专利名称：一种鸡矮脚相关的分子检测方法
技术领域：
本发明涉及动物遗传育种分子标记辅助选择技术领域，具体提供导致鸡性连锁矮小的突变的检测方法。
背景技术：
性连锁矮小鸡(Sex-linked Dwarf Chicken, SLD)具有基础代谢低，耗料少，饲养密度大，成本低等优点，因而在肉蛋鸡育种中有很高的经济价值。目前已知能导致鸡矮小表型的基因有8种，它们有的是隐性致死，有的作用方式不详，有的表现为常染色体遗传，有的表现为性染色体遗传，其中引起人们广泛注意并应用于实际。它被认为是唯一对鸡本身健康无害而对人有益的突变基因。在dw基因的存在下可导致鸡生长速度的下降，使鸡的体形变小。因而它在肉鸡与蛋鸡育种中具有很高的经济价值。性连锁矮小是由于GHR基因突变造成的。鸡GHR基因定位在Z染色体短臂上，共编码608个氨基酸(包括16个氨基酸的信号肽)。其中外显子I长度不一，调控转录的起始；翻译起始位点位于外显子2上，该外显子编码前体蛋白的信号肽；cGHR基因缺少外显子
3(和人的GHR基因比较);外显子4 7编码GHR蛋白的细胞外结构域；外显子8编码蛋白的跨膜结构域；外显子9 10编码蛋白的细胞内结构域。1991年Burnside等克隆了鸡的GHR基因，并对SLD鸡产生的分子基础进行了研究，发现鸡GHR在功能上的缺陷可能是导致性连锁矮小鸡的遗传基础。而最直接的证据来自鸡肝细胞培养实验对性连锁矮小鸡肝细胞转染介导重组正常的生长激素受体基因后， 肝细胞能够正常地响应生长激素的生物功能，类胰岛素生长因子I(IGF-I)的产量显著地增加，这充分地表明肝细胞恢复了对生长激素的结合活性。因此，通常人们认为由dw基因控制的鸡性连锁矮小表型，是由性染色体上的GHR基因的变异引起。GHR处于GH-GHR-IGF 轴上，通过介导生长激素(Growth Hormone, GH)来调控IGF-I的表达,从而在体内起着重要的调节生长发育的作用。鸡的生长激素受体(Chicken Growth Hormone Gene, cGHR)基因在各种组织中都有表达，但在肝脏、肌肉、脂肪等组织中的表达量较高。对成年鸡鸡肝的GHR 的RNA进行Northern杂交发现三种转录子，这些不同长度的转录子在不同组织中都有表达。研究认为，表达不同长度的转录子与选择性剪切cGHR基因中3个终止转录的poly(A) 信号有关。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡矮脚相关的分子检测方法，根据GHR基因突变的特点，通过设计三条引物，对待检个体的目的基因进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳的方法对待检个体进行基因分型。本发明的目的是通过以下技术方案来实现
一种鸡矮脚相关的分子检测方法，包括以下步骤从被检个体的血样中提取DNA ；
(2)根据基因序列突变特征设计适当引物，扩增目的基因；
(3)琼脂糖凝胶电泳，进行分型；以及
(4)根据分型结果，判断待检个体是否为有利于育种实践的性连锁矮小个体，其中，性连锁矮小个体扩增产物序列
Ggtatcaatcttggagcttcaatggcagaaaccccaagtatggaaatgcctgtcccagactacacttctatt catattgttcactctccacaaggccttgtgctcaatgcaaactcagaatgtcattttggtactttactggtcacaca agccattattcgccggtcagaagatgtgtctttcagtttctatttaactttccttatgtcagtgttttgtttgtttt cctcgaagtttaataaatgt。本发明的有益效果为通过设计三条引物，对待检个体的目的基因进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳的方法对待检个体进行基因分型。
图I是本发明所述一种鸡矮脚相关的分子检测方法的流程图2是对不同个体进行基因分型的琼脂糖凝胶电泳图，其中1-5为非DW突变个体纯合子；5-10为DW突变纯合子，表型矮脚；11_15为DW突变杂合子。。
具体实施方式
实施例I.抽取待检个体血样
样品分别来源于华农畜牧场、湛江遂深家禽有限公司。翅下静脉抽取约0. 3ml血液，置于装有70微升抗凝剂的0. 5ml的离心管中。2. DNA 的抽提
采用苯酚-氯仿抽提法(奥斯泊等，1998)提取鸡基因组DNA。取30 y L抗凝全血于
I.5 mL 离心管中，分别加入 470 uL I X SET 缓冲液、12. 5 u L 20% SDS 和 5 u LlO mg/ mL蛋白酶K，混合均匀后置于55°C水浴过夜；然后用Tris饱和酚抽提2_3次，氯仿-异戊醇(23 :1)抽提I次，无水乙醇(_20°C )沉淀，75%乙醇洗涤并烘干，最后加入300 y L灭菌后的I X TE溶液，放于55°C水浴溶解过夜。DNA溶液于-20°C或_70°C长期保存，使用前取出按一定比例稀释成PCR模板。3.目的片段扩增
PCR 程序95°C3'，30 循环(95°C 30" ,55°C 30/7 ,72°C 30/7 )，72°C5'，16°C保存。引物序列表
权利要求
1.一种鸡矮脚相关的分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤 从被检个体的血样中提取DNA ；根据基因序列突变特征设计适当引物，扩增目的基因，所述引物包括三条，分别为1)引物名称为GHRF,引物序列为ggtatcaatcttggagcttcaat ；2)引物名称为 GHRFl,引物序列为tgacgtgaacagaagtgcatgac ;以及3)引物名称为GHRR,引物序列为 cctcgaagtttaataaatgt ；琼脂糖凝胶电泳，进行分型；以及根据分型结果，判断待检个体是否为性连锁矮个体。
2.根据权利要求I所述的一种鸡矮脚相关的分子检测方法，其特征在于性连锁矮小个体扩增产物序列Ggtatcaatcttggagcttcaatggcagaaaccccaagtatggaaatgcctgtcccagactacacttctatt catattgttcactctccacaaggccttgtgctcaatgcaaactcagaatgtcattttggtactttactggtcacaca agccattattcgccggtcagaagatgtgtctttcagtttctatttaactttccttatgtcagtgttttgtttgtttt cctcgaagtttaataaatgt。
全文摘要
本发明涉及一种鸡矮脚相关的分子检测方法，包括以下步骤从被检个体的血样中提取DNA；根据基因序列突变特征设计适当引物，扩增目的基因；琼脂糖凝胶电泳，进行分型；以及根据分型结果，判断待检个体是否有利于育种实践。本发明的有益效果为通过设计三条引物，对待检个体的目的基因进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳的方法对待检个体进行基因分型。
文档编号C12Q1/68GK102618649SQ201210098418
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者曾华, 詹惠娜, 许夏宇, 许继国 申请人:广州市权诚生物科技有限公司