水稻源抗螟虫和纵卷叶螟基因rlep1及其编码产物与应用的制作方法

专利名称：：水稻源抗螟虫和纵卷叶螟基因rlep1及其编码产物与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别地，涉及一种水稻源抗螟虫和纵巻叶螟基因iL五i^及其编码产物与应用。
背景技术：
：随着全球人口的增加和耕地面积的减少，人们对粮食单产的要求越来越高。虫害造成的粮食损失一般约占粮食总产量的10-30%,重灾年份则颗粒无收，因此如何减少虫害以增加粮食总产量，是人们面临的迫切问题。仅仅依赖化学农药无法解决，据文献报道水稻螟虫对几乎所有现在使用的杀虫剂都产生了或多或少的抗药性；现在研究和开发一款新杀虫剂的费用越来越高，周期也越来越长，并且每一个新的杀虫剂投入使用几年后都会面临抗药性产生的问题。培育抗性品种是减少害虫危害的一个重要措施，是我国农业病虫害综合防治的重要组成部分，是减少化学农药施用、减少环境污染、保证粮食生产安全的重要保障之一。水稻螟虫和纵巻叶螟是水稻的重要害虫，稻纵巻叶螟幼虫取食水稻嫩叶和剑叶，水稻分蘖期、孕穗期受害时，大大影响水稻光合作用，使生长受阻；抽穗期剑叶受害对产量更有直接的影响，造成千粒重降低，秕谷率大幅增加，一般使水稻减产10-15%,重者可达50%。二化螟幼虫钻入叶鞘内部为害，随后转入茎秆，导致水稻枯鞘、枯心、白穗等症状，导致10-30%的减产。由于耕作制度的改变，免耕技术、机械收割等实施有利于水稻害虫越冬，以及滥用农药和单一用药导致害虫的抗药性十分突出，导致从上世纪末以来连年大爆发，危害造成的损失不断加重，而且呈现北上之势。据全国农技中心调査，二化螟在江淮、长江流域、江南大部稻区连续大发生，华南北部、华北和东北稻区发生危害明显上升；从全国范围看，二化螟发生比上世纪90年代初上升了43%，受灾严重地区(如湖南、江西等部分地区)达到5-10倍；二化螟导致的水稻损失率比90年代初上升了2-3倍，已对我国水稻安全生产构成了严重威胁。有关水稻对纵巻叶螟和螟虫的抗性研究已经进行了数十年，虽然国际水稻研究所通过杂交获得了几个抗螟虫的水稻品系。但是，至今为止在对水稻抗纵巻叶螟和螟虫的分子生物学机理未取得突破，尚未有抗性基因被分离和鉴定。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种水稻源抗螟虫和纵巻叶螟基因W五尸/及其编码产物与应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种水稻源抗螟虫和纵巻叶螟基因它具有SEQIDNo.l的DNA序列。一种上述水稻源抗螟虫和纵巻叶螟基因iL五尸7的编码蛋白，它包含SEQIDNo.2的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQIDNo.2的氨基酸残基序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与SEQIDNo.2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQIDNo.2衍生的蛋白质。上述水稻源抗螟虫和纵巻叶螟基因iI五尸/在转基因植物中和作物育种中的应用。本发明的有益效果是，本发明利用抑制消减杂交mRNA技术SSH方法和基因芯片技术分析了水稻在害虫为害后的差异表达基因，结合RT-PCR和RACE技术分离获得了水稻源抗螟虫和纵巻叶螟基因i^五P7;以基因片段合成同位素探针，应用Northern杂交方法分析了M￡P7基因分别在水稻螟虫和纵巻叶螟取食为害后的表达情况；通过将RLEP1蛋白与绿色荧光蛋白GFP融合结合激光共聚焦技术对M五尸7基因编码蛋白进行了亚细胞定位，发现RLEP1蛋白在叶绿体内发挥蛋白生化功能。利用基因沉默和过量表达技术研究了ifL五i^基因的生物学功能，发现/^Ei^基因是水稻抗螟虫和纵巻叶螟的重要抗虫基因。该基因的分离与克隆，对于作物的抗虫育种，尤其对水稻的抗螟虫和纵巻叶螟育种将起到重要的促进作用。图1是/Z^W基因特异PCR扩增产物凝胶电泳图2是反义抑制双元表达载体pl301-An^I五户7基因酶切鉴定；图3是水稻受二化螟为害后^Z^尸/基因基因的表达情况电泳图；图4是基因在水稻染色体上的定位图；图5是^^尸7基因编码蛋白的亚细胞定位图6是以基因片段构建的反义抑制植物表达载体质粒图谱；图7是二化螟取食对反义抑制基因水稻与正常水稻危害程度比较；图8是稻纵巻叶螟取食对反义抑制iL五尸7基因水稻与正常水稻危害程度比较。具体实施例方式本发明利用抑制消减杂交技术SSH和基因芯片检测技术，分析了水稻在害虫为害后所诱导的差异表达基因。并从SSH克隆库中分离获得iL五i^基因片段，分别通过3'-RACE和5'-RACE方法获得了该基因的5'端和3'端基因序列片段。利用DNAstar软件，将获得的5'端、3，端和SSH克隆库中分离的基因片段，拼接出iZ^/^基因全长序列。以此获得的基因全长序列为基础，在5'端和3'端非编码区设计一对引物RLEP1-F1和RLEP1-R1。提取螟虫取食为害后的水稻叶片总RNA分离纯化出mRNA并反转录成cDNA，以此cDNA为模板并以RLEP1-F1和RLEP1-R1为引物，用pfli高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，获得/1^户/基因序列并连接到TAKARA公司的pMD19-T克隆载体进行DNA测序验证。同位素标记i^五尸/基因特异性片段进行Northern杂交，结果证明水稻螟虫和纵巻叶螟取食诱导iL五尸/基因的表达。对基因的开放阅读框序列编码的蛋白生物信息学分析，发现RLEP1蛋白的N端存在叶绿体信号肽，预示该基因可能定位于水稻叶绿体，我们在RLEP1蛋白的C端连接了一个增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，构成一个RPH1/EGFP融合蛋白证实RLEP1蛋白在叶绿体中发挥生化功能。并且，构建了iL五尸/基因的反义、过量表达载体、RNAi表达载体，以电击法转化农杆菌获得i^五i^基因的3个工程菌。通过基因沉默技术对iL五P7基因抗水稻螟虫和纵巻叶螟等生物学功能进行了深入研究。以本实验建立的水稻愈伤遗传转化体系，获得了基因反义、RNAi和正义转基因水稻植株。通过生物测定，证明了iZ^尸/基因是水稻的一个重要抗水稻螟虫和纵巻叶螟基因。该基因的分离和克隆以及生物学功能的分析，对于作物的抗虫育种，尤其对水稻的抗螟虫、纵巻叶螟育种将起到重要的促进作用。实现本发明的具体技术步骤如下1.水稻源抗螟虫和纵巻叶螟基因iLEP/的分离和序列分析利用基因芯片技术和SSH技术分析了水稻在二化螟取食为害后的差异表达基因，获得害虫为害诱导的特异表达基因克隆库，并筛选到单克隆L-Y200G6411。测序分析发现此克隆并没有覆盖该基因的完整编码区。为了获得该片段的完整编码区序列，我们用3'-RACE和5'-RACE技术扩增该片段的3'末端和5'末端片段。根据L-Y200G6411序列，设计用于RACE的正向引物RLEP1-RACE-F和反向引物RLEP1-RACE-R，根据TaKaRaRace试剂盒方法，以二化螟取食水稻茎秆mRNA为模板合成cDNA第一链和第二链。以正向引物RLEP1-RACE-F与3'RACE锚定引物P3配对，反向引物RLEP1-RACE-R与5'RACE锚定引物P5配对作常规PCR分别获得L-Y200G6411的5'RACEPCR片段和3'RACEPCR片段，PCR片段分别经PCR片段回收试剂盒纯化后，送上海生物工程有限公司测序，得到L-Y200G6411的5'末端和3'末端序列。以L-Y200G6411的5'末端和3'末端序列信息，分别在5'端和3'端非编码区重新设计一对引物RLEP1-F1和RLEP1-R1，并以上面合成的cDNA双链为模板，以TAKARApfb高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增片段经琼脂糖分离纯化后连接入pMD-19克隆载体，挑取4个克隆送上海生物工程公司测序验证，每个克隆分别从正向与反向测通2次。测序结果，用生物信息专业DNA拼接软件Conting3.1拼接获得iL五尸7基因DNA序列(序列表SEQIDNo.l)。根据该序列的开放阅读框(ORF)，推算出该基因编码蛋白的氨基酸序列，如SEQIDNo.2所示。2.iL五P7基因在害虫为害后的表达谱分析水稻经二化螟(SSB)取食为害0，2，4，8，12，24，48h的茎杆，以及部分时间点的叶片组织，用Trizol法提取其总RNA，分别将10吗各时间点RNA经1%甲醛电泳分离后，通过毛细管上吸的方法转到带正电尼龙膜上，经紫外交联固定RNA在膜上。以iI五尸/基因特异性片段合成同位素探针，对膜进行杂交分析。Northern杂交结果证明^￡户/在害虫取食1h就开始诱导表达，24h后表达丰度达到最大(图3，SSB-S)。此外，在二化螟未直接取食为害的水稻叶片中，也检测到iL5i^基因的mRNA被诱导表达(图3，SSB-L)。3.虹￡尸7基因编码蛋白亚细胞定位ME尸/基因测序获得的序列进行生物信息学分析，发现^￡户/基因定位于水稻第8染色体上(图4A和B)，同时发现含有叶绿体定位信号肽。为了证实基因编码蛋白定位于叶绿上，我们将iL五尸/基因全编码序列不含终止密码子(TGA)插入pEGFP(Clotech，USA)的GFP序列前，再用Xbal将RLEP1-GFP融合序列切下，插入植物表达载体pCAMBIA1301的CaMV35S'启动子下游和CaMV35S'终止子的上游，该RLEP1-GFP融合表达载体，命名为pl301-RLEPl-GFP。构建的pl301-RLEPl-GFP质粒用电击法导入根瘤农杆菌EHA105中，获得含p1301-RLEP1-GFP的EHA105工程菌株。用注射法将EHA105工程菌注入烟草叶片中，具体实验步骤*从-80。C冰箱取出保存的pl301-RLEPl-GFP农杆菌菌株，在LB平板(20mg/LRif，50-100mg/LKan)划板，在28。C培养箱避光培养2天后挑取单克隆，接种到5mlLB培养基(20mg/LRif,50-100mg/LKan)，28°C，250rpm摇床上培养过夜(16h以上)。*取2ml菌液，加入到50mlAAM培养基(20mg/LRif，50-100mg/LKan，100uMAS)，28°C，250rpm摇床上培养至OD600-0.4以上*4°C，4000rpm离心10min，弃上清，沉淀用不含抗生素的AAM培养基(含100uMAS，pH=5.2)重新悬浮，悬浮液的OD600值在0.4-0.7范围内*在烟草叶片的背面用注射器针头扎一个小孔，用无针头注射器吸0.5mlpl301-RLEPl-GFP农杆菌悬浮液*注射器口对准烟草叶片背面的小孔，在叶片正面小孔处用手指抵住注射器*缓慢的推进注射器活塞杆，可以看到菌液慢慢地经小孔往周边扩散*注射后的烟草，在培养箱中26。C黑暗培养24-48h注射的烟草叶片在LEICATCSSP5-DMI6000激光共聚焦显微镜中检测观察。叶绿素自发红色荧光在488nm激发光下，500-530nm下观察；GFP自发荧光在488nm激发光，620-700nm下观察。结果如图5所示，表明RLEP1蛋白定位于叶绿体中。图5中，Ia:红色亮点为叶绿素自发荧光；IIa:绿色亮点为GFP融合蛋白自发荧光；IIIa，叶绿素自发红色荧光与和GFP融合蛋白自发荧光完全重合。4.利用反义、RNAi和过量表达技术分析其生物学功能分别构建含CaMV35S组成型启动子的过量表达、RNAi和反义抑制处E尸/基因表达载体(图6)。反义载体构建是将iI五户/的cDNA全长或片段以PCR扩增或内切酶酶学操作亚克隆方法，反方向连接到CaMV35S启动子或其他启动子下游，再在其后添加一段NOS终止子序列，之后将构建好的这个融合序列整体克隆载体中切下，亚克隆到pCAMBIA1301或其他表达载体上。RNAi载体是将/1￡尸/的cDNA全长或片段以正、反方向连接在内含子两端，得到重组片段，重组片段连接入pMD-18为基础的克隆载体，设计PCR引物以此重组克隆载体为模板，扩增出正向序列-内含子-反向序列片段，再连接到pCAMBIA1301表达在的CaMV35S启动子或其他启动子和NOS终止子之间。过量表达载体构建是将iZ^户/基因编码链全序列，以平末端方式连接到pCAMBIA1301-35S表达载体的CaMV35S启动子或其他启动子和NOS终止子之间。构建的表达载体以电击法转化农杆菌，获得含有表达载体的工程农杆菌，以本实验成熟的农杆菌转基因方法侵染水稻愈伤，愈伤经抗性筛选后获得整合了目的基因的愈伤组织，再经分化培养基和生根培养基中培养，获得iL五iV基因反义、RNAi和过量表达转基因品系。对水稻反义抑制虹五i^植株进行生物学功能测定。二化螟幼虫分别取食反义抑制iL五尸7转基因水稻和正常非转基因水稻，结果表明，二化螟初孵幼虫取食1周后，饲养于反义抑制转基因品系上的SSB幼虫比在正常水稻上取食的要重。反义抑制i^五户7转基因水稻对二化螟抗性明显降低，反义抑制虹五户7转基因水稻接入3龄二化螟幼虫3天后严重失水，整株苗出现枯萎，还是保持绿色(图7)。以反义抑制M^P7转基因水稻为食稻纵巻叶螟明显比以正常非转基因水稻为食的稻纵巻叶螟幼虫取食量要大，生长要快，对水稻叶片损坏程度明显要重(图8)。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。实施例1:全编码cDNA的获得1)水稻茎杆RNA的提取、质量检测及总cDNA第一链合成；2)从总cDNA第一连中以聚合酶链式反应(PCR)获得iL五户/基因上游引物5'-ATAATACCCATACCATGTTG-3'下游弓I物5'-ATAAAGATTTGGGAGTGACA-3'PCR扩增条件95。CX3min—(94°CX40sec—58°CXlmin—72°CX3min)X35循环一72°CX10min(PCR扩增所用Buffer为TAKARAGCbuffer11)，得到特异PCR扩增产物见附图1。3)/JL五P基因序列碱基解析由2)经PCR扩增获得的产物经琼脂糖电泳分析,割胶回收并纯化后在DNA末端转移酶的催化下在两端添加一个A碱基，并通过T-A克隆法连接入pMD-19-T载体。克隆经IPTG和X-GAL的LB培养平板蓝白斑筛选，以及PCR鉴定后，送上海生物工程有限公司测序。用软件Chromas和Contig对测序进行拼接获得序列表中的序列SEQIDNo.l。将此cDNA的基因命名为M五户7。实施例2:iL五i^基因表达谱分析-Northem杂交将各种材料的总RNA荧光法定量后，取lOjag各个样品在1.0%的琼脂糖凝胶上75V电压电泳60min，在GENE凝胶成像仪成像后，浸泡于0.05M的NaOH中25min，用DEPC处理的ddH20淋洗3-4次，放入10倍体积的20xSSC中，温和摇动45min。用向上毛细管转移法，使RNA吸附在带正电的尼龙膜上，经UV交联仪交联后，80。C烘烤120min固定。探针标记按Prime-a-GeneLabelingSyntem(Promega)试齐U盒说明书进行。因DNA模板25ng，经95。C水浴变性5min，立即放冰上冷却，按表1要求加入相应的试剂，加入同位素的操作需在有机屏挡板后进行。25'C反应60min后，95。C变性5min，冰上放置5min，备用。表1探针标记反应《係<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>预杂交和杂交杂交膜在0.25M磷酸缓冲液(pH7.2)缓冲液中润湿，放入杂交管，加入10ml的预杂交液(0.5MpH7.2磷酸缓冲液；0.5MpH8.0EDTA;20%SDS;0.1gBSA)，在杂交炉中62-65。C预杂交1-4小时。加入iP/^同位素探针，65'C杂交12-18小时。倒去杂交液，杂交膜在WashsolutionI(lxSSPE，0.5%SDS(W/V))室温洗脱2次，每次5min;在WashsolutionII(0.2xSSPE，0.1%SDS(W/V))65"C洗2次，每次15min。杂交膜用吸水纸吸干后，用保鲜膜包裹，平整放入磷屏。压屏2小时后在台风扫描仪成像。图3的结果表明，二化螟取食诱导Ji^/V基因的表达，从分子生物学的角度证明该基因在抗螟虫防御中起正调控作用，虹fiP/基因参与水稻对螟虫的防御抗性。实施例3:利用基因沉默技术研究处五i^基因生物学功能1)iI五尸7基因反义抑制植物表达载体pl301-AniLEP/构建W五i^基因3'端的一段760bp左右DNA片段用于构建反义抑制表达载体。含5"附HI酶切位点正向引物aniL五尸7-F和含酶切位点的反向引物ani^五PJ-R用来从iJLE尸7质粒模板中扩增760bp片段。anJL五i^-F:5'-ggatccCATCTGGGACGCCATCAAG-3'aniL五i^-R:5'-gtcgacATAAAGATTTGGGAGTGACATA-3'扩增760bpDNA片段和pCAMBIA1301载体分别都用SamHI和Sa/I双酶切后，1%琼脂糖凝胶分离并割胶回。在T4DNALigase催化下，按目的片段和载体3:1比例于4"C连接24h，转化感受态TG1细胞。重组克隆经PCR和酶切方法鉴定(图2)，并送上海生物工程技术有限公司以肌化￡尸/{引物测序确定序列是否正确。此反义表达载体命名为pl301-An虹五尸7。图2中Line1是以aniLE尸7-F和an虹五/V-R为引物PCR扩增的产物；Line2是pCAMBI1301空质粒万amHI和&/I酶切；Line3是pl301-AnRLEPl经Bamffl和Sail酶切。2)将pl301-AniJI五户7反义抑制表达载体，以电击法转入农杆菌EHA105，获得农杆菌工程细胞系。以农杆菌浸染法侵染水稻愈伤组织，在含AS的共培养基上22。C暗培养3天;水稻愈伤转入含有潮霉素的NBDS筛选培养基上培养，第1次筛选20天。当新的抗性愈伤长出后，将抗性愈伤从母体上剥离，转入新的筛选培养基NBDS2，一个抗性愈伤即为一个株系。抗性愈伤经继代扩繁后，在预分化培养基MS-PG上，26-28。C避光培养7-10天；然后，转入分化培养基MS-RG，16h光照、26-28'C培养2-3周，愈伤先转绿后分化出r。代植株。3)K代转基因植株获得的r;代种子，经含潮霉素的培养基筛选，去除未含^"反义ii五P7片段的植株，并单株种植。收获7^代种子，对每个单株的种子进行鉴定。获得反义抑制虹五户7转基因基因的纯合品系，用于后面的生物学功能分析。4)转基因品系和非转基因水稻都进行害虫为害试验，比较害虫的生长情况和植株的生存情况，分析iL五Pi的生物学功能。序列表<110>浙江大学〈120>水稻源抗螟虫和纵巻叶螟基因RLEP1及其编码产物与应用<歸2<170〉Patentlnversion3.1〈210>1<211>2873〈212>腿<213〉水稻〈400>1ataatacccataccatgttgcgtcctcagctc犯tcceitctagccaceicgacgacgacga60gcagcagcagcagcacgcagctgttcgcatcctcgtcgtgcatcgctagccttcgccggc120cgtcgtcgtcgtcgtcgtcggtggtcgccgccgcacgccggacgcgggggcaaggtagca180gtcgggttgttgttgtgtgcgcgtcgtcgtcggcgacggcg柳鄉ggagatagttctt240cggacatggcggcggcggcggcggtgcgggtga郷cggtggcgacgatcaaggtcaccg300tcggcgeigttgatcaacaggtcgatcgacatcagggatctcatcggcaggtcgctctccc360tcgagctcgtcagctccgagcttgacgcga卿ccgggaaggagaaagcaactgtgcgga420gctacgcgcacaMgtggacgaCgaCg3tCatagcgtcgtcacctacgaggccgacttcg480acgtgccgagtggattcggccccatcggcgccatcatcgtceiccaacg犯ctccggcagg540agatgttcctcgaggacatcaacctcaccgccagcgatggcgccggcaactccactgtcc600tccccatccgctgcaactcctgggtccaacccaagtccgtcggcgatgagggcacgccta660gcaaacgcatcttcttcgccaacaagacttacttgccggg已cagacgccggcggggctcc720ggagctaccggaagaatgacctccagcaga已gcgcggtgacggcactggcg卿ggg3gg780ccgacgaccgtgtctacgactacgacgtttacaacgaxxtcggtaacccggacsgcaacg840gcgatctcgcccgccccgtccttggcggcacccctaccctcgccgctgcc900gcaccggccgccccccctccctaagtcggagacgagg卿ggc獄gtgt960acgtgccgagggacg鄉agttctcaccggctacttcctccgcaagacgg1020tggggtcggtgctccaggccgccgtgccggcggcgcagtcgctgctcctcgacaagctgei1080aatggaaccttccgttcccgtccttcttcgtcatcgacaagctgttcgaggacggcgtcg1140agcttcccggcgtcgacaagctcaacttcctcgagagcgtcgtgccccgcctgctcgaac1200acctccgcgacacccccgccgagaagatcctccgcttcgaaactccggccs<acatccstaa1260aggacaagttcgcatggctcag卿cgaggagttcgcgagggaaacgctcgctggcatca1320acccgtacgccatcgagctcgtc鄉gaMttccgctgaagagcaagctcgacccggcgg1380<image>imageseeoriginaldocumentpage12</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>PheProTyr290AspProLys305GluGluPheSerProArgArgCys295GlySerAspLysVal355PheSerGluThr310ProGluLysGluAsp325GinAlaAlaValArgThrGlyArgProProSerLysLysLysGlyAsnPro300TyrValProVal315PheLeuArgLysLeu340LysTrpAsnLeuGluAspGlyTyr330AlaAlaGinSerLysLeu370PheLeuGluSerValVal385390ProAlaGluLyslieLeuPro345ProPheProSerPhe360GluLeuProGlyArgAsp320ThrVal335L6UL6ULeu350VallieAspVal375ProArgLeuLeuAspLysAlaGlylie405TrpLeuArgAspArgPheGluArgVal380GluHisLeuArg395ProAlaAsnliePhe365AspLysLeuAsnPheAla420lieAsnProTyrAlalie435440LysLeuAspProAlaValThr410GluPheAlaArgGlu425GluLeuValArgAspThr400GinLys415GluThrLeu430PheProLeuLysSer450ThrAlaAspLeuLeu465GluAlalieSerGin485ValPheLeuProTyr500ArgThrValPheAla455GluGinMetArgLeuPheLysTyrGlyProGlu470LysHisLyslieGlyArgGlu445GluSerAlalieTyrGlySer515AlalieGluLeuArg505LeuMet490SerArg475LeuAla460ValMetThrAspAspThrAspAspLeuAspHisValGlu480PheHisAspLeu495ThrMetThr535ProPhe520ArgProAlaSerThr510ThrLeuGinLeuLeu530TrpArgGinValPheThrProSerThrAspAlaThrMetSerTrpLeuPro540ThrGly525SerGinProGin14545TrpArgMetAlaLys565GluLeulieThrHis580Ala550AlaHisValArgAsnArgGinlielieAla595ArgProHisPheTrpLeuArgArg555AlaHisAspAla570HisCysAlaValThr585SerGluMetHis560GlyHisHis575ProTyrLeuLeu610ArgSerAlaLeulie625ProGinLysTyrLeuSerGluMetHisPro600605TyrThrMetArglieAsnArg615AlaGlyGlylieSer630MetGluLeuSerlie620GluGlu590lieAlaSerSer645ThrGluAlaLeuTrpArgPheAsp660GluAspProThrMetAlaGlu675TyrProPheMaPro665GluSer650AlalieGluArg635ValAlaTyrAspHisGlyLeuGluAsp690LysThrTrpValGin705SerValAlaGlyAla680AspGlyLeuLeuAspLeuValGlyTyrGinArgAlaPheSer640LysLeu655ArgGlyAsn695TyrValAlaArgAla710GluGluLeuGinThrLysAspSerGlyAsp725GlyAspLysLysHis740GluSerLeuAlaAla730AlaPhe715Phe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