专利名称：一种韦伯灵芝漆酶及其编码基因与工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及食用真菌基因工程领域中一种漆酶蛋白的编码基因，特别涉及灵芝科灵芝属韦伯灵芝(Ganoderma weberianum)漆酶的编码基因及含该基因的工程菌。
背景技术：
漆酶(Laccase，ECl. 10. 3. 2)是一类含铜的多酚氧化酶，漆酶多为单体酶，且酶分子中含有4个铜原子，所有铜原子都参与漆酶将底物氧化并同时伴随着分子氧还原为水的催化过程，产生的副产物只有水，是“生态友善的”酶。绝大多数的真菌漆酶为分泌型糖蛋白，能促进木质素及其前体物质分子或前体物质分子类似物等许多环境污染物的降解。漆酶在很多领域，如造纸工业中纸浆漂白、印染工业中废水处理、医药领域中进行生物检测、以及食品工业、有机合成、有机农药降解等，具有重要的应用价值。要实现这些应用价值，必须有质优价廉的酶源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种质优价廉的酶源，能够产生较强酶活力的菌株，同时还提供产酶活力更高的基因工程菌株，能促进木质素及其前体物质分子或前体物质分子类似物等许多环境污染物的降解。本发明提供一种韦伯灵芝(Ganoderma weberianum TZC1)TZC1菌株，该菌株已于 2008年9月I日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为 CGMCC No 2648。本发明所提供的韦伯灵芝(Ganoderma weberianum TZC1) TZCl菌株漆酶基因，来源于韦伯灵芝TZCl (Ganoderma weberianum TZC1)菌，CGMCC Na 2648，其核苷酸序列为下列之一I)序列表中SEQ ID No. I的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No. 2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID No. I限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；序列表中序列I的DNA序列由2734个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第559 位到第2651位碱基，包含2093个碱基对。该序列中含有11个内含子，分别为5’端第110 位到第171位碱基，5’端第292位到第487位碱基，5’端第742位到第799位碱基，5’端第869位到第922位碱基，5’端第1044位到第1101位碱基，5’端第1216位到第1283位碱基，5’端第1348位到第1409位碱基，5’端第1509位到第1561位碱基，5’端第1719位到第1774位碱基，5’端第1973位到第2025位碱基，5’端第2289位到第2354位碱基。韦伯灵芝TZCl (Ganoderma weberianum TZC1)菌株漆酶基因的cDNA序列是序列表中的SEQ ID No. 3，由1949个碱基组成。韦伯灵芝TZCl (Ganoderma weberianum TZC1)菌株漆酶LACl是具有序列表中SEQID No. 2氣基酸残基序列的蛋白质。
序列表中SEQ ID No. 2由521个氨基酸残基组成，自氮端第1_21位氨基酸残基是 N-端信号肽(含有21个氨基酸残基)；成熟酶为500个氨基酸残基。含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体，如重组表达载体pPICZB/Lacl (图谱如图I所示)。 重组表达载体pPICZB/Lacl，转化巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115后得到的工程菌产漆酶巴氏毕赤酵母菌(Pichia pastoris)GS115_Lacl。本发明为了提高产酶活力，又克隆了漆酶的DNA(3005bp)和⑶S(1566bp)序列并构建了一个含有漆酶⑶S的重组质粒，转化巴氏毕赤酵母菌(Pichia past0ris)GS115得到产漆酶工程菌(Pichia pastoris)GS115_Lacl。工程菌产漆酶巴氏毕赤酵母菌(Pichia pastoris)GS115_Lacl,该菌为球形或椭球性，大小为(2. 0-4. 0) X (2. 2-5. 8) u m,为单生或对生，菌落为乳酪色有光泽。与现有技术相比，本发明具有的有益效果为I)本发明所提供的产漆酶工程菌(Pichia pastoris)GS115_Lacl,在最佳发酵条件下，酶活力可达4 5U/mL。该工程菌产酶的特征是分子量为56614，为单体酶。2)本发明的产漆酶工程菌的发酵方法简单可行，培养基便宜易得，产酶能力强，易于工业化生产，生产成本低。
图I为重组表达载体pPICZB/Lacl的物理图谱。
具体实施例方式以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但并不对本发明造成任何限制。实施例I韦伯灵芝(Ganodermaweberianum) TZCl，CGMCC No 2648 来源漆酶的 cDNA 克隆韦伯灵芝(Ganodermaweberianum) TZCl，CGMCC Na 2648 来源漆酶的 cDNA 克隆具体包括以下步骤I、采用RNeasy Plant&Fungi Mini Kit试剂盒(QIAGEN公司产品)抽提韦伯灵芝 (Ganoderma weberianum)TZCl 菌丝的总 RNA。2、按照真菌漆酶中第I和第IV个Cu2+结合域氨基酸保守序列设计简并引物，以步骤 I 中的总 RNA为模板，进行一步法RT-PCR(Prime-Script One Step RT-PCR kit, TAKARA 公司产品)克隆漆酶部分cDNA中间序列，所得RT-PCR产物在I %琼脂糖凝胶中进行电泳， 得到漆酶cDNA的中间序列，大小约为I. 2kb。所设计的简并引物序列如下Primer 1:5' -CA (CT) TGG CA (CT) GG (AGCT) TT (CT) TT (CT) CA-3’Primer IV :5' -TG (AG) AA (AG) TC (AGT) AT (AG) TG (AG) CA (AG) TG-3’3、根据步骤2中克隆得到的cDNA中间序列设计2条引物，按照SMART RACE cDNA Amplification试剂盒(Clontech公司产品)的方法,通过5' -RACE和3' -RACE的方法获取漆酶cDNA的两端序列。所设计的基因特异性引物如下
Primer 5' -R : 5' -GTGTGCCGCTCAGGACCTGGAGGAGGAC-3'Primer 3' -F :5' -CCGGTCTTCGGCGACATCGGATTCGAGG-3'4、根据步骤3中克隆得到的cDNA两端序列设计引物，以步骤I中得到的总RNA为模板，经RT-PCR方法克隆到漆酶的全长cDNA，其大小约为2. 0Kb。Primer-F 5' -CGCAGTCACCGTCCGGATACG-3'Primer-R 5' -TGCGTCTGGTCCCTGTGCGA-3'5、为构建重组表达载体，在克隆引物的5'-端引入XhoI识别位点，在3'-端引物引入XbaI识别位点；这些位点与表达载体pPICZB上的酶切位点匹配。所设计的引物为Primer-N :5' -CTCGAGATGGCTGGACTTCGATCCTTACTCTC-3'Primer-C :5' -TCTAGATGGTCGTCGGGCGAGAGCGCATC-3'PCR产物经Agarose gel DNA purification kit (TAKARA公司产品)回收纯化、与测序载体连接、转化并筛选得到重组子，送华大基因公司测序。测得的韦伯灵芝(Ganoderma weberianum)TZCl漆酶的Q)S序列如序列表中序列4,共1566bp。韦伯灵芝(Ganoderma weberianum)TZCl漆酶的氨基酸序列如序列表中序列2。该漆酶含有521个氨基酸残基， N端1-21氨基酸残基，是信号肽序列；成熟酶为500个氨基酸残基。该酶具有漆酶的所有保守特征，包括铜离子结合域(N端30-152、163-306、366-495氨基酸残基)等。利用 BLASTp搜索工具将该序列与已报道的几种漆酶氨基酸序列进行比较，其同源性与Ganderma fornicatum来源的漆酶LACl同源性为87%,与Ganderma tsugae来源的漆酶LACl同源性为84%,与Ganoderma Iucidum来源的漆酶同源性为81 与Ganoderma sp.En3来源的漆酶同源性为75%,与Flammulina velutipes来源的漆酶同源性为75%。实施例2韦伯灵芝(Ganodermaweberianum) TZCl，CGMCC No 2648 漆酶的基因克隆I、按照Xu F(1994)的方法提取韦伯灵芝(Ganoderma weberianum)TZCl的基因组DNA(Xu F,HJ Yoell,JB Anderson(1994),An efficient protocol for isolating DNA from higher fungi. Trends Genet 10 :226-227)。2、根据韦伯灵芝(Ganoderma weberianum) TZCl漆酶的cDNA两端序列设计引物， 以基因组DNA为模板,按照常规方法进行PCR扩增,得到韦伯灵芝(Ganoderma weberianum) TZCl漆酶的基因序列，PCR产物大小约为3. 0Kb。所设计的引物序列为Primer-F 5' -CGCAGTCACCGTCCGGATACG-3'Primer-R 5' -TGCGTCTGGTCCCTGTGCGA-3'PCR产物经Agarose gel DNA purification kit (TAKARA 公司产品)回收纯化，与测序载体连接、转化并筛选得到重组子，送华大基因公司测序。测得的韦伯灵芝(Ganoderma weberianum) TZCl漆酶的DNA序列如序列表中序列I ;该基因含有2734bp,与漆酶的cDNA序列比较发现该序列中含有11个内含子，分别为5’端第110位到第171位碱基，5’端第292 位到第487位碱基，5’端第742位到第799位碱基，5’端第869位到第922位碱基，5’端第 1044位到第1101位碱基，5’端第1216位到第1283位碱基，5’端第1348位到第1409位碱基，5’端第1509位到第1561位碱基，5’端第1719位到第1774位碱基，5’端第1973位到第2025位碱基，5’端第2289位到第2354位碱基。实施例3
工程菌的构建I、构建含韦伯灵芝(Ganoderma weberianum)TZCl漆酶⑶S的重组表达质粒。韦伯灵芝(Ganoderma weberianum) TZCl漆酶经XhoI和XbaI双酶切后与经相同限制性内切酶作用的PPICZB按常规方法连接。所构建的重组表达载体pPICZB/Lacl如图I所示。2、重组表达载体经Pme I线性化,按常规方法电激转化Pichia pastoris GS115, 利用Zeocin抗性筛选和PCR筛选阳性重组子。阳性重组子GS115_Lacl利用甲醇诱导发酵， 取Iml发酵液，5000rpm离心5min，上清即为粗酶液。在含有100mM、pH4. 0的醋酸盐缓冲溶液，0. 5mM ABTS和500 u L粗酶液的3ml反应体系中，25 °C水浴保温3min，测0D420，结果得到产漆酶工程菌产漆酶巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-Lacl。工程菌产漆酶巴氏毕赤酵母菌(Pichia pastoris)GS115_Lacl,该菌为球形或椭球性，大小为(2. 0-4. 0) X (2. 2-5. 8) u m,为单生或对生，菌落为乳酪色有光泽。实施例4 工程菌的酶活力实施例3所构建的产漆酶工程菌(Pichia pastoris) GSl 15-Lacl，利用BMGY (IOg/ L 酵母提取物，20g/L 蛋白胨，100ml/L 0. 2M 磷酸缓冲液 pH = 6. 0，13. 4g/L YNB，0. 00004% 生物素，10ml/L甘油，lml/L zeocin)液体培养基在29度，培养2天，收集菌体，将其转移到 BMMY (10g/L 酵母提取物，30g/L 蛋白胨，100ml/L 磷酸缓冲液 pH = 6. 0，13. 4g/L YNB, 300ul
0.IM CuS04，8g/L 丙氨酸，0.00004%生物素，0.5% 甲醇，lml/L zeocin)液体培养基在 20 度，培养6天后，取Iml发酵液，14000rpm离心lOmin，上清液即为粗酶液。在含有100mM，pH = 5.0的醋酸盐缓冲溶液，0. 5mM ABTS和IOOul粗酶液的Iml反应体系中，室温下3min，测 OD彻。结果酶活力可达4 5U/mL，其中酶活力是指上述条件下，每分钟催化liimol ABTS 氧化所需的酶量。该工程菌产酶的特征是分子量为56614，为单体酶。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
权利要求
1.韦伯灵芝(Ganodermaweberianum TZCI) TZCl 菌株，CGMCC Na 2648。
2.韦伯灵芝(Ganodermaweberianum TZC1) TZCl菌株漆酶基因,其核苷酸序列为下列之一1)序列表中SEQID No. I的DNA序列；2)编码序列表中SEQID No. 2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQID No. I限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
3.根据权利要求2所述的基因,其特征在于,所述韦伯灵芝(Ganodermaweberianum TZCDTZC1菌株漆酶基因的cDNA序列是序列表中的SEQ ID No. 3。
4.韦伯灵芝(Ganodermaweberianum TZC1) TZCl 菌株漆酶,是序列表中 SEQ ID No. 2。
5.—种表达载体,其特征在于,该载体含有权利要求2所述的基因。
6.根据权利要求5所述的一种表达载体,其特征在于,所述载体为pPICZB/Lacl。
7.—种转基因细胞系，其特征在于，该细胞系含有权利要求2所述的基因。
8.—种工程菌，其特征在于，该工程菌含有权利要求2所述的基因。
9.根据权利要求8所述的一种工程酶，其特征在于，所述工程菌为巴氏毕赤酵母 (Pichia pastoris)GS115_lacl0
全文摘要
本发明公开了一种韦伯灵芝漆酶及其编码基因与工程菌。本发明所提供的韦伯灵芝[Ganoderma weberianum(Bres.&Henn.)]TZC1菌漆酶基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No.2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的工程菌在最佳发酵条件下，酶活力可达4-5单位/毫升，并且其发酵方法简单可行，培养基便宜易得，产酶能力强，易于工业化生产，生产成本低。
文档编号C12N15/63GK102618450SQ201210098410
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者周玉萍, 田长恩, 陈琼华 申请人:广州大学