专利名称：满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种藻类粉的制备方法，具体涉及一种特殊存在状态的满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术：
满江红鱼腥藻(Anabaena azollae)由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供(编号FACHB_190),并已在《Jianying Shen, Antonio DiTommaso, Mingquan Shen,Wei Lu, and Zhengming Li ；Molecular basis for differential metabolic responsesto monosulfuron in three nitrogen-fixing cyanobacteria, Weed Science,2009,57 :178-188〉〉、〈〈Jianying Shen, Jing Jiang, Peizhong Zheng ；Effects of Light andMonosulfuron on growth and Photosynthetic Pigments of Anabaenaflos-aquae Breb,Water Resource and Protection, 2009,1 :408_413》上公开。满江红鱼腥藻是寄生在满江红植物体内的一种蓝藻，能够固定大气中的游离氮，其特有的藻促生长素能促进作物茁壮生长，对水稻增产作用显著，一般达1-2成，并有改良土壤和抑制杂草的作用。满江红鱼腥藻个体小，繁殖快，便于连续培养，是一种良好的生物肥源，由于农用化学肥料和农药的生产及施用会带来大量的温室气体排放，因此开发农业生物固氮技术，降低化肥施用量，是当前发展低碳农业的重要途径。随着农业科技的快速发展，生物菌肥将会越来越多的被开发利用。满江红鱼腥藻的用途主要有用作固氮和共生研究的好材料，用来提取天然色素、藻促说生长素、藻胆蛋白和多糖，用作为绿肥，开发氢能源等。目前国内外对满江红鱼腥藻干藻粉的相关研究还很少，中科院曾在《满江红鱼腥藻休眠和萌发孢子的吸收光谱和荧光光谱特性》中提到高孢子含量的诱导方法，在藻类干藻粉的制备方面，仅见沈银武等在《固氮蓝藻培养和应用的结果与展望》中提到大量生产和风干或晒干等方法，而在其他方面的探索则少见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，以微量满江红鱼腥藻干藻粉为原料，外加理化条件高效激活，并通过合适的条件刺激使满江红鱼腥藻快速生长繁殖，再借助塑料膜和特殊的干燥方式，大批量生产出具有较强抗逆性和较高活力的满江红鱼腥藻干藻粉，该方法具有安全和方便的特点。本发明是通过以下技术方案实现的一种满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，其使用含有磷酸氢二钾、柠檬酸铁、钥酸和 碳酸钙的PH值为8的基础培养液，在添加硝酸钾的基础上培养满江红鱼腥藻2-3天，实现满江红鱼腥藻的快速激活；将激活的满江红鱼腥藻转移到不透明的敞口容器中，添补基础培养液并加入葡萄糖，再培养5-7天；倒掉基础培养液，并将培养的满江红鱼腥藻转移到覆盖有塑料膜的瓷盘中，在一定条件下干燥和粉碎，收获大批量满江红鱼腥藻干藻粉。
所述的在添加硝酸钾的基础上培养满江红鱼腥藻2-3天是指称取微量的满江红鱼腥藻干藻粉，溶解在基础培养液中并打碎，再将藻液转移至培养皿中，添加硝酸钾且将藻液PH值调到8之后，放置在无菌室中定时搅拌培养2-3天。所述的培养皿的直径为90mm。所述的添加硝酸钾,使其浓度达到250mg/L或380mg/L。所述的无菌室的光强为3000±200Lx、温度为30±2°C。所述的定时是指每天在同一个时间。所述的搅拌是指借助灭过菌的三角棒或5ml的移液枪把细胞打散打匀。所述的基础培养液的组分为280mg/L磷酸氢二钾、10mg/L柠檬酸铁、10mg/L钥 酸、100mg/L碳酸|丐，余量为生活所用的自来水。所述的敞口容器的高度为20-50cm。所述的加入葡萄糖，使其浓度达到380-500mg/L。所述的瓷盘的高度为10_20cm。所述的在一定条件下干燥和粉碎是指将所述盛有培养的满江红鱼腥藻的瓷盘置于35-40°C的烘箱中烘干或者置于30°C的光照室中干燥3-5天，并且用粉碎机粉碎。本发明所述的满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法以微量满江红鱼腥藻干藻粉为原料，通过快速激活-培养繁殖-干燥粉碎三个主要工艺流程，大批量生产出具有较强抗逆性的满江红鱼腥藻干藻粉。发明人进行了大量实验，摸索出所述制备方法中的最优工艺参数，请参阅图1、2和3,最佳工艺如下称取磷酸氢二钾75mg、朽1檬酸铁5mg、钥酸2. 5mg和碳酸韩IOOmg溶于IL水中，制成基础培养液，添加硝酸钾300mg，培养满江红鱼腥藻3天后，再添加葡萄糖400mg，连续培养6天；倒掉培养液，并将满江红鱼腥藻转移到覆盖有塑料膜的瓷盘中，在38°C的烘箱中干燥，经粉碎后，即收获量产的满江红鱼腥藻干藻粉。本发明的有益效果在于有效的激活条件大大提高了干藻粉的萌发比例，缩短了萌发时间；葡萄糖的使用增强了满江红鱼腥藻的抗逆性；借助塑料膜的干燥方式使干藻粉的收获更加高效。所述满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法具有工艺简单、易于推广实施，肥料安全高效、施用后不会对环境及食品安全造成新的污染等优点，所以本发明具有极大的理论价值和应用价值。
图I是在不同浓度磷酸氢二钾的激活下，满江红鱼腥藻在连续培养7天中的含量。图2是在不同浓度硝酸钾的激活下，满江红鱼腥藻在连续培养7天中的含量。图3是在不同浓度葡萄糖的作用下，满江红鱼腥藻在连续培养7天中的含量。图4是本发明的制备工艺流程。
具体实施例方式请参阅图4，本发明所述的满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法以微量满江红鱼腥藻干藻粉为原料，通过快速激活-培养繁殖-干燥粉碎三个主要工艺流程，大批量生产出具有较强抗逆性的满江红鱼腥藻干藻粉。
本发明的主要工艺步骤为使用含有磷酸氢二钾、柠檬酸铁、钥酸和碳酸钙的pH值为8的基础培养液，在添加硝酸钾的基础上培养满江红鱼腥藻2-3天，实现满江红鱼腥藻的快速激活；将激活的满江红鱼腥藻转移到不透明的敞口容器中，添补基础培养液并加入葡萄糖，再培养5-7天；倒掉基础培养液，并将培养的满江红鱼腥藻转移到覆盖有塑料膜的瓷盘中，在一定条件下干燥和粉碎，收获大批量满江红鱼腥藻干藻粉。下面结合实施例对本发明作详细说明，该实施例以本发明技术方案为前提给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不仅限于下述的实施例。实施例1
主要材料和设备硝酸钾、氢氧化钠、盐酸、葡萄糖、基础培养液、满江红鱼腥藻干藻粉、打藻机、培养皿、敞口容器、塑料膜、瓷盘、无菌室、光照室。具体方案是称取0. Olg的满江红鱼腥藻干藻粉，溶解在小烧杯内的IOmL基础培养液中，用75%酒精灭菌后的打藻机打碎3次，每次10秒钟，该基础培养液的组分为280mg/L磷酸氢二钾、10mg/L柠檬酸铁、10mg/L钥酸、100mg/L碳酸钙，余量为生活所用的自来水；再把藻液转移到O90X15mm的培养皿中，用基础培养液冲洗小烧杯再倒在培养皿中以免残留，随后向培养皿内补加基础培养液到35mL ;然后添加硝酸钾，使其浓度达到250mg/L，用氢氧化钠和盐酸将藻液pH值调到8，之后将培养皿放置在光强为3000±200Lx、温度为30±2°C的无菌室中对满江红鱼腥藻进行培养，同时定时搅拌，即每天在同一个时间借助灭过菌的三角棒或5ml的移液枪把细胞打散打匀，一般培养2-3天后满江红鱼腥藻被大量激活。此时将激活的满江红鱼腥藻转移到不透明的敞口容器中，该敞口容器的高度为20-50cm,长宽无限制；然后补充适量的基础培养液，称取葡萄糖加到敞口容器中，使其浓度达到380mg/L，再培养5-7天。之后倒出多余的基础培养液，将培养的大量满江红鱼腥藻转移到覆盖有塑料膜的高度为10-20cm的瓷盘中，并将该瓷盘置于30°C的光照室内，干燥3_5天后满江红鱼腥藻自动与塑料膜剥离，再用粉碎机粉碎干燥后的满江红鱼腥藻，从而收获大批量的满江红鱼腥藻干藻粉。实施例2主要材料和设备硝酸钾、氢氧化钠、盐酸、葡萄糖、基础培养液、满江红鱼腥藻干藻粉、打藻机、培养皿、敞口容器、塑料膜、瓷盘、无菌室、光照室。本实施例的具体方案除下列工艺条件外，其余内容和步骤过程与上述实施例I相同添加硝酸钾,使其浓度达到380mg/L ；称取葡萄糖加到敞口容器中，使其浓度达到450mg/L。实施例3主要材料和设备硝酸钾、氢氧化钠、盐酸、葡萄糖、基础培养液、满江红鱼腥藻干藻粉、打藻机、培养皿、敞口容器、塑料膜、瓷盘、无菌室、烘箱。具体方案是称取0. Olg的满江红鱼腥藻干藻粉，溶解在小烧杯内的IOmL基础培养液中，用75%酒精灭菌后的打藻机打碎3次，每次10秒钟，该基础培养液的组分为280mg/L磷酸氢二钾、10mg/L柠檬酸铁、10mg/L钥酸、100mg/L碳酸钙，余量为生活所用的自来水；再把藻液转移到O90X15mm的培养皿中，用基础培养液冲洗小烧杯再倒在培养皿中以免残留，随后向培养皿内补加基础培养液到35mL ;然后添加硝酸钾，使其浓度达到380mg/L，用氢氧化钠和盐酸将藻液pH值调到8，之后将培养皿放置在光强为3000±200Lx、温度为30±2°C的无菌室中对满江红鱼腥藻进行培养，同时定时搅拌，即每天在同一个时间借助灭过菌的三角棒或5ml的移液枪把细胞打散打匀，一般培养2-3天后满江红鱼腥藻被大量激活。此时将激活的满江红鱼腥藻转移到不透明的敞口容器中，该敞口容器的高度为20-50cm,长宽无限制；然后补充适量的基础培养液，称取葡萄糖加到敞口容器中，使其浓度达到380mg/L，再培养5-7天。之后倒出多余的基础培养液，将培养的大量满江红鱼腥藻转移到覆盖有塑料膜的高度为10-20cm的瓷盘中，并将该瓷盘置于40°C的烘箱中，干燥12小时后满江红鱼腥藻自动与塑料膜剥离，再用粉碎机粉碎干燥后的满江红鱼腥藻，从而收获大批量的满江红鱼腥藻干藻粉。实施例4主要材料和设备硝酸钾、氢氧化钠、盐酸、葡萄糖、基础培养液、满江红鱼腥藻干藻粉、打藻机、培养皿、敞口容器、塑料膜、瓷盘、无菌室、光照室。本实施例的具体方案除下列工艺条件外，其余内容和步骤过程与上述实施例3相同添加硝酸钾，使其浓度达到250mg/L ；称取葡萄糖加到敞口容器中，使其浓度达到500mg/L ；瓷盘置于35°C的烘箱中。 以上实施例不是对本发明的限制，具体实施时可以按一定比例配制大体积的培养液，如IOOmL基础培养液中加35-50mg葡萄糖，加0. 03g满江红鱼腥藻干藻粉；1L基础培养液中加350-500mg葡萄糖，加0. 30g满江红鱼腥藻干藻粉，培养皿直径150mm等等。
权利要求
1.一种满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，其特征是，使用含有磷酸氢二钾、柠檬酸铁、钥酸和碳酸钙的PH值为8的基础培养液，在添加硝酸钾的基础上培养满江红鱼腥藻2-3天，实现满江红鱼腥藻的快速激活；将激活的满江红鱼腥藻转移到不透明的敞口容器中，添补基础培养液并加入葡萄糖，再培养5-7天；倒掉基础培养液，并将培养的满江红鱼腥藻转移到覆盖有塑料膜的瓷盘中，在一定条件下干燥和粉碎，收获大批量满江红鱼腥藻干藻粉。
2.根据权利要求I所述的满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，其特征是，所述的在添加硝酸钾的基础上培养满江红鱼腥藻2-3天是指称取微量的满江红鱼腥藻干藻粉，溶解在基础培养液中并打碎，再将藻液转移至培养皿中，添加硝酸钾且将藻液PH值调到8之后，放置在无菌室中定时搅拌培养2-3天。
3.根据权利要求2所述的满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，其特征是，所述的培养皿的直径为90mm。
4.根据权利要求2所述的满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，其特征是，所述的添加硝酸钾，使其浓度达到250mg/L或380mg/L。
5.根据权利要求2所述的满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，其特征是，所述的无菌室的光强为3000±200Lx、温度为30±2°C。
6.根据权利要求2所述的满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，其特征是，所述的定时是指每天在同一个时间。
7.根据权利要求2所述的满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，其特征是，所述的搅拌是指借助灭过菌的三角棒或5ml的移液枪把细胞打散打匀。
8.根据权利要求I至7任一项所述的满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，其特征是，所述的基础培养液的组分为280mg/L磷酸氢二钾、10mg/L朽1檬酸铁、10mg/L钥酸、100mg/L碳酸钙，余量为生活所用的自来水。
9.根据权利要求I所述的满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，其特征是，所述的敞口容器的高度为20-50cm。
10.根据权利要求I所述的满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，其特征是，所述的加入葡萄糖，使其浓度达到380-500mg/L。
11.根据权利要求I所述的满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，其特征是，所述的瓷盘的高度为10_20cm。
12.根据权利要求I所述的满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，其特征是，所述的在一定条件下干燥和粉碎是指将所述盛有满江红鱼腥藻的瓷盘置于35-40°C的烘箱中烘干或者置于30°C的光照室中干燥3-5天，并且用粉碎机粉碎干燥后的满江红鱼腥藻。
全文摘要
一种满江红鱼腥藻干藻粉的制备方法，其使用含有磷酸氢二钾、柠檬酸铁、钼酸和碳酸钙的pH值为8的基础培养液，在添加硝酸钾的基础上培养满江红鱼腥藻2-3天，实现满江红鱼腥藻的快速激活；将激活的满江红鱼腥藻转移到不透明的敞口容器中，添补基础培养液并加入葡萄糖，再培养5-7天；倒掉基础培养液，并将培养的满江红鱼腥藻转移到覆盖有塑料膜的瓷盘中，在一定条件下干燥和粉碎，收获大批量满江红鱼腥藻干藻粉。本发明提高了干藻粉的萌发比例，缩短了萌发时间，增强了满江红鱼腥藻的抗逆性，能够更高效地收获干藻粉，具有工艺简单、易于推广实施，肥料安全高效、不会对环境及食品安全造成污染等优点，因而具有极大的理论价值和应用价值。
文档编号C12N1/38GK102618480SQ20121010350
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者万旗东, 沈健英 申请人:上海交通大学