专利名称：一种检测高原红细胞过度增多易感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医用检测试剂盒，具体涉及一种基于线粒体DNA T10609C单核苷酸多态性检测高原红细胞过度增多易感性的试剂盒。
背景技术：
高原红细胞增多症(high altitude polycythemia, HAPC)是由高原低氧引起的以红细胞过度代偿性增生为主要特征的临床综合症Velarde FL, Consensus statement on chronic and subacute high altitude diseases,《High Alt Med Biol》，2005,6 : 147-157。由于红细胞异常增多，血液粘滞度显著增高，微循环障碍，引起全身各脏器、组织广泛损害，严重者可因血管栓塞而猝死。文献报道，在海拔3000米 4700米高原地区，HAPC 的发病率为2. 43% 37. 5%，是高原居民中发病率最高、危害最大的的慢性高原病。HAPC 的发病具有明显的种族差异和个体易感倾向，提示HAPC与遗传因素有密切关系，Heights and haematology: the story of haemoglobin at altitude, ((Postgrad Med J)), 2007, 83 :148-151。高原环境影响机体的主要因素是缺氧，机体对高原低氧环境的习服也是围绕着氧的摄取一运输一利用这条轴线来进行的。线粒体是机体能量代谢的中心，是组织、细胞氧利用的关键场所，机体耗能的90%以上来自于线粒体的氧化磷酸化作用。线粒体作为细胞的‘动力工厂’，在低氧引起细胞损伤和组织、细胞对低氧环境的习服过程中的作用都是至关重要的高文祥，低氧大鼠脑线粒体体外转录活性的研究，《中国应用生理学杂志》，2001 ； 17: 323- 326。因此，线粒体在HAPC的发生中起着重要的作用。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是一种新型的分子遗传标记,广泛用于复杂疾病的易感性予页测Kato, Mitochondrial DNA polymorphisms in bipolar disorder,《J Affect Disord)),2001,62: 151-164。高分辨率溶解曲线分析(high resolution melting analysis, HRM)是基于核酸的物理性质，通过高分辨率的实时监测升温过程中双链DNA荧光染料(LCGreen、SYTO 9和 Evagreen)与PCR扩增产物的结合情况来实现的。不同SNP位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的形状。因此，根据熔解曲线的形状，HRM分析就能够有效区分DNA的碱基变化，进行基因分型。分型原理如下
(1)本技术方案在具有高分辨率的Rotor-gene6000 PCR-HRM仪上完成。软件设置的程序包括两个连续的部分，先通过PCR (聚合酶链反应)获得含有待检测突变位点DNA片段， 然后立即进行HRM基因分型，经仪器自带软件分析得出分型结果；
(2)检测结果表明，熔解曲线形状与危险型对照DNA—致的待测样本，其线粒体DNA 10609位点碱基为T ;熔解曲线形状与保护型对照DNA —致的待测样本，其线粒体DNA 10609位点碱基为C (见图I)。HRM技术与传统的基因分型手段相比有多项优势
(I)操作简单和目前的PCR技术基本一致，无需序列特异性探针，不受碱基位点局限，真正实现了闭管操作，避免了交叉污染的可能性，对技术人员没有特殊的专业要求。(2)高效灵敏度和特异性都非常高，达到近100%。(3)通量大而快依据仪器的情况,最多一次可以同时上样384个样本,并在60-90 分钟内完成检测。(4)廉价试剂与普通荧光定量PCR基本一致，并且HRM与PCR同时进行，无需额外的试剂和仪器。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于线粒体DNA T10609C单核苷酸多态性检测高原红细胞过度增多易感性的试剂盒，能用于高原红细胞过度增多易感者的筛选，指导高原红细胞过度增多的预防。通过对318例汉族高原红细胞过度增多患者和253例移居高原汉族健康対照的线粒体DNA的第10609位点基因分型，结合外界环境因素进行Logistic回归分析，研究线粒体DNA多态性与高原红细胞过度增多的相关性，寻找出敏感可信的高原红细胞过度增多易感生物遗传标记。步骤是先通过对50例高原红细胞过度增多患者和50例移居高原汉族健康的线粒体DNA的全长扩增、测序，初歩提示线粒体DNA的10609位点可能与移居高原汉族的血红蛋白浓度相关。然后放大样本量，采用PCR-HRM技术对上述线粒体DNA位点进行基因分型，同时收集受试者的基本的生理指标和生活习惯(年龄、体重指数、吸烟饮酒习惯、 移居高原的海抜高度和高原暴露时间等)，最后结合外界因素，采用Logistic回归分析线粒体DNA 10609位点多态性与高原红细胞过度增多的相关性。结果表明，在排除外界因素的影响后，线粒体DNA 10609C是移居高原汉族高原红细胞过度增多的保护因素(P < 0.01， OR=O. 391，95%CI 0. 191-0. 800)。结论:线粒体DNA 10609C是高原红细胞过度增多的保护因素，线粒体DNA 10609T是高原红细胞过度增多的危险因素，线粒体DNA 10609位点多态性可以作为高原红细胞过度增多的遗传易感标志。因此，基于该多态性位点，可以设计适当引物，采用PCR-HRM技术检测高原红细胞过度增多的易感性。本发明所述的ー种检测高原红细胞过度增多易感性的试剂盒，其特征是该试剂盒包括以下分离包装的试剂
试剂一，引物混合液IOOiil ;上游引物和下游引物各50 混合，终浓度均为IOpmol/
上游引物 F :5’ -CTAGTATATCGCTCACACCTCA-3’，
下游引物 R:5’ -GGCGGCAAAGACTAGTATGG-3’ ；
试剂ニ，PCR 反应混合液 IOOOii I ;成分有 IXPCR buffer, 2. 0 mM MgC12, 200 mM dNTPs, Hotstar Taq酶，Evagreen染料，余量为蒸懼水。所述的ー种检测高原红细胞过度增多易感性的试剂盒，还包括
试剂三，线粒体DNA 10609位点单核苷酸多态性为T的对照基因组DNA 50 U 1，浓度为 20 ng/uI ；
试剂四，线粒体DNA 10609位点单核苷酸多态性为C的对照基因组DNA 50iU，浓度为 20 ng/uI。本发明能用于平原汉族人进入高原前对高原红细胞过度增多易感者的筛选，指导高原红细胞过度增多的预防和治疗，减轻慢性高原病的威胁，有利于进入高原人群的健康; 该试剂盒使用简单，操作方便，检测快速。
图I是HRM分型原理图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进ー步的说明。所述的基于线粒体DNA T10609C单核苷酸多态性检测高原红细胞过度增多易感性的试剂盒，包括以下分离包装的试剂
试剂一，引物混合液IOOiil ;上游引物和下游引物各50 混合，终浓度均为IOpmol/ u I ;序列如下
上游引物 F :5’ -CTAGTATATCGCTCACACCTCA-3’，
下游引物 R:5’ -GGCGGCAAAGACTAGTATGG-3’ ；
试剂ニ，PCR 反应混合液 IOOOii I ;成分有 IXPCR buffer, 2. 0 mM MgC12, 200 mM dNTPs, Hotstar Taq酶，Evagreen染料，余量为蒸懼水；
试剂三，线粒体DNA 10609位点单核苷酸多态性为T的对照基因组DNA(危险型)50 U 1， 浓度为20 ng/ ill ;
试剂四，线粒体DNA 10609位点单核苷酸多态性为C的对照基因组DNA(保护型)50 U 1， 浓度为20 ng/ u I o试剂盒内的PCR反应相关试剂和Evagreen染料能在宝生物工程(大连)有限公司和Biotium公司购买到，引物由深圳华大基因公司合成。线粒体DNA 10609位点多态性为T 或C的对照DNA来自于人体血液白细胞的基因组DNA (来自高原血库)，并经测序验证了其线粒体DNA 10609位点单核苷酸多态性为T或C。试剂盒的使用说明
第一歩，采用OMEGA公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒(货号D3392-02)提取待测个体静脉血白细胞基因组总DNA，然后用紫外分光光度计对DNA进行定量；
第二歩，PCR反应体系配制，共配制三管
第一个PCR管为待测样本，去待测个体的DNA 1111，试剂ー1111，试剂ニ 23 iil，混匀。第二个PCR管为危险型对照DNA，取试试剂一 I iil，试剂ニ 23 iil，剂三I iil，混匀。第三个PCR管为保护型对照DNA，取试试剂一 I ，试剂ニ 23 ，剂四I ，混匀。第三步，将第二步的已经混匀的三个PCR分别放入Rotor-gene 6000 PCR-HRM仪中，均按以下条件进行PCR反应95°C变性2分钟一(95°C变性15秒一58°C退火15秒 —72°C延伸15秒，荧光读板)X重复40次一70°C至95 °C的HRM (升温方式每0. 1°C维持2秒)
第四步，应用Rotor-gene 6000 PCR-HRM仪自带的软件进行数据分析，依据待测样本的 HRM形状与对照DNA的HRM的相似性，由软件自动分析出待测样本线粒体DNA 10609位点的
5基因型。当HRM形状与试剂三相似时线粒体DNA 10609位点为T，为高原红细胞过度增多易感个体；当HRM形状与试剂四相似时线粒体DNA 10609位点为C，见图I。
权利要求
1.一种检测高原红细胞过度增多易感性的试剂盒，其特征是该试剂盒包括以下分离包装的试剂试剂一，引物混合液IOOiil ;上游引物和下游引物各50 混合，终浓度均为IOpmol/上游引物 F :5’ -CTAGTATATCGCTCACACCTCA-3’，下游引物 R :5’ -GGCGGCAAAGACTAGTATGG-3’ ；试剂ニ，PCR 反应混合液 IOOOii I ;成分有 IXPCR buffer, 2. 0 mM MgCl2, 200 mM dNTPs, Hotstart Taq 酶，Evagreen 染料，余量为蒸懼水。
2.根据权利要求I所述的ー种检测高原红细胞过度增多易感性的试剂盒，还包括 试剂三，线粒体DNA 10609位点单核苷酸多态性为T的对照基因组DNA50 U 1，浓度为 20 ng/uI ；试剂四，线粒体DNA 10609位点单核苷酸多态性为C的对照基因组DNA 50 U 1，浓度为 20 ng/uI。
全文摘要
本发明公开一种检测高原红细胞过度增多易感性的试剂盒，其特征是该试剂盒包括以下分离包装的试剂试剂一，引物混合液100μl；上游引物和下游引物各50μl混合，终浓度均为10pmol/μl；试剂二，PCR反应混合液1000μl；成分有1×PCRbuffer，2.0mMMgCl2,200mMdNTPs，HotstartTaq酶，Evagreen染料，余量为蒸馏水。还包括试剂三，线粒体DNA10609位点单核苷酸多态性为T的对照基因组DNA50μl，浓度为20ng/μl；试剂四，线粒体DNA10609位点单核苷酸多态性为C的对照基因组DNA50μl，浓度为20ng/μl。本发明能用于平原汉族人进入高原前对高原红细胞过度增多易感者的筛选，指导高原红细胞过度增多的预防和治疗，减轻慢性高原病的威胁，有利于进入高原人群的健康；该试剂盒使用简单，操作方便，检测快速。
文档编号C12Q1/68GK102605089SQ20121009480
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者刘福玉, 蒋春华, 高钰琪 申请人:中国人民解放军第三军医大学