10 μ 1 TMNK反应缓冲液(20mM Tris/HCl [pH7. 5], 2mM MgCl2,15mMNaCl,20mM KCl,4mM dithiothreitol)中含 miniP QOng)，γ-32P-适体 RNA(终浓度 50nM)，酵母 tRNA (6 μ g)，分子伴侣蛋白体系(3 μ g Hsp70、360ng Hsp90、200ng Hdj 1、 375ng HopUOOng p23)，RNase 酶抑制剂(40u/μ 1, Takara)及蛋白酶抑制剂 cocktail (1 片/次，Roche)。反应体系30°C孵育2hr后，经5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，真空干胶并压制磷屏底片，放射强度经Perkin Elmer C431200磷屏仪检测后，利用OptiQuant 5.0 software对RNP复合物进行定量分析。
利用竞争性EMSA实验评价适体与miniP的结合特异性在miniP- ε竞争性结合实验中，每 ΙΟμΙ TMNK 反应缓冲液(20mM Tris/HCl [pH7. 5], 2mM MgCl2,15mM NaCl,20mM KCl,4mMdithiothreitol)中含 miniP QOng)，y -32P- ε RNA(终浓度 50nM)，适体 RNAs (如果未加特别说明，作为竞争剂的未标记适体RNA终浓度均为1 μ M)，酵母tRNA (6 μ g)，分子伴侣体系(3μ g Hsp70、360ng Hsp90、200ng Hdjl、375ng HopUOOng p23)，RNase酶抑制剂 (40ιι/μ 1，Takara)及蛋白酶抑制剂cocktail (1片/次，Roche)。反应体系30°C孵育2hr后，经5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，真空干胶并压制磷屏底片，放射强度经Perkin ElmerC431200磷屏仪检测后，利用OptiQuant 5. Osoftware对RNP复合物进行定量分析。
5.检测候选诱饵适体S9的抗HBV生物学功能
将S9序列导入含Hl启动子的pSuper载体中，构建成重组载体pSUPER_S9， 利用LipofectomineTM2000试剂盒(Invitrogen)，按操作说明每次在IOcm直径的皿中将M μ g的pSUPER-S9转染H印G2. 2. 15细胞系，48hr后用Iml NP40缓冲液(IOmM Tris-HCl [pH8. 0]、50mM NaClUmM EDTA)裂解细胞并收获细胞裂解液，Southern blotting 检测细胞中病毒核衣壳内DNA合成能力，所得数据用OptiQuant 5. Osoftware定量； Western blotting检测管家基因β-actin的表达，结果和对照组相比较，以校正各处理组之间的样品误差。
利用含HBV全长基因组的pCH-9/3091与能转录产生S9RNA的pSUPER_S9这二个质粒，以1 1比例共转染HepG2，Southern blotting和Northern blotting分别分析细胞中病毒核衣壳内DNA合成能力和pgRNA含量，所得数据用OptiQuant 5. Osoftware定量； 利用非变性Western blotting检测细胞中病毒核衣壳装配情况是否受到影响；作为内参， 利用Westernblotting检测管家基因β -actin的表达，发现和对照组相比无变化，从而排除了样品差异。
以上二组瞬时转染实验中，均采用MTT法分析细胞毒性。转染H印G2. 215细胞系和HepG2细胞系M小时后，将实验组(转染pSUPER-S9)和对照组(无质粒转染、转染 pSUPER-siRNA、转染pSUPER-mut ε、转染pSUPER)的IOcm细胞培养皿的细胞用胰酶消化后取1/10细胞重悬于ImL DMEM中，再将细胞悬液接种到96孔板每空孔100 μ 1 (约IO4个细胞)，按照Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit (Invitrogen)操作说明进行定量分析，发现实验组与对照组间活细胞数量无显著性差异(P > 0.05)，排除S9对细胞内HBV 复制的影响是因为非特异性的细胞毒作用造成。
6.结果分析
(1)体外SELEX筛选与miniP高亲和的适体RNAs，说明如下
随机化ε RNA文库-S文库，包含ε RNA上茎结构中23个核苷酸位点的随机化(比较图2与图幻，按照Τ7体外转录试剂盒(Ambion)操作说明制备S文库，经OD26tl值和12% 变性聚丙烯酰胺凝胶检测后用于体外SELEX筛选。本发明按照图1所示步骤进行了连续三轮体外SELEX筛选，随后检测了所筛选适体RNAs与目的蛋白miniP蛋白的亲和力、竞争性结合能力，证明适体RNAs-miniP蛋白的结合位点与野生型HBV ε RNA-miniP蛋白的结合位点相同；又将SELEX筛选过程中的RT-PCR扩增产物用作测序模板，以包含T7启动子的寡聚核苷酸为测序引物，按iThermo Sequenase Cycle Sequencing Kit (USB)操作说明进行手工测序，借此追踪每一轮筛选产物在随机化位点的核苷酸富集趋势以评价SELEX筛选的进程，经过3轮筛选后发现，富集趋势已相当明显，提示已经获得与miniP高亲和的适体RNAs。
(2)分离适体RNAs并测定其序列信息，结果说明如下
三轮SELEX筛选后，将第3轮筛选所得适体RNAs经RT-PCR扩增后的cDNA产物利用EcoRI和^CbaI克隆到pUC19载体中，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞后，随机挑选10个单克隆抽提质粒，经验证全部为阳性克隆，所得重组质粒经KpnI线性化后，用于适体RNAs 的手工测序以获得所分离、挑选适体RNAs的序列信息，图4是部分测序结果显示适体S3、S6、S9的序列信息。
(3)适体RNAs的理论二级结构预测及候选诱饵适体的挑选，结果说明如下
利用在线Mfold 软件(http://mfold.rna.albany.edu/ ？ q = mfold/ RNA-Folding-Form)对所分离适体RNAs的理论二级结构进行预测，并依据二级结构的相似性分组，从与野生型ε RNA 二级结构相似的组中挑选3个有代表性的适体-S3，S6和S9进一步定性，研究它们与miniP的亲和力和结合特异性，三种适体理论二级结构见图5至图7。
所得适体的序列信息为
S3 :5’ -UGUUCAU⑶CCUACUGUUCAAAAACAUGCCCU⑶GCCAAAGCAAAAAUUGGGGCAUGGAC A-3，。
S6 :5’ -UGUUCAU⑶CCUACUGUUCACAGAAAAUAGCUGUGCAAAAAAAAAAGAUGGGGCAUGGAC A-3，。
S9 :5’ -UGUUCAU⑶CCUACUGUUCAAACAAAAAAACUGUGCACAAAAAUAAAUUGGGGCAUGGAC A-3，。
(4)对三种适体的进一步定性，说明如下
适体与目的蛋白的亲和力经EMSA测定并计量其相对结合强度(图8)，结果表明， 适体S3的蛋白结合活性与wt ε RNA相当，S6的蛋白结合能力要强于wt ￡1 嫩，是衬ε RNA 蛋白结合能力的2. 1倍；S9的蛋白结合活性最强，是wt ε RNA蛋白结合能力的7. 5倍，该结果证实本研究中分离并挑选的适体具备较强的P蛋白结合能力。
适体的竞争性结合能力经竞争性EMSA测定并计量其相对结合强度(图9)，结果表明，过量(20倍于标记探针)的未标记适体RNA的存在使得32P-Wt ε RNA与MiniP的结合信号降低了至少90%，表明它们能竞争抑制wt ε RNA与miniP蛋白之间的结合，证明它们识别并结合位于P蛋白上的相同的ε结合位点。为进一步验证该结论，随后挑选竞争性结合效果类似但蛋白结合能力不同的S6和S9，将50nM 32P标记的wt ε RNA探针和逐渐递减浓度的未标记适体竞争剂混合后与目的蛋白MiniP孵育(图10)，结果表明，与MiniP蛋白结合能力稍弱的S6在0.25μΜ几乎没有表现出竞争性效果(S6 vs无竞争子的对照组= 95% vs 100% )；当其浓度达到0.5μ M时，32P-Wt ε RNA探针与P蛋白之间的结合能力下降到68% ；而当S6的摩尔浓度达到绝对过量(1 μ Μ, 20倍于标记探针)时，32P-Wt ε RNA与 P蛋白结合信号仅12%，显示抑制效果达到顶峰。相比之下，S9在0. 25 μ Μ、0. 5 μ Μ、1 μ M表现出更强的竞争力，信号分别衰减为71%、39%和9%。该结果证明了适体RNAs是通过结合到相同于wt ε结合位点来发挥其抑制效果，它们在体外能够发挥其竞争性结合的生物学功能，有发展为诱饵适体的潜能。
由于适体S9与miniP的亲和力比wt ε RNA与后者高约7. 5倍(图8)，且该适体在三个适体中具有最佳的与目的蛋白MiniP的结合特异性(图10)，我们构建重组载体 PSUPER-S9，利用 Lipofectomine 2000 (Invitrogen)转染 HBV 稳定表达细胞系-!fepG2. 2. 15，Southernblotting检测胞内病毒核衣壳内HBV复制中间体DNA。 结果表明虽然S9抑制HBV复制的效果要稍逊于一种特异性针对HBV基因组DRl region (1826-1845nt)的 shRNA(56 士 2. 5vs 40 士 3· 2)，相比转染 pSuper 空载体的对照组依然明显压抑胞内核衣壳中的HBV DNA合成(56士2.5vs 100士0.0)；而转染P蛋白结合缺陷 RNA (mut ε )的对照组在病毒DNA合成水平上则与转染pSuper空载体的对照组几乎没有差异(103士2. Ivs 100士0.0)；作为内参，Western blotting检测管家基因β-actin的表达，各处理组之间无样品差异，表明适体S9抑制H印G2. 2. 15胞内病毒核衣壳中DNA的合成是特异性的(图11)。
同时，我们也对诱饵适体S9在瞬时HBV表达细胞系H印G2中干扰HBV复制的情况进行了分析，见图12，共转染结果表明1)胞内核衣壳中HBV复制中间体DNA水平明显被引入的诱饵适体S9抑制，抑制效果和shRNA进行了比较。尽管适体S9对HBV复制水平的抑制效果要稍逊于shRNA(20士2. 7vs 11 士2. 0)，但病毒核壳体内DNA合成能力下降到20% ；而转染一个P蛋白结合缺陷体RNA (mut ε )的对照组在病毒DNA合成水平上则与转染pSuper 空载体的对照组没有差异(99士3.5vs 100士0.0) ；2)与shRNA类似，适体S9的引入明显压抑了胞内核衣壳中的PgRNA含量(32 士 6. 3vs 100 士 0.0)；幻不同于shRNA明显压抑胞内特异性核衣壳装配，适体S9的引入对胞内核衣壳的装配并无明显影响。
最后，我们利用MTT实验证明诱饵适体S9的引入并未对宿主细胞产生明显的细胞毒作用(表1)。表1中实验结果表示为平均吸光度490nm士标准差，数值来自于三次独立实验的平均值，每次实验设三个重复，各组间统计学上无显著差异性P > 0. 05。
上述结果表明诱饵适体S9在细胞内能够通过竞争性结合作用抑制HBV ρ- ε复合物的形成，从而起到抑制HBV复制的作用，其作用机理如图13所示，由于诱饵适体S9和 shRNA相比抗病毒特异性高，而且后者在肝细胞内因诱导干扰素和脱靶效应产生细胞毒作用，因而抗HBV的RNA诱饵药物具有更为优越的应用前景。
附表
表1诱饵适体S9在瞬时转染!fepaG2. 2. 15和!fepG2 二种细胞系后的细胞毒作用
细胞系 Lipofectamine 质粒490nm吸光值2000HepaG2. 2. 15 40.6896±0.0725-t- pCH-9/3091+ pSUPER0.6834士 0.05644- pCH-9/3091+ siRNA0.6811±0.09174- pCH-9/3091+ mut ε0.6560±0.0297-t- pCH-9/3091+ S90.6533士 0.0115HepaG2 40.6863±0.11934- pCH-9/3091+ pSUPER0.6825±0.0564-t- pCH-9/3091+ siRNA0.6821±0.08774- pCH-9/3091+ mut ε0.6571±0.03104- pCH-9/3091+ S90.6547±0.021权利要求
1.一种抗HBV诱饵适体，其特征是该适体能竞争性抑制人HBV中特异性P-ε相互作用，是通过SELEX技术筛选获得的，具体是体外制备ε上茎23个核苷酸随机化的ε RNA 文库，利用SELEX技术经多轮筛选，从该ε RNA文库中富集、筛选与目的蛋白HBV miniP高亲和的适体RNAs ；然后手工测序获得10个适体RNAs的序列信息，并依据二级结构的相似性分组，从与野生型ε RNA 二级结构相似的组中挑选有代表性的适体S3、S6、S9进行定性； 对于具有高亲和性和高结合特异性的适体S9，通过细胞转染实验证实了其抗HBV生物学功能；所述S9的序列为5’ -UGUUCAU⑶CCUACUGUUCAAACAAAAAAACUGUGCACAAAAAUAAAUUGGGGCAUGGACA-3 ’。
2.一种抗HBV诱饵适体的筛选方法，其特征在于采用以下步骤进行适体的体外SELEX 筛选(1)体外制备εRNA突变文库用于SELEX筛选为体外制备ε RNA突变文库，设计并合成92-mer寡聚核苷酸引物D印sNuppS (-)，该模板包含61nt的ε RNA的序列信息，其中ε上茎的23个核苷酸序列全部随机化，在ε RNA 序列信息的3’下游包含与Τ7启动子序列互补的序列信息，在ε RNA的上下游还分别包含限制性内切酶位点序列，以便进行体外转录和后续克隆；此外，还合成了包含Τ7启动子序列的 22-mer 引物 T7prom01igo (+)，以上二种引物经体外粘连杂交后，形成完整的T7启动子，利用T7转录试剂盒体外转录合成获得初始ε RNA文库，用于SELEX筛选；(2)体外SELEX筛选获得与miniP高亲和的适体RNAs将IOOng纯化的miniP蛋白与以上终浓度1 μ M初始ε RNA文库在30 μ 1伴侣分子体外结合系统中30°C孵育》ir，随后加入含Ni2+-NTA球珠的预冷结合缓冲液，低温孵育lhr， 利用miniP蛋白的组氨酸标签将所形成的miniP- ε RNA文库复合物吸附到Ni2+-NTA球珠上，先后以预冷结合缓冲液和TMK缓冲液洗去反应体系中未结合或弱结合的适体RNAs ； miniP- ε RNA复合物经苯酚抽提、无水乙醇沉淀后，分离结合的RNAs ；该RNAs经RT-PCR扩增富集后得到的cDNA产物，用作下一轮SELEX筛选的RNAs转录模板；(3)手工测序获得适体RNAs的序列信息并依据二级结构的相似性分组将经过3轮SELEX筛选分离的适体RNAs经RT-PCR扩增后克隆到pUC19载体中，重组载体经Kpn I线性化后，凝胶回收线性化DNA用作测序模板，以32P标记的包含T7启动子的寡聚核苷酸 T7RTD印s01igo(+)为测序引物，按 Thermo Sequenase CycleSequencing Kit(USB)操作说明进行手工测序；利用在线Mfold软件对所分离的10个具有不同上茎序列的适体RNAs的理论二级结构进行预测，并依据二级结构的相似性分组，从与野生型 ε RNA 二级结构相似的组中挑选3个有代表性的适体S3、S6、S9进行定性；(4)对代表性适体与miniP的亲和力和结合特异性进行定性利用凝胶迁移率移动实验EMSA评价诱饵适体与目的蛋白miniP的亲和力；利用竞争性 EMSA实验评价适体与miniP的结合特异性；(5)检测高亲和力、高结合特异性的适体S9在细胞内的抗HBV能力构建包含S9序列的重组载体pSUPER-S9，将其转染HBV持续复制细胞系_!fepG2. 2. 15 ； Southern blotting分析细胞中新生的病毒核衣壳内DNA合成能力，所得数据用OptiQuant 5.0 software定量；作为内参，Wfestern blotting检测管家基因β-actin的表达，结果和对照组相比较，校正样品间差异；用MTT法比较各处理组之间的活细胞差异，排除非特异性的细胞毒作用；同时，将含HBV全长基因组的pCH-9/3091与pSUPER_S9以1 1比例共转染H印G2细胞系；Southern blotting和Northern blotting分析细胞中病毒核衣壳内DNA合成能力和 PgRNA含量，所得数据用OptiQuant 5. Osoftware定量；利用非变性^festern blotting检测细胞中病毒核衣壳装配情况是否受到影响；Western blotting检测管家基因β-actin的表达，结果和对照组相比较，校正样品间差异；用MTT法比较各处理组之间的活细胞差异， 排除非特异性的细胞毒作用；经过上述步骤，确立S9作为用于抗HBV的诱饵适体，该S9的序列为 5 ’ -UGUUCAU⑶CCUACUGUUCAAACAAAAAAACUGUGCACAAAAAUAAAUUGGGGCAUGGACA-3 ’。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(1)中，所述92-mer寡聚核苷酸引物D印sNuppS(-)的序列为5’ -GGTACCTGTCCATGCCCCA(N)12GCACAG(N)11GAACAGTAGGACATGAACAGCCCTATAGTGAGTCG TATTAATTC-3’，随机化序列以N标注；所述 22-mer 的 T7prom01igo (+)序列为5，-GAATTAATACGACTCACTATAG-3，。
4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤O)中，所述伴侣分子体外结合系统由10 μ g Hsp70、lyg Hsp90b、0.6yg HdjlU. 2μ g Hop、 0. 3 μ gp23 组成；所述预冷结合缓冲液由 0. IM Na2HP04/NaH2P04[pH7. 4], 150mM NaCl、20mlOmidazol、 0. 1 % (V/V) NP-40 及 100 μ g/ml 酵母 tRNA 组成；所述 TMK 缓冲液由 ρΗ7· 5 的 50mM Tris/HCl, IOmM MgCl2,40mM KCl, 100 μ g/ml 酵母 tRNA组成。
5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(2)中，SELEX筛选中RT-PCR所应用的引物序列为RTDepsOliogo(-) :5， -CAATCTGCAGTCTAGATAAGGTACCTGTCCATGCCCCA-3’ T7RTD印sOligo(+) :5， -CCCCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGTTCATGT-3， 其中，T7RTDeps01igO(+)也是步骤(3)中所述的测序引物。
6.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤( 中，所有PCR循环都被限制在 15-18个循环，以避免RT-PCR扩增过程中出现过量的非特异性产物。
7.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤中， (1)采用以下方法评价适体与目的蛋白miniP的亲和力将适体RNA或野生型ε RNA 5，末端去磷酸化后，以3000 Ci/mmol γ-32P-ATP和T4 磷酸化激酶对RNA 5’末端放射性磷酸化标记，标记RNA利用Quick Spin columns进行纯化；在 miniP-ε 直接结合实验中，采用了由 ρΗ7. 5 的 20mM Tris/HCl, 2mM MgCl2,15mM NaCl,20mM KCl和4mM dithiothreitol组成的TMNK反应缓冲液；每10 μ 1 TMNK反应缓冲液中含 20ng 的 miniP,终浓度为 50nM 的 y -32P- ε RNA, 6 μ g 酵母 tRNA,由 3 μ gHsp70、360ng Hsp90、200ng Hdjl、375ng Hop 和 IOOng p23 组成的分子伴侣蛋白体系，40u/μ 1 的 RNase酶抑制剂，以及1片/次的蛋白酶抑制剂cocktail ；反应体系30°C孵育2hr后，经5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，真空干胶并压制磷屏底片，放射强度经Perkin Elmer C431200磷屏仪检测后，利用OptiQuant 5. Osoftware对 RNP复合物进行定量分析；(2)采用以下方法评价适体与miniP的结合特异性在miniP-ε竞争性结合实验中，利用5’末端32P标记的野生型ε RNA和20倍过量浓度的未标记适体RNA混合，测试它们竞争MiniP蛋白的能力，从而确定适体对MiniP的结合特异性；采用了由 ρΗ7. 5 的 20mM Tris/HCl,2mM MgCl2,15mM NaCl,20mM KCl 和 4mM dithiothreitol组成的TMNK反应缓冲液；每10 μ 1 TMNK反应缓冲液中含20ng的miniP, 终浓度为50nM的γ」2Ρ- ε RNA, 1 μ M未标记的适体RNAs，6 μ g酵母tRNA，由3 μ gHsp70、 360ng Hsp90、200ng Hdjl、375ng Hop禾口 IOOng p23 组成的分子伴侣体系，40u/μ 1 的 RNase 酶抑制剂，以及1片/次的蛋白酶抑制剂cocktail ；反应体系30°C孵育2hr后，经5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，真空干胶并压制磷屏底片，放射强度经Perkin Elmer C431200磷屏仪检测后，利用OptiQuant 5.0 software对 RNP复合物进行定量分析。
8.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(5)中，采用以下方法检测适体 S9在H印G2. 2. 15细胞内对HBV复制的影响构建包含S9序列的重组载体pSUPER_S9，利用LipofectomineTM2000，按操作说明将MygW pSUPER_S9瞬时转染IOcm细胞培养皿中的 H印 G2. 2. 15 细胞，48hr 后用一种由 IOmM Tris-HCl [pH8. 0],50mM NaClUmM EDTA 组成的 Iml NP40裂解液裂解细胞并收获细胞裂解液，Southern blotting检测适体S9的引入对细胞中病毒核衣壳内DNA合成的影响，所得数据用OptiQuant 5.0 software定量；作为内参， Western blotting检测管家基因β-actin的表达，并与对照组比较，以校正各处理组之间的样品误差。
9.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(5)中，采用以下方法检测适体 S9在!fepG2细胞内对HBV复制的影响PSUPER-S9重组载体与含HBV基因组表达载体pCH-9/3091以1 1比例共瞬时转染 H印G2细胞，48hr后收集细胞，纯化胞内HBV核衣壳；其中，1/3用来抽提核衣壳内的HBV复制中间体DNA，1/3用来抽提核衣壳内的pgRNA，并用32P标记的HBV特异基因片段为探针分别做Southern blotting和Northern blotting，分析引入S9对病毒核衣壳内DNA合成和核衣壳内PgRNA含量的影响，所得数据用OptiQuant 5. 0 software定量；剩余1/3用非变性Wfestern blotting检测对病毒核衣壳装配的影响；Western blotting检测管家基因β-actin的表达，并与对照组比较，以校正各处理组之间的样品误差。
10.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(5)中，采用MTT法比较各处理组之间的活细胞差异瞬时转染H印G2. 215或!fepG2细胞系Mhr后，将实验组和对照组 IOcm细胞培养皿的细胞用胰酶消化后取1/10细胞重悬于ImL DMEM中，再将细胞悬液接种到 96 孔板，每空孔 100μ 1，按照Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit 操作说明进行定量分析，排除S9对细胞内HBV复制的影响是由于非特异性的细胞毒作用造成；所述实验组是指转染PSUPER-S9的实验组，所述对照组是指包括无质粒转染、转染pSUPER-siRNA、转染pSUPER-mut ε、转染空载体pSUPER的对照组。
全文摘要
本发明利用体外SELEX筛选技术，以人HBV中特异性P-ε相互作用为靶标，筛选获得抗HBV诱饵适体，具体是体外制备上茎23个核苷酸随机化的εRNA文库，利用SELEX技术从该文库中富集、筛选与目的蛋白HBVminiP高亲和的适体RNAs；然后手工测序获得10个适体RNAs的序列信息并依据二级结构的相似性分组，从与野生型εRNA二级结构相似的组中挑选有代表性的适体S3、S6、S9进行定性；通过细胞转染实验证实了S9具有抗HBV生物学功能。本发明提供的诱饵适体S9，能够在细胞内通过竞争性结合作用有效抑制野生型P-ε复合物的形成，达到抑制HBV复制的效果。
文档编号C12Q1/68GK102533772SQ20111041073
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者冯辉, 周明, 胡康洪 申请人:中国科学院武汉病毒研究所