专利名称:水华鱼腥藻厚壁孢子的诱导技术及其干藻粉的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域：
的优化生产方法，具体是一种水华鱼腥藻厚壁孢子的诱导技术及其干藻粉的制备方法。
背景技术：
水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae)由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供(编号FACHB_245),记载于《Jianying Shen, Antomo DiTommaso, Mingquan Shen,Wei Lu, and Zhengming Li ；Molecular basis for differential metabolic responsesto monosulfuron inthree nitrogen-fixing cyanobacteria, Weed Science,2009,57 :178-188〉〉、〈〈Jianying Shen, JingJiang, Peizhong Zheng ；Effects of Light andMonosulfuron on growth and PhotosyntheticPigments of Anabaena flos-aquae Breb,Water Resource and Protection, 2009,1 :408_413》、《郑培忠，沈健英；有机溶剂丙酮对固 氮蓝藻生长效应的研究，上海农业学报，2010. 4 :33-38))等中公开。
水华鱼腥藻能固定大气中的游离氮，是固氮蓝藻的一种。它生长繁殖迅速，固氮量达10_51kg/ha，其藻体沉入土壤后可被作物根系吸收，特有的藻促生长素能促进作物茁壮生长，使作物增产10-30%，因此这是一种良好的有机肥。而农用化学肥料和农药的生产、施用又会带来大量的温室气体排放，因此开发农业生物固氮技术，降低化肥施用量，是当前发展低碳农业的重要途径。
水华鱼腥藻的用途主要有提取天然色素、藻胆蛋白和多糖，藻毒素研究及利用，生物固氮及其他方面等。用途虽多，但是因为水华鱼腥藻含水量高导致容易霉变，占用体积大导致难以运输，施用不方便导致不能大面积推广，因而不便于利用。为了大量并且方便应用这种蓝藻，可以通过施加某些条件，诱导厚壁孢子大量生成，再把水华鱼腥藻的藻液干燥，制备成干藻粉，以便长距离运输和长时间保存。在自然条件下，厚壁孢子比营养细胞的存活率要高很多，应用稻田后更容易萌发。现有的水华蓝藻中已知含有微量的厚壁孢子，厚壁孢子不仅耐低温，就是在高温下也不易死亡。天然存在的厚壁孢子因为极微量，所以应用于稻田后萌发率不高，肥效不明显。
目前为止国内外对水华蓝藻的异形胞有所研究，而对水华蓝藻厚壁孢子的诱导的研究则几乎没有。公开号为CN 1380901A的专利文献，公开了大量生产Trichodermaherzianum SK-55的菌丝体的厚壁抱子的方法。Trichoderma herzianum SK-55属于真菌，而水华鱼腥藻则属于细菌，尚未见关于水华鱼腥藻厚壁孢子大量生产的技术公开。
蓝藻的干燥方法有很多有摊开在玻璃板上干燥，有放置在大瓷盘里干燥，还有直接在大小培养皿里干燥，但是这些干燥方法都很难把干燥的蓝藻收集储存。本发明的简易干燥方法是把倒去培养液的水华鱼腥藻转移到灭过菌的覆盖有塑料膜的大培养皿或瓷盘中，待干燥时蓝藻会自动与塑料膜剥离，非常便于收集。
发明内容
[0007]本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种水华鱼腥藻厚壁孢子的诱导技术及其干藻粉的制备方法，针对目前大力推广低碳农业，减少化肥和农药的施用，提高有机肥的用量和肥效的政策，和水华蓝藻的含水量高、占用体积大，不便于运输保存的弊端，以及水华鱼腥藻不便于收获的缺陷，本发明提供了一种以水华蓝藻为原料，外加理化条件大量诱导厚壁孢子形成并借助塑料膜制备干藻粉的高效安全方便的生产肥料的技术。
本发明是通过以下技术方案实现的
本发明涉及水华鱼腥藻厚壁孢子的一种诱导方法，使用含有磷酸氢二钾、柠檬酸铁、钥酸和碳酸钙的液体培养基在PH调到6-7，蔗糖或葡萄糖调到80-100mg/L的条件下培养水华鱼腥藻3-4天，实现水华鱼腥藻厚壁孢子的诱导。
所述的水华鱼腥藻是指将含水量约10%的水华鱼腥藻干藻粉密闭保存于4°C的冰箱中两周后取出，转移到加有培养液的小烧杯中并用打藻机打碎。
所述的培养液的组分为75g/L磷酸氢二钾、10g/L柠檬酸铁、10g/L钥酸、100g/L 碳酸钙，余量为50g/L的土壤提取液。
所述的在pH调到6-7的环境下培养是指将水华鱼腥藻以接种量为280_300mg/L接种在液体培养基中，在光强为3000±200Lx，温度为30±2°C，pH为6_7的环境下定时开
盖搅拌培养。
所述的定时是指每天在同一个时间段搅拌一次。
所述的搅拌是指借助灭过菌的三角棒或玻璃棒或移液枪把细胞打散打匀。
本发明涉及上述水华鱼腥藻厚壁孢子的干藻粉的制备方法，通过将所述水华鱼腥藻厚壁孢子平铺瓷盘中，置于35-40°C的烘箱烘干或30°C的无菌室中干燥3-5天得到干藻粉。
所述的平铺是指采用厚度不超过Icm的高度平铺在瓷盘底部且使其均匀散开。
所述的瓷盘是指铺有灭过菌的塑料膜的白瓷盘。
本发明的优点在于有效的理化条件大量提高了厚壁孢子的含量；简易的干燥方式可以更加高效的收获干藻粉；以水华蓝藻为原料制备干藻粉的方法涉及的工艺简单；月巴料施用安全高效，易于推广实施；实施后不会对环境、食品安全造成新的污染；所以本发明具有极大的理论价值和应用价值。
图I是本发明中水华鱼腥藻厚壁孢子的诱导及其干藻粉制备的原理图
图2是实施例中在不同pH的诱导条件下，水华鱼腥藻厚壁孢子在连续培养7天的含量。
图3是实施例中在不同培养液的诱导条件下，水华鱼腥藻厚壁孢子在连续培养7天的含量。
图4是实施例中在不同保存温度的诱导条件下，水华鱼腥藻厚壁孢子在连续培养7天的含量。
图5是实施例中水华鱼腥藻的三类细胞。
图6是实施例中水华鱼腥藻厚壁孢子的透射电镜图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例I
主要材料氢氧化钠、盐酸、蔗糖、培养液、干藻粉、塑料膜、大瓷盘。
如图I所示，具体方案是称取O. Olg左右的水华干藻粉，溶解在含有IOmL培养液的小烧杯中，用75%酒精灭菌的打藻机打碎3次，每次10s，再把藻液转移到90X 15mm的小培养皿中，用培养液冲洗烧杯再倒在培养皿中,最后培养皿补加培养液到35mL。用氢氧化钠和盐酸将pH调到6，然后加3mg蔗糖于培养皿中，最后放置在光强为3000±200Lx、温度为30±2°C的无菌室中培养。一般培养3天后厚壁孢子含量将达到峰值，此时倒出多余培养液，保留水华鱼腥藻。再把蓝藻转移到灭过菌的覆盖有塑料膜的大瓷盘中，平铺厚度不超 过1cm，并且使其均匀散开，置于30°C的光照室，大概3-5天后水华鱼腥藻将会自动与薄膜剥离，非常容易收获。
显微计数在培养第三天，取样进行显微计数，经计算得知，细胞总数为6. 15X105个/mL，厚壁孢子数为I. 03 X IO5个/mL，占细胞总数的16.75%。
如图5所示，为实施例中水华鱼腥藻的三类细胞；对应如图6所示,为水华鱼腥藻厚壁孢子的透射电镜图。
实施例2
主要材料氢氧化钠、盐酸、葡萄糖、培养液、干藻粉、塑料膜、大瓷盘。
具体方案是称取O. Olg左右的水华干藻粉，溶解在含有IOmL培养液的小烧杯中，用75%酒精灭菌的打藻机打碎3次，每次10s，再把藻液转移到90X 15mm的小培养皿中，用培养液冲洗烧杯再倒在培养皿中，最后培养皿补加培养液到35mL。用氢氧化钠和盐酸将pH调到6，然后加3mg葡萄糖于培养皿中，最后放置在光强为3000±200Lx、温度为30±2°C的无菌室中培养。一般培养3天后厚壁孢子含量将达到峰值，此时倒出多余培养液，保留水华鱼腥藻。再把蓝藻转移到灭过菌的覆盖有塑料膜的大瓷盘中，平铺厚度不超过1cm，并且使其均匀散开，置于30°C的光照室，大概3-5天后水华鱼腥藻将会自动与薄膜剥离，非常容易收获。
显微计数在培养第三天，取样进行显微计数，经计算得知，细胞总数为1.02X106个/mL，厚壁孢子数为I. 13 X IO5个/mL，占细胞总数的11.08%。
实施例3
主要材料氢氧化钠、盐酸、葡萄糖、培养液、干藻粉、塑料膜、大培养皿、烘箱。
具体方案是称取O. Olg左右的水华干藻粉，溶解在含有IOmL培养液的小烧杯中，用75%酒精灭菌的打藻机打碎3次，每次10s，再把藻液转移到90X 15mm的小培养皿中，用培养液冲洗烧杯再倒在培养皿中，最后培养皿补加培养液到35mL。用氢氧化钠和盐酸将pH调到7，然后加3mg葡萄糖于培养皿中，最后放置在光强为3000±200Lx、温度为30±2°C的无菌室中培养。一般培养3天后厚壁孢子含量将达到峰值，此时倒出多余培养液，保留水华鱼腥藻。再把蓝藻转移到灭过菌的覆盖有塑料膜的150 X 15_大培养皿中，平铺厚度不超过1cm，并且使其均匀散开，置于40°C的烘箱中干燥，大概12h后水华鱼腥藻将会自动与薄膜剥离，非常容易收获。
显微计数在培养第三天，取样进行显微计数，经计算得知，细胞总数为8. 23 X IO5个/mL，厚壁孢子数为I. 53 X IO5个/mL，占细胞总数的18. 59%。
实施例4
主要材料氢氧化钠、盐酸、蔗糖、培养液、干藻粉、塑料膜、大培养皿、烘箱。
具体方案是称取O. Olg左右的水华干藻粉，溶解在含有IOmL培养液的小烧杯中，用75%酒精灭菌的打藻机打碎3次，每次10s，再把藻液转移到90X 15mm的小培养皿中，用培养液冲洗烧杯再倒在培养皿中，最后培养皿补加培养液到35mL。用氢氧化钠和盐酸将pH调到7，然后加3mg蔗糖于培养皿中，最后放置在光强为3000±200Lx、温度为30±2°C的无菌室中培养。一般培养3天后厚壁孢子含量将达到峰值，此时倒出多余培养液，保留水华鱼腥藻。再把蓝藻转移到灭过菌的覆盖有塑料膜的150 X 15_大培养皿中，平铺厚度不超过 Icm,并且使其均匀散开，置于40°C的烘箱中干燥，大概12h后水华鱼腥藻将会自动与薄膜剥离，非常容易收获。
显微计数在培养第三天，取样进行显微计数，经计算得知，细胞总数为5.83X105个/mL，厚壁孢子数为I. 15 X IO5个/mL，占细胞总数的19. 73%。
以上实施例不是对本发明的限制，具体实施时可以在权利要求
限定的范围内按一定比例配制大体积的培养液，如IOOmL培养液中加9mg葡萄糖或鹿糖,加O. 03g水华干藻粉；转移水华时可以用灭过菌的覆盖有塑料膜的大瓷盘。如图2-图4所示，为在不同pH、不同培养液、不同保存温度诱导条件下，水华鱼腥藻厚壁孢子在连续培养7天的含量比较。
权利要求
1.一种水华鱼腥藻厚壁孢子的诱导方法，其特征在于，使用含有磷酸氢二钾、柠檬酸铁、钥酸和碳酸钙的液体培养基在添加蔗糖或葡萄糖80-100mg/L的基础上，pH调到6_7的环境下培养水华鱼腥藻3-4天，实现厚壁孢子的诱导； 所述的水华鱼腥藻是指将含水量10%的水华鱼腥藻干藻粉密闭保存于4°C的冰箱中两周后取出，转移到加有培养液的小烧杯中并用打藻机打碎； 所述的培养液的组分为75g/L磷酸氢二钾、10g/L柠檬酸铁、10g/L钥酸、100g/L碳酸钙，余量为50g/L 土壤浸提液； 所述的在pH调到6-7的环境下培养是指通过添加氢氧化钠和盐酸，将pH调为6-7的环境下定时开盖搅拌培养。
2.根据权利要求
I所述的水华鱼腥藻厚壁孢子的诱导方法，其特征是，所述的定时是指每天在同一个时间段搅拌一次。
3.根据权利要求
I所述的水华鱼腥藻厚壁孢子的诱导方法，其特征是，所述的搅拌是指借助灭过菌的三角棒或玻璃棒或移液枪把细胞打散打匀。
4.一种根据上述任一权利要求
所述方法制备得到水华鱼腥藻厚壁孢子的干藻粉的制备方法，其特征在于，通过将所述水华鱼腥藻厚壁孢子平铺瓷盘中，置于35-40°C的烘箱烘干或30°C的无菌室中干燥3-5天得到干藻粉；所述的瓷盘是指覆盖有塑料膜的白色的瓷盘。
5.根据权利要求
4所述的干藻粉的制备方法，其特征是，所述的平铺是指采用厚度不超过Icm的高度平铺在瓷盘底部且使其均匀散开。
专利摘要
一种生物技术领域：
的水华鱼腥藻厚壁孢子的诱导方法，使用含有磷酸氢二钾、柠檬酸铁、钼酸和碳酸钙的液体培养基在添加土壤提取液、蔗糖或葡萄糖的基础上，在pH调到6-7的环境下培养水华鱼腥藻3-4天，实现厚壁孢子的诱导。再将所述的水华鱼腥藻平铺于瓷盘或150×15mm的大培养皿中，置于35-40℃的烘箱烘干或30℃的无菌室中干燥3-5天得到干藻粉。本发明有效的理化条件大量提高了厚壁孢子的含量；简易的干燥方式可以更加高效的收获干藻粉；以水华蓝藻为原料制备干藻粉的方法涉及的工艺简单；肥料施用安全高效，易于推广实施；实施后不会对环境、食品安全造成新的污染；所以本发明具有极大的理论价值和应用价值。
文档编号C12N3/00GKCN102242078 B发布类型授权 专利申请号CN 201110046706
公开日2013年1月9日 申请日期2011年2月25日
发明者沈健英, 万旗东, 郑培忠, 陈瑞 申请人:上海交通大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (4),