专利名称：肾上腺素alpha1受体亚型的荧光探针组合及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于核酸检测技术领域，涉及一种核酸探针组合及其应用。
背景技术：
神经胶质细胞约占中枢神经系统细胞总数的90%，其在神经系统中的重要性日益受到重视，逐渐成为神经科学研究的热点之一。早先有神经生物学研究者在中枢神经系统中发现了一种具有典型双极突起、胞体小而不规则的细胞，其形态很难归入已知的神经胶质细胞范畴，而类似不成熟的胶质细胞。根据其能够增殖并可分化为少突胶质细胞的特性，研究者将这种细胞命名为少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cell,0PC)。硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)是OPC的特异性免疫标记物和鉴定标准。早先的研究认为OPC是哺乳动物胚胎发育早期的少突胶质前体细胞，其在出生后分化成熟，成为成髓鞘的少突胶质细胞。但最近研究显示，成熟的脑内也表达大量的NG2免疫阳性反应细胞,这些细胞在形态上与星状胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞等均有所区别，胞体稍大，突起短而且丰富，有较多分枝，从形态学特征来看倾向认为是脑内一类成熟的胶质细胞，而这些细胞在灰质、白质及海马区域的广泛分布也预示其可能不严格属于少突胶质细胞系的前体细胞，而是在中枢神经系统中与少突胶质细胞、星状胶质细胞不同的一种新的胶质细胞类型。由于近年研究显示OPC与神经退行性疾病、毒性物质作用、营养代谢障碍和缺氧缺血所致的白质损害等均密切相关，从而成为新近神经科学研究的热点。哺乳动物脑内白质与灰质OPC形态有不同。OPC是否与星状胶质细胞类似，在不同脑区也具有异质性，对于阐明其在体功能具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对OPC的异质性研究，设计和构建一种荧光探针。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案
I、肾上腺素alphal受体(alphal_AR)亚型的突光探针组合，由肾上腺素alphalA受 体(alphalA-AR)荧光探针和肾上腺素alphalB受体(alphalB_AR)荧光探针组成，所述alphalA-AR荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，alphalB_AR荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述alphalA-AR荧光探针和alphalB_AR荧光探针分别用荧光光谱互不重叠的荧光分子进行标记。优选的，所述alphalA-AR荧光探针和alphalB_AR荧光探针中的任意一种用荧光分子Cy5进行标记,另一种用突光分子Alexa Fluor488进行标记。2、alphal-AR亚型的荧光探针组合作为区分不同脑区OPC的试剂的应用。本发明的有益效果在于本发明设计并构建了一种alphal-AR亚型的荧光探针组合，包括alphalA-AR荧光探针和alphalB-AR荧光探针，应用该荧光探针组合和荧光原位杂交技术，在荧光标记OPC转基因小鼠脑内，发现不同脑区OPC表达alphal-AR类型不一致，alphalA-AR和alphalB-AR可以作为区分不同脑区OPC的标志物，该荧光探针组合可以作为区分不同脑区OPC的试剂，用于OPC的异质性研究。由于现有技术中针对alphalA-AR和alphalB-AR的抗体尚不具有特异性区分alphalA-AR和alphalB-AR的能力，而荧光标记技术具有检测简单、灵敏度高(相对于常规标记技术)、特异性强(相对于受体检测技术)等优点，本发明的荧光探针组合具有良好的应用前景。
图I显示了 AlphalAAR-I寡核苷酸的质谱检测结果，单吸收峰在16382Da。图2显示了 AlphalBAR-I寡核苷酸的质谱检测结果，单吸收峰在14491Da。图3显示了海马CAl区OPC表达alphalA-AR (箭头所示)但不表达alphalB-AR。图4显示了海马CA2区OPC表达alphalA-AR (箭头所示)但不表达alphalB-AR。
图5显示了大脑皮层灰质OPC既不表达alphalA-AR也不表达alphalB-AR。图6显示了大脑皮层白质OPC既表达alphalA-AR(箭头所示)也表达alphalB-AR。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、alphalA-AR荧光探针和alphalB-AR荧光探针的制备
根据GenBank中登录的alphalA-AR的mRNA全长序列(登录号NM_013461. 3)和alphaIB-AR的mRNA全长序列(登录号NM_007416. 3)设计alphalA-AR和alphalB-AR的特异性寡核苷酸探针序列如下
alphalA-AR 的寡核昔酸探针 AlphalAAR-I :5’-gcatcacgaggaagaacggcagccagcagaggaeg- aagcatcccaccacaa-3’ (SEQ ID No. I)；
alphalB-AR 的寡核昔酸探针 AlphalBAR-I :5，-aaggcgcacagctccacgggtggctgcgttccacga- cccaggtat-3’ (SEQ ID No. 2)。AlphalAAR-I探针序列与alphalA-AR mRNA全长序列的BLAST比对结果见表I。AlphalBAR-I探针序列与alpha IB-AR mRNA全长序列的BLAST比对结果见表2。表I AlphalAAR-I 与 alphalA-AR mRNA 全长序列的 BLAST 结果—....IH— 願 SI FelwlrTliwin序遲屢
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表 2 AlphalBAR-I 与 alphalB-AR mRNA 全长序列的 BLAST 结果
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探针的荧光标记釆用末端标记法，在每条寡核苷酸探针的5’端和3’端都标记上同一种焚光分子。本实施例中用Cy5标记AlphalAAR-I探针，用Alexa Fluor488标记AlphalBAR-I探针。Cy5的激发波长为649nm，发射波长为670nm ；Alexa Fluor488的激发波长为490nm，发射波长为520nm ;二者荧光光谱互不重叠，从而避免了后续荧光检测中的互相干扰。当然，本发明也可以用Alexa Fluor488标记AlphalAAR-I探针，用Cy5标记AlphalBAR-I探针；也可以采用荧光光谱互不重叠的其它荧光分子分别标记AlphalAAR-I探针和AlphalBAR-I探针。AlphalAAR-I探针的合成序列经DNA质谱分析(图I )，单吸收峰出现在16382Da，与预测分子量16382Da —致。AlphalBAR-I探针 的合成序列经DNA质谱分析(图2)，单吸收峰出现在14491Da，与预测分子量14491Da —致。二、荧光转基因小鼠脑组织切片的制备
以红色荧光DsRed标记OPC转基因小鼠(购自美国Jaxson实验室，品种名称为STOCKTg(Cspg4-DsRed. Tl) lAkik/J，编号为008241)为实验小鼠，该小鼠在硫酸软骨素蛋白聚糖
4(Cspg4)启动子调控下启动DsRed. Tl基因的表达，Cspg4翻译后特异性表达NG2，从而使所有OPC细胞表达红色荧光蛋白DsRed. Tl，DsRed. Tl的激发波长为554nm，发射波长为586nm,与Cy5和Alexa Fluor488的荧光光谱互不重叠。将小鼠自左心室主动脉沿体循环灌注，先用20mL无菌生理盐水，再用20-30mL 4%多聚甲醛溶液；然后剥离全脑，置4%多聚甲醛溶液中固定24小时，用30%无菌蔗糖溶液脱水至完全沉底，冰冻切片(40 μ m)，漂于无RNA 水解酶的 O. OlM PBS (ρΗ7· 4)中。三、原位杂交实验研究OPC的异质性
将Cy5标记的AlphalAAR-I探针、Alexa Fluor488标记的AlphalBAR-I探针与红色荧光DsRed标记OPC转基因小鼠脑组织切片中的核酸进行杂交，原位检测脑组织切片中alphalA-AR和alphalB-AR的mRNA。由于本发明构建的荧光探针为荧光速标记，故采用直接法原位杂交，探针与组织细胞内靶核酸所形成的杂交体不经免疫组织化学实验，直接用荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜观察。具体实验方法为脑组织切片先用O. OlM PBS(ρΗ7· 4)洗3次，每次5分钟，再用O. 3% Triton X-100于37°C浸泡4小时，再用2 X SSC洗10分钟，加入浓度为Sng/yL的探针工作液，42°C杂交16小时，再依次应用2XSSC、1XSSC、O. 5XSSC、0. 2 X SSC各洗3次，每次10分钟，最后置O. OlM PBS (ρΗ7· 4)中漂洗并贴片，用I μ g/mL DAPI溶液复染细胞核，甘油封片观察，以未杂交的脑组织切片(CSpg4(NG2)DSRed)为对照。结果如图3飞所示，可见小鼠不同脑区OPC表达alphal-AR的类型不一致，海马区域的OPC仅仅表达alphalA-AR而不表达alphalB-AR，大脑皮层灰质区域OPC既不表达alphalA-AR也不表达alphalB-AR,而大脑皮层白质区域OPC既表达alphalA-AR也表达alphalB-AR，说明alphalA-AR和alphalB-AR可以作为区分不同脑区OPC的标志物，Cy5标记的AlphalAAR-I探针和Alexa Fluor488标记的AlphalBAR-I探针组合,可以作为区分不同脑区OPC的试剂，用于OPC的异质性研究。alphal-AR是一种G蛋白偶联受体，激活后通过Gq蛋白发挥生物学作用。其中，Gq蛋白的α亚单位通过水解磷脂酰肌醇，产生如三磷酸肌醇(ΙΡ3)和二酰基甘油(DAG)等第二信使，激活蛋白酶C (PKC)调控细胞功能，产生效应；Gq蛋白的β Y亚单位可以直接调控细胞膜的Kca通道，影响细胞内K+平衡，介导细胞增殖或凋亡。文献报道，表达于海马的alphalA-AR在调节新生小鼠神经干细胞的分化和调控成年小鼠胶质细胞增殖中均有重要作用，也参与了注意和记忆过程，在后脑的发育中与突触可塑性和抑郁、情绪障碍等的发生均有一定关系。此外，在围生期缺氧缺血性脑损伤(HIBD)实验模型中发现，损伤脑组织内以去甲肾上腺素为典型的儿茶酚胺神经递质释放有显著增加，从而激活突触后膜的alphal-AR。在起始期、临床症状出现之前，可能产生不可逆的损伤特征，尤其是对突触后神经胶质细胞的病理性损伤。OPC在HIBD引起的脑瘫中是最敏感的易损性细胞，是脑室周围白质软化等病理过程的关键靶细胞。这与其特异表达的alphal-AR功能可能具有一定关系。其作用可能在于HIBD病理过程早期由于应激释放的去甲肾上腺素，激活突触后OPC的alphal-AR，通过调控OPC的KCa通透性，影响细胞内K+水平，改变细胞膜电位和细胞兴奋性，从而加速了 OPC在缺氧缺血性脑损伤早期的易损性。而OPC在不同脑区所表达的alphal-AR亚型不一致，形成了 OPC在不同脑区的异质性，也给出了围生期脑瘫中以白质病 变和少突胶质细胞系损伤为主的病理依据。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.肾上腺素alphal受体亚型的荧光探针组合，其特征在于，由肾上腺素alphalA受体荧光探针和肾上腺素alphalB受体荧光探针组成,所述肾上腺素alphalA受体荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，肾上腺素alphalB受体荧光探针的核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示；所述肾上腺素alphalA受体荧光探针和肾上腺素alphalB受体荧光探针分别用荧光光谱互不重叠的荧光分子进行标记。
2.根据权利要求I所述的肾上腺素alphal受体亚型的荧光探针组合，其特征在于，所述肾上腺素alphalA受体荧光探针和肾上腺素alphalB受体荧光探针中的任意一种用荧光分子Cy5进行标记,另一种用突光分子Alexa Fluor488进行标记。
3.权利要求I所述的肾上腺素alphal受体亚型的荧光探针组合作为区分不同脑区的少突胶质前体细胞的试剂的应用。
全文摘要
本发明公开了一种肾上腺素alpha1受体亚型的荧光探针组合，由肾上腺素alpha1A受体(alpha1A-AR)荧光探针和肾上腺素alpha1B受体(alpha1B-AR)荧光探针组成，alpha1A-AR荧光探针和alpha1B-AR荧光探针的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；应用上述荧光探针组合和荧光原位杂交技术，在荧光标记少突胶质前体细胞(OPC)转基因小鼠脑内，发现不同脑区OPC表达alpha1-AR类型不一致，说明alpha1A-AR和alpha1B-AR可以作为OPC异质性的标记，本发明的荧光探针组合可以作为区分不同脑区OPC的试剂，用于OPC的异质性研究。
文档编号C12Q1/04GK102719428SQ20121009820
公开日2012年10月10日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者阮怀珍, 陈鹏慧 申请人:中国人民解放军第三军医大学