专利名称：二化螟与台湾稻螟的分子生物学区分方法
技术领域：
本发明涉及水稻害虫二化螟(Chilo suppressalis walker)和台湾稻螟(Chiloauricilia Dudgeo)的分子生物学区分方法，属于生物技术领域。
背景技术：
二化螟和台湾稻螟是水稻上的常发性害虫，由于都属于钻蛀性害虫，较难防治，常常造成水稻的大面积减产。二化螟和台湾稻螟的危害方式相似，幼虫都是先在叶鞘处危害，再从叶鞘处蛀孔侵入稻茎内。对水稻造成的危害状态也非常相似，都会形成枯鞘、枯心、枯孕穗等症状，根据稻田内的危害状况，我们无法准确判断是二化螟导致的危害还是台湾稻螟导致的危害。二化螟和台湾稻螟的幼虫通常都为6龄，幼虫体色相似且背部都有5条褐色纵线，利用肉眼观察很难将两者区分开来。再者，当二化螟或台湾稻螟被微生物感染后，虫体完全丧失原有的形态特征，导致无法判断是何种螟虫。目前对于二化螟和台湾稻螟的鉴定，通常是借助于形态学特征来区分，这必须保证待测样本的关键形态学特征完好无损，但如上所述，当形态特征丧失后，则无法准确区分二化螟和台湾稻螟，这极大限制了二化螟和台湾稻螟相关领域的研究。例如，若要研究某地区二化螟或台湾稻螟的微生物侵染状况，但由于无法准确区分被微生物侵染的样本是何种螟虫，所以这一领域的研究受到了很大的限制。为了解决这一难题，我们发明了这一分子生物学区分方法。
发明内容
1、发明目的提供一种准确区分二化螟和台湾稻螟的分子生物学方法，为非昆虫分类学教育背景的相关人员提供一种可靠的二化螟和台湾稻螟的区分方法。2、技术方案以待测样本的基因组DNA为模板，禾Ij用特异引物F:5，-GGGCAAGAAAGTAGACGCCTGGTT-3，和 R 5，-AAAACCCAAAGAGGCGACACGGTA-3，进行 PCR 扩增。扩增产物用限制性核酸内切酶MspAl I进行酶切消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳。如果只有一条400bp的片段，则所检测的样本二化螟；如果得到两条片段分别为M7bp和15!3bp，则所检测样本为台湾稻螟。3、有益效果本发明的方法与传统方法相比，主要优点有(1)准确性高传统方法会因为不同的鉴定人对各分类特征把握的不准确而导致鉴定结果出现误差。而本发明的方法是基于PCR的分子检测技术，而PCR技术已经发展的很成熟，拥有标准化和傻瓜化的实验流程，保证了结果的高准确性。( 灵敏度高传统方法对丧失形态学特征的样本无法进行区分。而基于本发明的方法，只要能从待测样本中提取微量的基因组DNA，就能够扩增得到目标PCR产物，从而完成对待测样本的鉴定。具体实施例方式1、样本基因组DNA的提取利用上海生工UNIQ-10柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取样本的基因组DNA，具体操作如下(1)待检测的样本，在液氮中磨成粉末，并转移置1. 5ml的离心管中；(2)加入300 μ 1 ACL Solution和20 μ 1的蛋白酶K。(预先将蛋白酶K置37°C温育1小时，以利于激活蛋白酶K的活性)；(3)涡旋震荡混勻1分钟，然后置于55°C水浴放置1-3小时，在此期间可以适当取出混勻，有助于充分裂解；(4)取出样品，待降至室温后轻轻晃动混勻，然后12，OOOrpm离心5分钟；(5)吸取 300μ 1 上清至 UNIQ-lOColumn，然后再吸取 300μ 1 的 AB Solution 至UNIQ-IOColumn中，上下颠倒混勻2_3次，室温静置3分钟；(6)3，OOOrpm离心3分钟，取下UNIQ-lOColumn，倒掉收集管中废液；(7)将 UNIQ-IOColumn 放回收集管中，加入 500 μ 1 Wash Solution，8，OOOrpm，室温离心30秒；(8)重复步骤(7) —次；(9)取下UNIQ-lOColumn，弃去收集管中的废液，将UNIQ-IOColumn放回收集管中，10，OOOrpm,室温离心30秒，以除去残留Wash Solution ；(10)将UNIQ-lOColumn放入干净1. 5ml的离心管中，在UNIQ-lOColumn中央加入50 μ 1 Elution Buffer，室温放置2-3分钟。再10，OOOrpm，室温离心1分钟。离心管中的液体即为样本的基因组DNA，于-20°C保存备用。2、PCR体系的配制使用25 μ 1 的 PCR反应体系，包括2. 5 μ 1 的 10XPCR Buffer (Mg2+ Free)、2 μ 1 的dNTPs (2. 5mmol/L)、l. 5μ 1 的 MgCl2 Q5mmol/L)、上游和下游引物(10ymol/L)各 Ιμ 、样本基因组 DNAl μ 1,0. 125 μ 1 的 iTaq DNA Polymerase (TakaRa)，再加灭菌水补足至 25 μ 1。3、PCR扩增程序940C 3 分钟；94°C 30 秒、60°C 30 秒、72°C 50 秒(32 个循环)；72°C 8 分钟。4、PCR产物的MspAl I酶切消化10 μ 1 的酶切体系，包括1μ 1 的 IOXBuffer 4,0. 1μ 1 的 100XBSA、0. 25 μ 1 的MspAl I酶、PCR产物彡0. 5 μ g，加灭菌水补足至10 μ 1。之后37°C温育1-2小时。5、酶切产物的电泳检测酶切产物在2 %的琼脂糖凝胶上进行电泳，稳流80mA，电泳40分钟，溴化乙锭(EB)染色后在紫外等下观察，根据DNA Marker判断电泳条带的大小。若电泳显示只有一条长400bp的片段，则表示待测样本为二化螟；若电泳显示有两条片段，分别长M7bp和15!3bp，则表示所测样本为台湾稻螟。实施例2011年11月，我们在广东河源田间采集到3份被微生物侵染的样本，通过形态学观察无法确定样本是二化螟还是台湾稻螟，则利用本发明方进行鉴定，结果显示，这三份样本均为台湾稻螟。检测结果见说明书附图中的图2。
五
图1 二化螟和台湾稻螟的特征性电泳图谱图2广东河源田间采集样本的检测结果在图1中，“Csu”指示的是二化螟样本，“Cau”指示的是台湾稻螟样本。在图2中，A、B、C所指示的三条泳道表示3份检测样品。在图1和图2中，“M”所指示的泳道是DNAMarker，从上到下依次为 IOOObp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp。在“摘要附图” Word文档中的图即为“说明书附图” Word文档中的图1。
权利要求
1.一种利用分子生物学手段准确区分二化螟和台湾稻螟的方法，其特征是当常规形态学方法无法区分样本是二化螟还是台湾稻螟时，提取待检测样本的基因组DNA做为PCR 的模板，利用所设计的特异引物进行PCR扩增，扩增产物再用利用限制性核酸内切酶进行酶切消化，最后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳条带来准确区分待检测样本是属于二化螟还是台湾稻螟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是利用我们所设计的特异引物进行PCR扩增， 在二化螟中扩增获得的片段上没有MspAl I切割位点，PCR产物酶切后电泳只有一条条带， 长400bp，而在台湾稻螟中扩增得到的片段上存在一个MspAl I的切割位点，PCR产物酶切后电泳显示有两条条带，分别长M7bp和15!3bp。
全文摘要
本发明涉及水稻害虫二化螟和台湾稻螟的分子生物学区分方法，属于生物技术领域。以基因组DNA为模板，用特异性引物F5’-GGGCAAGAAAGTAGACGCCTGGTT-3’和R5’-AAAACCCAAAGAGGCGACACGGTA-3’进行PCR扩增，扩增产物用限制性内切酶MspA1 I进行酶切消化，如果仅得到一条长400bp的片段，则说明所检测的样本为二化螟；如果得到两条片段分别为247bp和153bp，则说明所检测的样本为台湾稻螟。该方法稳定性高、周期短、灵敏度高，专用于二化螟和台湾稻螟的高灵敏度快速检测区分。
文档编号C12Q1/68GK102559922SQ20121006454
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月13日 优先权日2012年3月13日
发明者刘宝生, 张志春, 张谷丰, 方继朝, 罗光华, 郭慧芳 申请人:江苏省农业科学院