专利名称：固氮鱼腥藻干藻粉的快速激活及其大量生产的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术，具体涉及一种固氮鱼腥藻干藻粉的快速激活及其大量生产的方法。
背景技术：
固氮鱼腥藻(Anabaena azotica)由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供(编号FACHB_686),并已在《Jianying Shen, Antonio DiTommaso, Mingquan Shen,Wei Lu， and Zhengming Li ；Molecular basis for differential metabolic responsesto monosulfuron in three nitrogen-fixing cyanobacteria, Weed Science，2009，57 :178_188〉〉、〈〈Jianying Shen, Jing Jiang, Peizhong Zheng ；Effects of Light andMonosulfuron on growth and Photosynthetic Pigments of Anabaena flos—aquae Breb,Water Resource and Protection，2009，I :408_413》、《郑培忠，沈健英；有机溶剂丙酮对固氮蓝藻生长效应的研究，上海农业学报，2010. 4 :33-38))等中公开。固氮鱼腥藻能固定大气中的游离氮，是固氮蓝藻的一种。它生长繁殖迅速，固氮量达20-55kg/hm2，其藻体沉入土壤后可被作物根系吸收，特有的藻促生长素能促进作物茁壮生长，使作物增产10-30%，因此这是一种良好的有机肥。而农用化学肥料和农药的生产、施用又会带来大量的温室气体排放，因此开发农业生物固氮技术，降低化肥施用量，是当前发展低碳农业的重要途径。固氮鱼腥藻的用途主要有提取天然色素、藻胆蛋白和多糖，生物固氮及其他方面等。制备成的干藻粉常有萌发率偏低的缺点，因此稻田的肥效功能未能充分的发挥。目前为止国内外对固氮鱼腥藻干藻粉的相关研究很少，在干藻粉的激活方面，仅见黄有馨等在《固氮蓝藻干藻种制备及其在稻田中的应用效果》中提到麦壳或稻壳的附着能提高萌发效果，而在其他方面的探索则少见报道。
发明内容
本发明的目的，就是针对现有技术存在的上述不足，提供一种固氮鱼腥藻干藻粉的快速激活及其大量生产的方法。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案一种固氮鱼腥藻干藻粉的快速激活方法，包括以下步骤a、取定量的磷酸氢二钾、柠檬酸铁、钥酸和碳酸钙溶解在水中，制备成基础培养液，并使基础培养液中各组分的终浓度为磷酸氢二钾75mg/L、柠檬酸铁10mg/L、钥酸10mg/L、碳酸 丐 100mg/L ；b、将固氮鱼腥藻干藻粉溶解在基础培养液中并用打藻机打碎，制备成固氮鱼腥藻溶液；C、将固氮鱼腥藻溶液置于基础培养液中，添加定量的硝酸钾、调节pH为7-9，在半敞开的状态下培养2-3天，实现固氮鱼腥藻的快速激活。
所述的添加定量的硝酸钾是指，使硝酸钾的浓度达到380-500mg/L ;所述的调节PH为7-9通过氢氧化钠和盐酸调节；所述的在半敞开的状态下培养是用培养皿定时搅拌培养。所述的定时搅拌培养是指每天在同一个时间搅拌一次。
所述的搅拌是指借助灭过菌的三角棒或5ml的移液枪把细胞打散打匀。上述方法激活的固氮鱼腥藻的大量生产方法，通过将激活所得固氮鱼腥藻转移到加有葡萄糖或蔗糖的基础培养液的不透明的敞口容器中，培养5-7天，得到量产的固氮鱼腥藻。所述的加有葡萄糖或蔗糖的基础培养液中各成分的浓度为磷酸氢二钾75mg/L、梓檬酸铁10mg/L、钥酸10mg/L、碳酸|丐100mg/L、葡萄糖130_200mg/L或鹿糖70_130mg/L,余量为水。本发明针对目前大力推广低碳农业，减少化肥和农药的施用，提高有机肥的用量和肥效的政策，和固氮鱼腥藻干藻粉的萌发率偏低的弊端，以及固氮鱼腥藻不便于收获的缺陷，提供了一种以固氮鱼腥藻干藻粉为原料，外加理化条件高效激活，使其快速生长繁殖，并通过合适的条件刺激，借助塑料膜，大量生产抗逆性较强的高活力的固氮鱼腥藻，是一种安全方便的生产微生物菌肥的技术。本发明的优点在于有效的激活条件大大提高了干藻粉的萌发比例，缩短了萌发时间，葡萄糖或蔗糖的使用增强了固氮鱼腥藻的抗逆性；固氮鱼腥藻干藻粉的高效激活方法及其大量生产方法涉及的工艺简单；肥料施用安全高效，易于推广实施；实施后不会对环境、食品安全造成新的污染；所以本发明具有极大的理论价值和应用价值。
图I是本发明中在不同硝酸钾浓度的激活下，固氮鱼腥藻在连续培养7天的含量。图2是本发明中在不同pH的激活下，固氮鱼腥藻在连续培养7天的含量。图3是本发明中在不同敞开状态的激活下，固氮鱼腥藻在连续培养7天的含量。图4是本发明中在不同糖的作用下，固氮鱼腥藻在连续培养7天的含量。图5是本发明中固氮鱼腥藻的两类细胞。图6-8是本发明中固氮鱼腥藻的透射电镜图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。实施例中所用基础培养液的组分和浓度均为磷酸氢二钾75mg/L、朽1檬酸铁10mg/L、钥酸10mg/L、碳酸|丐100mg/L。实施例I称取0. Olg的固氮鱼腥藻干藻粉，溶解在含有IOmL基础培养液的小烧杯中，用75%酒精灭菌的打藻机打碎3次，每次10s，再把藻液转移到90X15mm的小培养皿中，用基础培养液冲洗烧杯再倒在培养皿中，最后培养皿补加基础培养液到35mL。添加硝酸钾，使其浓度达到380-500mg/L，用氢氧化钠和盐酸将pH调到7，最后放置在光强为3000±200Lx、温度为30±2°C的无菌室中培养。一般培养2-3天后固氮鱼腥藻开始被大量激活，此时将激活的固氮鱼腥藻转移到不透明的敞口容器中，补充适量的基础培养液，称取适量蔗糖加到容器中，使其浓度达到70-130mg/L，再培养5_7天，倒出多余的基础培养液，收获固氮鱼腥藻。实施例2称取O. Olg的固氮鱼腥藻干藻粉，溶解在含有IOmL基础培养液的小烧杯中，用75%酒精灭菌的打藻机打碎3次，每次10s，再把藻液转移到90X15mm的小培养皿中，用基础培养液冲洗烧杯再倒在培养皿中，最后培养皿补加基础培养液到35mL。添加硝酸钾，使其浓度达到380-500mg/L，用氢氧化钠和盐酸将pH调到9，最后放置在光强为3000 ± 200Lx、温度为30±2°C的无菌室中培养。一般培养2-3天后固氮鱼腥藻开始被大量激活，此时将激活的固氮鱼腥藻转移到不透明的敞口容器中，补充适量的基础培养液，称取适量蔗糖加到容器中，使其浓度达到70-130mg/L，再培养5_7天，倒出多余的基础培养液，收获固氮鱼腥藻。实施例3称取O. Olg的固氮鱼腥藻干藻粉，溶解在含有IOmL基础培养液的小烧杯中，用75%酒精灭菌的打藻机打碎3次，每次10s，再把藻液转移到90X15mm的小培养皿中，用基础培养液冲洗烧杯再倒在培养皿中，最后培养皿补加基础培养液到35mL。添加硝酸钾，使其浓度达到380-500mg/L，用氢氧化钠和盐酸将pH调到9，最后放置在光强为3000 ± 200Lx、温度为30±2°C的无菌室中培养。一般培养2-3天后固氮鱼腥藻开始被大量激活，此时将激活的固氮鱼腥藻转移到不透明的敞口容器中，补充适量的基础培养液，称取适量葡萄糖加到容器中，使其浓度达到130-200mg/L，再培养5_7天，倒出多余的基础培养液，收获固氮鱼腥藻。以上实施例不是对本发明的限制，具体实施时可以在权利要求限定的范围内按一定比例配制大体积的基础培养液，如IOOmL基础培养液中加13-20mg葡萄糖或7_13mg蔗糖，加O. 03g固氮鱼腥藻干藻粉；1L基础培养液中加100-200mg葡萄糖或70_150mg蔗糖，加O. 30g固氮鱼腥藻干藻粉等。图I是本发明中在不同硝酸钾浓度的激活下，固氮鱼腥藻在连续培养7天的含量。图2是本发明中在不同pH的激活下，固氮鱼腥藻在连续培养7天的含量。图3是本发明中在不同敞开状态的激活下，固氮鱼腥藻在连续培养7天的含量。图4是本发明中在不同糖的作用下，固氮鱼腥藻在连续培养7天的含量。图5是本发明中固氮鱼腥藻的两类细胞。 图6-8是本发明中固氮鱼腥藻的透射电镜图。
权利要求
1.一种固氮鱼腥藻干藻粉的快速激活方法，其特征在于，包括以下步骤 a、取定量的磷酸氢二钾、柠檬酸铁、钥酸和碳酸钙溶解在水中，制备成基础培养液，并使基础培养液中各组分的终浓度为磷酸氢二钾75mg/L、柠檬酸铁10mg/L、钥酸10mg/L、碳酸钙 100mg/L ； b、将固氮鱼腥藻干藻粉溶解在基础培养液中并用打藻机打碎，制备成固氮鱼腥藻溶液； C、将固氮鱼腥藻溶液置于基础培养液中，添加定量的硝酸钾、调节pH为7-9，在半敞开的状态下培养2-3天，实现固氮鱼腥藻的快速激活。
2.根据权利要求I所述的固氮鱼腥藻干藻粉的快速激活方法，其特征在于所述的添加定量的硝酸钾是指，使硝酸钾的浓度达到380-500mg/L ;所述的调节pH为7-9通过氢氧化钠和盐酸调节；所述的在半敞开的状态下培养是用培养皿定时搅拌培养。
3.根据权利要求2所述的固氮鱼腥藻干藻粉的快速激活方法，其特征在于所述的定时搅拌培养是指每天在同一个时间搅拌一次。
4.根据权利要求3所述的固氮鱼腥藻干藻粉的快速激活方法，其特征在于所述的搅拌是指借助灭过菌的三角棒或5ml的移液枪把细胞打散打匀。
5.根据权利要求I所述方法激活的固氮鱼腥藻的大量生产方法，其特征在于通过将激活所得固氮鱼腥藻转移到加有葡萄糖或蔗糖的基础培养液的不透明的敞口容器中，培养5-7天，得到量产的固氮鱼腥藻。
6.根据权利要求5所述的固氮鱼腥藻的大量生产方法，其特征在于所述的加有葡萄糖或蔗糖的基础培养液中各成分的浓度为磷酸氢二钾75mg/L、柠檬酸铁10mg/L、钥酸10mg/L、碳酸韩100mg/L、葡萄糖130_200mg/L或鹿糖70_130mg/L,余量为水。
全文摘要
一种固氮鱼腥藻干藻粉的快速激活方法是a、取定量的磷酸氢二钾、柠檬酸铁、钼酸和碳酸钙制备成基础培养液；b、将固氮鱼腥藻干藻粉溶解在基础培养液中，制备成固氮鱼腥藻溶液；c、将固氮鱼腥藻溶液置于基础培养液中，添加定量的硝酸钾、调节pH为7-9，培养2-3天，实现固氮鱼腥藻的快速激活。上述方法激活的固氮鱼腥藻的大量生产方法是将激活所得固氮鱼腥藻转移到加有葡萄糖或蔗糖的基础培养液的不透明的敞口容器中，培养5-7天，得到量产的固氮鱼腥藻。本发明的方法采用有效的激活条件大大提高了干藻粉的萌发比例，缩短了萌发时间，葡萄糖或蔗糖的使用增强了固氮鱼腥藻的抗逆性。
文档编号C12N1/12GK102628027SQ20121010168
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月9日 优先权日2012年4月9日
发明者万旗东, 沈健英 申请人:上海交通大学