捕食线虫性真菌生物冻干制剂的制备方法
【专利摘要】本发明属于微生物学领域，提出一种捕食线虫性真菌生物冻干制剂的制备方法，即首先将实验室分离保存的捕食线虫性真菌Duddingtonia?flagrans?CIM1菌株在大麦粒培养基上进行厚壁孢子批量培养，然后用冻干保护剂洗脱并保护厚壁孢子，再进行分装灭菌、预冻、真空冷冻干燥后获得。本发明成功制备了具有捕食线虫功能的捕食线虫性真菌—Duddingtonia?flagrans生物冻干制剂，实验结果表明该冻干制剂既可以保持菌株活性，又可以在常温下运输和保存，且使用方便，具有很好的应用开发前景。
【专利说明】捕食线虫性真菌生物冻干制剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物学领域，具体涉及一种捕食线虫的真菌、由该真菌获得的制剂。【背景技术】
[0002]动物寄生虫病是家畜的一大类严重疾病，给畜牧业造成严重危害。长期以来，对家畜寄生性线虫的防治主要依靠化学药物，并发挥了巨大的作用。但是随着化学驱虫药产生的抗药性、药物残留及环境污染等问题日益严重，已经引起人们的广泛认识，因此利用捕食线虫性真菌对线虫的生物拮抗作用来防治动物寄生线虫已备受关注。
[0003]捕食线虫性真菌是由孢子萌发生长出营养菌丝，然后形成捕食器官进而捕食线虫，并通过内寄生方式消解线虫和产生毒素毒杀线虫等方式获得生存的一类微生物。正是因为此类真菌的这个特点，所以在寄生性线虫防治方面，捕食线虫性真菌是一个国家极其重要的宝贵生物资源。因为捕食线虫性真菌在培养基中，菌种仍继续发育生长，这样就会不断消耗其自身营养，使得其捕食性能下降，而且在此过程中极易发生污染。所以目前在捕食线虫性真菌临床应用中所面临的重要问题是如何制备一种能应用于生产实际的捕食线虫性真菌生物制剂。
【发明内容】
[0004]针对本领域存在的问题，本发明的目的是提出一种捕食线虫性真菌冻干制剂的制备方法。
[0005]本发明的另一目的是提出含有捕食线虫性真菌菌株厚壁孢子的真菌生物冻干制剂。
[0006]实现本发明目的的技术方案为:
[0007]一种捕食线虫性真菌生物冻干制剂的制备方法，其特征在于，是将捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans CIMl菌株在大麦粒培养基上进行厚壁孢子的批量培养，然后用冻干保护剂洗脱并保护厚壁孢子，再分装灭菌、预冻、真空冷冻干燥后获得。
[0008]本发明提出的制备方法,可以制备含有任一种捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)菌株的冻干制剂。优选的，使用如下菌株:
[0009]一种捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)菌株,该菌株(菌株名称为CIM1)的保藏号为=CGMCC N0.9201，保藏日期:2014年5月5日。
[0010]所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，电话:
(010)64807355。
[0011]所述捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)系发明人从内蒙古土壤中分离筛选后经纯化得到的。该菌株(菌株名称为CIM1)具有如下特性:Duddingtonia flagrans菌株生长温度范围为在15~35°C间均能生长，其中以35°C环境下生长率最高。Duddingtoniaflagrans菌丝呈放射状地向周围生长，纵横交错，清晰可见，主干较粗，分支较细；菌丝无色分隔。外观白色至灰粉红色，生长后期有缠绕圈的形成，并可发现少数厚壁孢子着生于菌丝细胞之间。参见图1。
[0012]其中，所述大麦粒培养基的制备方法为:将大麦粒清洗干净，置干燥箱中烘干，按照大麦粒质量和蒸馏水体积1:1的比例加入蒸馏水，并将装有蒸馏水和大麦粒的容器于120~125°C灭菌20min后即得。所述的大麦粒是完整的大麦粒，或破碎的、部分破碎的大麦粒均可。
[0013]所述的Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子批量培养可采用本领域公知的手段进行培养。优选的，Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子批量培养的条件为20~30°C,每天摇动1-3次，培养20~25天。
[0014]批量培养过程中，用手摇动即可，以防培养基板结。
[0015]其中，所述冻干保护剂由体积份的蒸馏水1000份和吐温-802份组成。
[0016]其中，所述预冻是在_80°C下预冻2小时。
[0017]所述真空冷冻干燥可采用常规的冷冻干燥方法进行。优选的，所述真空冷冻干燥的条件为:压强 130X KT3Hibar ~135X l(T3mbar，在 _48°C至 _55°C下，冻干 18_25h。优选冻干20h。
[0018]本发明所述的制备方法制备得到的捕食线虫性真菌生物冻干制剂。
[0019]本发明的有益效果在于:
[0020]本发明提出的捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans菌株的菌丝受线虫幼虫螺动刺激后，形成捕食器，对幼虫进行捕捉，随后菌丝侵入虫体内部，开始对线虫进行消解和吸收，最后导致线虫死亡。
[0021]本发明成功制备了具有捕食线虫功能的真菌生物冻干制剂一捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans生物冻干制剂,实验结果表明该冻干制剂既可以保持菌株活性,又可以在常温下运输和保存，且使用方便，具有很好的应用开发前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本发明Duddingtonia flagrans菌株生长情况显微照片。
[0023]图2为本发明真菌生物冻干制剂的产品照片。
【具体实施方式】
[0024]现以以下实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中使用的手段，如无特别说明，均使用本领域常规的手段。
[0025]冻干机,美国Thermo公司产品。
[0026]冻干保护剂:蒸馏水1000mL和吐温_802mL。
[0027]实施例1:Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子的批量培养
[0028](I)大麦粒培养基的制备:将完整大麦粒清洗干净，置干燥箱中烘干，分装于250mL三角瓶中，每瓶70g，各加蒸馏水70mL。将装有蒸馏水和大麦粒的三角瓶于121°C灭菌 20min。
[0029] (2)接种培养基:在无菌条件下，将实验室分离保存的捕食线虫性真菌-Duddingtonia flagrans CIMl菌株,制备成混悬液,接种于上述制备好的培养基中，并用灭菌玻璃棒搅拌，使混悬液均匀分布于培养基中，置25°C恒温箱中培养,每天摇晃培养基三次以防板结。
[0030](3)用冻干保护剂洗脱并保护厚壁孢子:在厚壁孢子培养至第3周时，在无菌条件下取3g培养基，用冻干保护剂(蒸馏水1000份和吐温-802份配成)进行厚壁孢子的洗脱，收集孢子洗脱液混匀后，用白细胞计数板计数，得出培养基所含厚壁孢子数量为3.2X105个/g。
[0031]实施例2.Dudding tonia flagrans菌株冻干制剂的制备
[0032]用实施例1获得的厚壁孢子进行制备。
[0033](I)准备冻干安瓿瓶:选用7mL冻干安瓿瓶20个，用10% HCl浸泡8~10h，再用自来水冲洗数次，最后用蒸馏水浸泡至PH中性，干燥后贴上标签，标上菌号及时间，和冻干安瓿瓶盖一起于121°C高压灭菌20min后备用。
[0034](2)对实施例1获得的含有厚壁孢子的洗脱液进行离心浓缩，转速4000r/min，离心 20min。
[0035](3)分装灭菌:用移液器直接将离心好的厚壁孢子混悬液滴入冻干安瓿瓶底部，注意不要溅污上部瓶壁，每瓶分装量为2mL，分装时间尽量要短。分装时应注意在无菌条件下操作。
[0036](4)预冻:将冻干安瓿瓶置于_80°C冰箱中预冻2h。
[0037](5)真空冷冻干燥:完成预冻后，开动冻干机，打开“FRIGE”开关，此时温度显示屏为红灯，等待红灯逐渐上升变为绿色，此时温度为_50°C左右。将冻干玻璃瓶盖拔开一些，放入冻干箱内并确保冻干箱的密闭性。打开“PUMP”开关以及真空泵的阀门，等待气压显示屏指示灯变为绿色，此时压强为133X10_3mbar。冻干20h，待样品变为干燥粉末状时，关闭真空泵阀门，“FRIGE”，“PUMP”开关即可取出。将冻干玻璃瓶盖立即盖紧，置_20°C冰箱保存。
[0038]产品照片见图2。成品Duddingtonia flagrans生物冻干制剂保存在冻干安瓿瓶内，为黄色疏松多孔的海绵状物质，瓶内为真空状态，平均每瓶的Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子数量为1.5 X IO6个。
[0039]实施例3:Duddingtonia flagrans菌株冻干制剂的复苏效果观察
[0040]实验组:实施例1制备的Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子冻干制剂。
[0041]对照组:自然状态下未经冻干的Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子。
[0042]空白对照组:等量无菌注射用水。
[0043](I)萌发率实验
[0044]0.4g/L玉米粉琼脂培养基(CMA)制备:取新鲜玉米粉40g，加蒸馏水1000mL,微火煮沸lh，补足水分至1000mL，450目纱网过滤。取滤液10mL，加蒸馏水990mL，调节PH值为6.0~6.2，再加20g琼脂粉，经121 °C高压灭菌20min后，倾注于灭菌的培养皿中，4°C放置备用。
[0045]实验方法:在无菌条件下，用无菌注射用水稀释冻干后的Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子，吸取20个厚壁孢子接种到直径为60mm的CMA固体培养基平皿中，共接种3个，作为实验组；将同一批培养洗脱的未冻干的厚壁孢子，以同样的方法接种另外3个培养基，作为对照组；同时设只加无菌注射用水的空白对照组。然后放于25°C恒温培养箱中，每天定时观察并记录各组孢子的平均萌发个数，计算萌发率。结果见表1。[0046]表1Duddingtonia flagrans菌株冻干制剂萌发率的观察结果
[0047]
【权利要求】
1.一种捕食线虫性真菌生物冻干制剂的制备方法，其特征在于，将捕食线虫性真菌Duddingtonia f Iagrans菌株进行厚壁孢子(厚垣孢子)批量培养，然后用冻干保护剂洗脱并保护厚壁孢子，再分装灭菌、预冻、真空冷冻干燥后获得。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于所述DuddingtoniafIagrans菌株的保藏号为:CGMCCN0.9201。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大麦粒培养基的制备方法为:将大麦粒清洗干净，置干燥箱中烘干，按照大麦粒质量和蒸馏水体积1:1的比例加入蒸馏水，将装有蒸馏水和大麦粒的容器于120~125°C灭菌20min后即可获得。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，DuddingtoniafIagrans菌株厚壁孢子批量培养的条件为:20~30°C温度下，每天摇动1-3次，培养20~25天。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂由体积份的蒸馏水1000份和吐温-802份组成。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述预冻是在_80°C下预冻2小时。
7.根据权利要求1-6任一所述的制备方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥的条件为:压强 130 X KT3Hibar ~135 X l(T3mbar，在 _48°C至 _55°C下，冻干 18_25h。
8.权利要求1-7 任一所述的制备方法制备得到的捕食线虫性真菌生物冻干制剂。
【文档编号】A01P5/00GK104004663SQ201410227501
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】杨晓野, 王瑞, 杨莲茹, 张伟 申请人:内蒙古农业大学